混合型豆豉发酵工艺优化及活性成分分析硕士论文.pdf

分类号：密 级：TS201.3 秘密 单位代码：学 号：10152 2004170 大 连 轻 工 业 学 院 硕 士 学 位 论 文 硕 士 学 位 论 文 中文题目：混合型豆豉发酵过程中活性成分与风味物质变化的研究 英文题目：Studies on the changes of active component and flavor substance in Multi-Strain Fermentive Douchi 系 （院、 所） ： 生物与食品工程学院 学科、 专业： 食品科学 研 究 生 ： 孙成行 指导教师： 牟光庆 教授 2007 年 3 月 关于硕士学位论文使用授权的说明关于硕士学位论文使用授权的说明 论文题目：论文题目： 本学位论文作者完全了解大连轻工业学院有关保留、使用学位论文的规定，大连轻工业学院有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文，并且本人电子文档的内容和纸质论文的内容相一致。 保密的学位论文在解密后也遵守此规定。 是否保密（ ） ，保密期至 年 月 日为止。 学生签名： 导师签名： 年 月 日 摘 要 摘 要 本文对发酵豆豉的原料进行了初步筛选， 并对本实验室筛选的产 -葡萄糖苷酶活性较高的霉菌进行了鉴定。 对枯草芽孢杆菌和霉菌单独和混合发酵豆豉的工艺条件进行了优化。对豆豉在发酵过程中微生物、酶活、活性成分与风味成分的变化进行了研究，为开发我国传统食品以及研究豆豉发酵机理奠定了基础。 通过凯氏定氮法和高效液相色谱法分别检测6种不同品种大豆的蛋白质和异黄酮含量，选择蛋白质含量 41.09%、黄豆苷 1.037 mg/g，染料木苷 0.850 mg/g 的新绥农 14 作为发酵豆豉的原料。 通过对菌落和菌丝形态的观察，根据真菌鉴定手册，确定本实验室筛选的产 -葡萄糖苷酶活性较高的霉菌为黄-米曲霉。 采用正交试验分别对枯草芽孢杆菌和黄-米曲霉发酵豆豉进行工艺条件的优化，确定枯草芽孢杆菌发酵豆豉的制曲优化条件为 37，48h，接菌量为 1%，豆豉纤溶酶活性 2.34cm（520.40IU/g）。黄-米曲霉发酵豆豉的制曲优化条件为 35，48h，接菌量为4%，-葡萄糖苷酶活性 0.174（31.8IU/100g）。双菌种混合制豆豉曲的优化条件为 36，48h，最优接菌方式为同时接入枯草芽孢杆菌和黄-米曲霉。以氨基氮为指标，确定双菌种混合发酵豆豉的最佳后酵条件为 35，15d。 在上述三种制豆豉曲工艺条件下进行发酵，枯草芽孢杆菌和黄-米曲霉的微生物量均在 48h达到最大，豆豉纤溶酶与-葡萄糖苷酶的活性也达到最大，分别为 2.45cm，0.178；2.35cm，0.268。混合菌种制曲 48h时pH值达到最大，为 7.5；水分含量从 12h的58.7%降到 72h的 30.2%；还原糖含量在发酵 24h达到峰值OD550 1.523，即 18.638mg/g；在混合菌种制曲 48h时，黄豆苷的转化率为 83.90%，染料木苷 55.41%；后酵 15d，纤溶酶相对活性为 2.32cm(500.48IU/g)，黄豆苷的转化率为 86.31%，染料木苷 74.71%；氨基氮含量随着发酵时间的增加逐渐增大，在 72h达到 40%。 关键词： 豆豉，混合发酵，豆豉纤溶酶，-葡萄糖苷酶，活性成分，风味物质 IAbstract Abstract The suitable soybean for producing Douchi was selected in this paper, and the mold from lab was identified, which can produce higher -glucosidase enzyme activity. This paper studied the craft of Bacillus subtilis and mold fermentation Douchi respectively, at the same time studied the craft of mixed culture fermentation Douchi. The changes of micro-organism, enzyme activity, active component and flavor component in fermentation of Douchi were studied. This will establish foundation to develop the traditional soybean food and study the mechanism of Douchi fermentation. The protein and isoflavone content of six kinds of soybean were detected by Kjeldah method and high efficiency liquid chromatography. The New SuiNong14 was selected eventually as the suitable soybean feed, whose protein content is 41.09%, Daidzin content is 1.037mg/g, Genistin content is 0.850mg/g. On the basis of studying the mold colonial morphology and hypha morphological, the mold, which can produce higher -glucosidase enzyme activity was identified as A.flavus-ory- Zae by the mycetes appraisement handbook. The paper optimized the craft of Bacillus subtilis and mold fermentation Douchi by orthogonal experiment method. The optimum craft condition of Bacillus subtilis fermentation is 37, 48h, the vaccination of quantity 1%, the thrombolytic enzyme activity 2.34cm(520.40IU/g); The optimum craft condition of mold fermentation is 35, 48h, the vaccination of quantity 4%, the enzyme activity of -glucosidase 0.174(31.8IU/100g). The optimum craft condition of the mixed strains fermentation is 36, 48h. The optimum method is that two kinds of strains are added at the same time. According to the amino nitrogen content, it was sure that the optimum craft condition of the last fermentation is 35, 15 days. On the course of fermentation of 3 kinds of the optimum Douchi fermentation craft, the amount of Bacillus subtilis and A.flavus-oryZae reach the highest on the 48h, and the enzyme activities of thrombolytic and -glucosidase had been the highest also, they were 2.45cm, 0.178; 2.35cm, 0.268 respectively. The pH value of mixed strains fermentation Douchi reached the highest 7.5 on the 48h; moisture content droped 30.2% of 72th from 58.7% of 12h; the reducing sugar content reached the highest OD550 1.523 (18.638mg/g)on the 24h; Daidzin IIAbstract transformation efficiency is 83.90%, Genistin transformation efficiency is 55.41% on the 48h; After the last fermentation of 15 day, the thrombolytic enzyme was 2.32cm（500.4 8IU/g), Daidzin transformation efficiency reached 86.31%, Genistin transformaion efficiency reached 74.71%; Amino nitrogen content increase gradually, and reach the highest 40% on the 72h. Key words: Douchi, mixed culture fermentation,-glucosidase,active component flavor substance III目 录 目 录 第一章 文献综述1 1.1 研究目的和意义1 1.1.1 提高我国大豆消费量的需求1 1.1.2 弘扬我国传统大豆食品的需求2 1.1.3 研究霉菌和细菌混合发酵豆豉的意义2 1.1.4 研究豆豉发酵过程中风味物质变化的意义3 1.2 国内外研究现状3 1.2.1 国内外豆豉生产工艺的研究现状3 1.2.1.1 米曲霉型豆豉3 1.2.1.2 毛霉型豆豉3 1.2.1.3 细菌型豆豉4 1.2.1.4 少孢根霉型豆豉4 1.2.2 豆豉几种活性成分的研究现状4 1.2.2.1 大豆异黄酮5 1.2.2.2 大豆低聚糖5 1.2.2.3 大豆蛋白6 1.2.2.4 豆豉纤溶酶6 1.2.2.5 褐色色素7 1.2.2.6 其它生理活性成分8 1.2.3 大豆发酵食品风味物质的研究现状8 IV目 录 1.2.3.1 风味物质的提取方法8 1.2.3.2 风味物质化学成分的鉴定8 1.2.3.3 风味物质的形成9 1.3 存在的问题10 第二章 材料与方法12 2.1 实验材料12 2.1.1 菌株12 2.1.2 培养基12 2.1.3 药品与试剂12 2.1.4 仪器与设备14 2.2 实验方法14 2.2.1 大豆原料的选取14 2.2.2 菌种微生物的研究15 2.2.2.1 枯草芽孢杆菌生长曲线的确定15 2.2.2.2 霉菌的鉴定15 2.2.2.3 107孢子悬浮液的制备15 2.2.3 双菌种混合制豆豉曲生产工艺的研究16 2.2.3.1 原料预处理16 2.2.3.2 枯草芽孢杆菌制豆豉曲生产工艺的研究16 2.2.3.3 曲霉菌制豆豉曲生产工艺的研究17 2.2.3.4 混合菌种制曲接菌方式的研究18 2.2.3.5 后酵工艺条件的确定18 2.2.4 豆豉发酵过程中酶活与微生物量的变化19 V目 录 2.2.4.1 样品处理19 2.2.4.2 微生物计数19 2.2.4.3 酶活测定19 2.2.5 豆豉发酵过程中成分的变化19 2.2.5.1 豆豉制曲发酵过程中 pH 的变化19 2.2.5.2 豆豉制曲发酵过程中水分含量的变化20 2.2.5.3 豆豉制曲发酵过程中还原糖含量的变化20 2.2.5.4 豆豉发酵过程中异黄酮含量的变化20 2.2.5.5 豆豉发酵过程中风味物质的变化20 2.3 测定方法20 2.3.1 蛋白质含量的测定20 2.3.2 异黄酮含量的测定21 2.3.3 氨基氮含量的测定21 2.3.4 纤溶酶酶活的测定方法22 2.3.4.1 尿激酶标准曲线的建立22 2.3.4.2 纤维蛋白平板的制备22 2.3.4.3 制备酶液22 2.3.4.4 测定纤溶酶活性22 2.3.5 -葡萄糖苷酶相对活性的测定23 2.3.5.1 水杨苷底物的制备23 2.3.5.2 粗酶液制备23 2.3.5.3 酶活测定23 2.3.5.4 标准曲线的测定23 VI目 录 2.3.5.5 酶活单位23 2.3.5.6 DNS 试剂的配制23 第三章 结果与讨论25 3.1 大豆原料的选取25 3.2 菌种微生物的研究27 3.2.1 枯草芽孢杆菌生长曲线的测定27 3.2.2 霉菌的鉴定27 3.2.3 107孢子悬浮液的制备29 3.3 双菌种混合制豆豉曲生产工艺的研究29 3.3.1 枯草芽孢杆菌制豆豉曲生产工艺的研究29 3.3.1.1 发酵时间对豆豉纤溶酶活性影响的研究29 3.3.1.2 发酵温度对豆豉纤溶酶活性影响的研究30 3.3.1.3 接菌量对豆豉纤溶酶活性影响的研究31 3.3.1.4 最适工艺条件的确定33 3.3.2 曲霉菌制豆豉曲生产工艺的研究33 3.3.2.1 发酵时间对-葡萄糖苷酶活性影响的研究33 3.3.2.2 发酵温度对-葡萄糖苷酶活性影响的研究34 3.3.2.3 发酵时间对-葡萄糖苷酶活性影响的研究35 3.3.2.4 最适工艺条件的确定36 3.3.3 混合菌种制曲条件的研究37 3.3.3.1 混合菌种制曲接菌方式的研究37 3.3.3.2 混合菌种制曲条件的确定38 3.3.4 后酵工艺条件的确定38 VII目 录 3.3.5 豆豉发酵过程中酶活性与微生物量的变化39 3.3.6 豆豉发酵过程中活性成分与风味物质的变化40 3.3.6.1 豆豉制曲发酵过程中 pH 值的变化40 3.3.6.2 豆豉制曲发酵过程中水分含量的变化40 3.3.6.3 豆豉制曲发酵过程中还原糖含量的变化42 3.3.6.4 豆豉发酵过程中异黄酮含量的变化42 3.3.6.5 豆豉发酵过程中风味物质的变化44 第四章 结论45 参考文献46 附录50 致谢54 第一章 文献综述 1.1 研究目的和意义 1.1.1 提高我国大豆消费量的需求 我国是大豆的故乡， 几千年来， 大豆为中华民族的繁衍生息做出了不可磨灭的贡献，而大豆食品更是我国传统食品的重要组成部分。1995 年，中国大豆产量 1350 万吨，进口 80 万吨，基本自给；1996 年，中国大豆产量 1322 万吨，进口 220 万吨，大规模进口初次突破百万吨；2000 年中国大豆年进口量首次突破 1000 万吨，成为世界上最大的大豆进口国。2003 年，中国大豆产量 1640 万吨，进口 2074 万吨，国外进口超过国内总产量；2005 年，中国大豆产量 1830 万吨，进口 2659 万吨，国外进口为国内产量的 1.45 VIII第二章 材料与方法 倍，总产量达到 4489 万吨，居于世界前列1。分析我国大豆进出口比例和总产量不断变化的原因，主要有以下几方面： 1、价格方面2。自 1995 年以来，虽然大豆收购价格略有增加，但种植大豆的收益仍低于小麦和玉米等，从而造成国内大豆产量增长缓慢。 2、生产应用方面3。由于国外大豆品种油脂含量高，蛋白质含量低，这比较适应我国大豆消费以油脂为主的特点，从而造成大豆进口量不断大幅增加。 3、技术方面。我国大豆的生产还没有形成像国外那样的完全工业化生产，这就造成了我国大豆在生产技术、 大豆产量、 产品贮藏等方面的不足， 造成了竞争能力的下降。 4、宣传方面4。宣传力度不够，使得消费者对我国大豆食品高蛋白这一优越性认识不足，没有形成对大豆食品的新的消费需求。 我国大豆蛋白质含量高，且大豆蛋白是消化率和氨基酸评分最高的蛋白之一，根据WHO的蛋白质评价指标，被评为最优级5。将我国大豆用于油脂工业不仅不能发挥其优势，反而是对优良大豆蛋白资源的浪费。因此我国大豆食品的发展方向应该以生产传统大豆食品、高蛋白食品以及研发出一些大豆新产品为主，从而消除国产大豆油脂含量低的这一竞争劣势，发挥国产大豆蛋白质含量高的这一优势，带动国产大豆的良性发展，继而发扬我国传统大豆食品，一举两得。 1.1.2 弘扬我国传统大豆食品的需求 我国传统大豆食品可分为发酵豆制品与非发酵豆制品，非发酵豆制品包括豆浆、豆腐、腐竹及其加工而成的各类豆制品；发酵豆制品包括腐乳、豆豉、豆酱、酱油等。发酵豆制品的生产均需经过几个微生物发酵过程， 在此过程中发生了一系列复杂的生化过程，使其制品具有特定的形态、风味与营养。 豆腐、腐乳、豆豉等均是利用全脂天然大豆加工而成，具有营养丰富、易于消化吸收等优点，在我国有悠久的生产历史，已成为我国饮食文化的重要组成部分，具有较好的消费基础6。尤其是发酵大豆制品，不仅保持了大豆食品的营养，还丰富了产品的风味，延长了产品的货架寿命，使产品能够更好的流通，且在发酵过程中会生成一些新的功能性物质，有利于消费者的健康。同时传统大豆制品的生产还具有工艺简单，设备投资小等优势。 综上所述，传统大豆制品具有营养利用充分、口味丰富、符合我国饮食文化、工艺简单、设备投资小等优点，具有较大的发展空间。 12第二章 材料与方法 1.1.3 研究霉菌和细菌混合发酵豆豉的意义 传统大豆发酵食品，因其特有的风味而倍受消费者青睐。豆豉与豆酱、酱油、腐乳并列为我国四大传统大豆发酵制品，其中腐乳、酱油的生产已基本实现工业化，而豆豉的研究却相对较少，当前的生产模式也是以作坊式为主7。 豆豉是我国具有民族特色的传统大豆发酵制品，一直以其营养丰富、风味独特在世界饮食文化之林中具有特殊的地位。我国主要生产毛霉型、曲霉型豆豉及少量细菌型豆豉（俗称水豆豉）。国外以天培 Tempe（印度尼西亚根霉型豆豉）和纳豆 Natto（日本细菌型豆豉）著名。然而当前我国豆豉多为传统的自然发酵产品，难以适应现代消费者对食品卫生等方面的要求， 因此急需实现工业化生产， 以提高生产水平， 稳定产品品质，这就需要我国科技工作者对豆豉的发酵机理、 豆豉发酵过程中新陈代谢的规律以及豆豉发酵过程中的生理活性成分进行深入的研究。我们可以借鉴日本纳豆的成功开发模式，对我国的豆豉进行开发。此外，豆豉按优势发酵菌群的不同，可分为霉菌型（毛霉型、曲霉型、根霉型）和细菌型豆豉产品，大部分都为自然发酵的产品。因此，豆豉的发酵菌种非常复杂， 这给豆豉产品的安全性带来了很大的隐患， 也不利于豆豉生产的工业化。为增强我国豆豉的安全性和丰富我国豆豉的种类及提高其功能性， 本实验对混合菌种发酵豆豉新产品进行了研究。 1.1.4 研究豆豉发酵过程中风味物质变化的意义 营养、感觉、健康、安全和卫生是 21 世纪食品追求的五大功能，而色、香、味、形及质地则是构成食品感觉功能的五大要素。风味指食品基质作用于人体味觉、嗅觉以及热觉和触觉在内的全部感官属性， 在很大程度上直接决定食品的质量和消费者的可接受度。就食品香味而言，挥发性组分起着最重要的作用，但这些香味化合物除少部分天然存在于动植物原料外，大部分则在加工贮运过程中经不同代谢途径而产生8。因此，分析检测食品原料及产品中的挥发性化合物，可提供有关微生物学、酶学、化学以及热处理等方面的重要信息。尤其近年来9，随着HS-SPME（顶空固相微萃取）、GC-MS（气质联用）等现代分析技术的发展，食品挥发性化合物的快速检测已成为HACCP（危害分析与关键控制点）、TQM（全面质量管理）等现代食品品质控制体系的一种重要手段。 13第二章 材料与方法 1.2 国内外研究现状 1.2.1 国内外豆豉生产工艺的研究现状 1.2.1.1 米曲霉型豆豉 传统豆豉一般不添加种曲， 历来都是利用适宜的气温和湿度促使有益的豆豉霉菌大量生长繁殖。如广东阳江豆豉、湖南浏阳豆豉都是其中的典型代表10，11。天然制曲受季节气温的限制，不能常年生产，周期较长，需 67d才能出曲。为了提高豆豉产品的安全、 质量、 风味以及缩短制曲时间， 开始采用菌种的选用。 如福建省福安酱厂以沪酿 3.042为出发菌株12，诱变筛选出一株蛋白酶活力较弱但风味好的新菌株米曲霉 3.798 用于豆豉制曲，产品颗粒松散完整、酩香浓郁、滋味鲜美。林影13等人通过菌种选育，得到低酪氨酸羧肽酶活力的菌株，从而减少在豆豉发酵中白点的生成。 米曲霉型豆豉纯种发酵的工艺流程14如下： 大豆精选浸泡蒸煮冷却接种制曲拌盐发酵干燥成品 1.2.1.2 毛霉型豆豉 毛霉型豆豉以重庆永川豆豉、四川渔川豆豉、四川三台豆豉最为有名15。李幼筠16，17等人（1982）对选育出中温型（2327）M.R.C-1 毛霉菌种，并研究了生产工艺，其工艺采用M.R.C-1 菌株纯种制曲，制曲周期由传统的 1520d缩短到 34d。并添加一定蛋白酶液、乳酸菌、酵母菌进行多菌种强化发酵，发酵周期由传统的 12 个月缩短到 4 个月，并保持了四川毛霉型豆豉的传统风味。该研究实现了豆豉纯种制曲，但豆豉的生产周期并没有明显改善。 毛霉型豆豉纯种发酵的工艺流程如下： 大豆浸泡蒸煮摊凉接种制曲强化发酵后发酵检验包装成品 1.2.1.3 细菌型豆豉 国内主要生产水豆豉，李祥18等对其工艺进行了初步探讨，发现参与细菌性豆豉制曲发酵的主要有解淀粉芽孢杆菌、 枯草芽孢杆菌、 乳酸菌及微球菌， 有关研究还未深入。国外对日本纳豆研究较深入，在 50 年代以前纳豆主要采用自然发酵，60 年代以后改为纯种制曲，由纳豆菌（Bacillus natto）接种蒸煮大豆在适当温度，湿度下发酵得到的。国内董明盛19等人从我国豆酱、 豆豉以及日本纳豆食品中分离和筛选具有纤溶活性的芽 14第二章 材料与方法 孢菌，并用该菌开发出既有溶血栓活性，又保留日本纳豆典型风格的保健食品新品种。 纳豆纯种发酵的工艺流程20，21如下所示： 大豆浸泡蒸煮接种发酵（40，95%湿度） 后熟（5，24h） 国外对生产纳豆的大豆品种选育也有深入研究，目前加拿大有AC Colombe及AC Pinson两种大豆新品种，专门用于纳豆生产；在美国也开发研制出一种珍珠大豆（Pearl- Soybean），专供纳豆生产22，23，24。 1.2.1.4 少孢根霉型豆豉 丹贝 （Tempe） 起源于印度尼西亚， 是印尼民间非常流行的大豆固体发酵食品。 1895年Prinsen geerlig首次进行丹贝真菌鉴定研究25，26，直到本世纪六十年代，东南亚各国及美国、日本科学家才对丹贝进行全面研究27，28，29。我国丹贝研究起步较迟，由南京农业大学江汉湖主持的丹贝研究被列入农业部“八五”重点课题内容之一，目前丹贝已开发成功30，31，其生产工艺流程如下： 精选大豆浸泡脱皮水煮 30min沥干、摊凉酸化处理接种曲塑料桶或袋培养丹贝 1.2.2 豆豉几种活性成分的研究现状 豆豉在发酵过程中，在微生物及酶的作用下，对大豆原料中的大分子有机物分解和重组，同时经过复杂的生化作用，形成的代谢产物和变异物质，是豆豉中活性物质的主要来源，这些活性物质各自或协同作用，构成了大豆发酵食品独特的生理功能，如抗变异原、抗癌、溶解血栓、抗氧化、降血压和抗菌等。这就是发酵大豆食品比不发酵的大豆食品生物活性更强的实质所在32。 1.2.2.1 大豆异黄酮 大豆异黄酮 （Isoflavones of soybean） 是目前大豆及其发酵制品中最引人注目的一种功能性成分，属于酚类化合物，对动物和人具有有效的生物效应33，34。具有抗癌、抗氧化、改善妇女更年期症状等功能35，大豆中天然存在的大豆异黄酮总共有 12 种，可以分为 3 类，即黄豆苷类（Daidzingroups）、染料木苷类（Genistingroups）、黄豆黄素苷类（Glycitingroups）。每类以游离型、葡萄糖苷型、乙酰基葡萄糖苷型、丙二酰基葡萄糖苷型等 4 种形式存在36。其中结合型的糖苷约占总量的 95%； 而游离型的苷元以染料木黄酮（Genistein）、黄豆苷元（Daidzein）和黄豆黄素（Glycitein）为主37，38，三者 15第二章 材料与方法 之比为 1.3：1：0.2，其含量仅占总量的 2%3%。但是H.Wei39等认为大豆异黄酮各组分中能够产生生理活性的是游离甙元，而不是结合糖甙，因此，游离甙元（主要是Gen和Den）是大豆异黄酮的主要活性组分，但是Gen和Den的活性哪个更强，目前还存在一定的争议。孙克杰40等研究表明，Gen抗氧化能力较强，是良好的自由基清除剂，而Den在机体中有良好的抗溶血作用，两者均具有良好的生理活性，但作用效果不同。 大豆异黄酮在豆豉发酵过程中经微生物作用，会产生一定的变化。如以大豆为原料的发酵食品丹贝41，经少孢根霉分泌-葡萄糖苷酶发酵后，异黄酮糖苷解离为苷元，即异黄酮的存在形式从配糖体形式向配基形式转换，即转化为苷元形式。宋永生42认为豆豉发酵过程中基本上不改变大豆异黄酮的总含量，但是糖苷型大豆异黄酮在-葡萄糖苷酶的作用下大部分转化为游离型大豆异黄酮，可使游离型大豆异黄酮的含量从2.36%提高至96.80%。吴小刚等43从22种食品工业用酵母、霉菌等和豆豉分离菌中筛选出能将大豆异黄酮转化为其苷元的菌株。结果确定了一株产-葡萄糖苷酶较高的菌株，经鉴定，该菌为黄-米曲霉。所以，我们完全可以利用一些霉菌产-葡萄糖苷酶这一特性，对豆豉的生产工艺进行优化，从而生产出具有较高保健价值的豆豉产品。 1.2.2.2 大豆低聚糖 大豆中天然存在的低聚糖有棉子糖、水苏糖、蔗糖等，其生理功能在于其独有的双歧杆菌增殖特性， 使肠道内有益菌如双歧杆菌增加，有害菌减少，从而改善人体的各项生理功能44，同时又具有低热值、耐酸和耐热等特点。但是，还有研究表明，占大豆低聚糖绝大部分的棉子糖和水苏糖是引起胃气胀的主要原因45。 因为在单胃动物和人的消化道里没有水解-1，6 半乳糖基链的-半乳糖苷酶46，所以完整的低聚糖不能被吸收，这两种低聚糖在大肠内积累，被厌氧微生物发酵而产生胃胀气。 豆豉在发酵过程中，低聚糖发生了很大的变化。发酵过程中低聚糖的形成有两大途径：一是微生物产生的糖苷转移酶通过转糖基作用合成低聚糖；另一种是微生物产生的内切半纤维素酶类，如半乳聚糖酶、甘露聚糖酶和木葡聚糖酶及木聚糖酶等水解半纤维素类多糖产生低聚糖47。而豆豉在发酵过程中产生的-半乳糖苷酶更是能够水解棉子糖和水苏糖，从而改善低聚糖的生理功能。豆豉中已发现的低聚糖有低聚果糖、蔗果三糖（包括其三种异构体）、低聚半乳糖、低聚异麦芽糖以及低聚木糖等48，例如纳豆中的黏液成分就是谷氨酸肽和果聚糖的混合物49。低聚果糖是在发酵中产生的，它主要是由蔗果三糖的三种异构体在果糖基转移酶的作用下形成的，而低聚半乳糖是由-半乳糖苷酶转糖基作用形成的。 16第二章 材料与方法 1.2.2.3 大豆蛋白 蛋白质是人体在生长发育和生命活动中不可缺少的物质， 作为食品摄取的蛋白质最终是以氨基酸的形式被吸收的50。近年来研究发现，小分子肽特别是 23 个氨基酸组成的小肽可以直接被人体吸收，且速度比游离氨基酸还快，并且具有独特的生理活性：降胆固醇、降血压、抗氧化、提高运动员的肌肉能力、提高免疫、调节胰岛素、促进脂肪代谢及抗氧化等作用，从而引起食品界及医学界的广泛关注51，52。 豆豉在发酵过程中，大豆蛋白经微生物发酵产生蛋白酶，蛋白酶将蛋白质降解成多种具有生物活性的多肽，而蛋白酶与多肽都是大豆蛋白的产物。程丽娟等53指出豆豉经微生物作用后水溶性蛋白的含量提高了 36 倍，低分子与中分子肽的含量提高了 38倍，-氨基酸态氮的含量提高了 100 多倍。这是因为变性后的蛋白质有利于微生物的作用，从而使得蛋白质的水解度增大。张建华54的研究指出曲霉型豆豉中的多肽约占总氨基酸的 68%78%，其中有血管紧张素转换酶（ACE）抑制活性的多肽，并确定氨基酸组成为苯丙氨酸、异亮氨酸和甘氨酸。而水解所得多肽与大豆蛋白有着同样合理的氨基酸组成55。此外，还有研究表明56，大豆蛋白经水解生成多肽，而生成的多肽有促进微生物（如乳酸菌、双歧杆菌、酵母及霉菌等）生长发育和活跃代谢的作用，而氨基酸和大豆蛋白都无此作用。 1.2.2.4 豆豉纤溶酶 最初在日本纳豆中发现了纳豆激酶（Nattokinase），该酶具有较强的溶栓能力，且安全性极强。我国研究者受其启发，从细菌型豆豉中分离纯化出一种具有较强纤溶活性的酶，命名为豆豉纤溶酶（Douchi thrombolytic enzyme）。该酶是豆豉在发酵过程产生的一种丝氨酸蛋白酶，具有明显溶栓作用57，可用于治疗和预防血栓病。通过激活体内的纤溶酶原，而增加内源性纤溶酶的活性，具有溶栓能力强、安全、半衰期长等优点，是一种非常有前途的溶血栓、抗血栓的新型药物。 向梅58等从全国收集的 21 个豆豉产品中分离到 369 株革兰氏阳性芽孢杆菌，对其进行产纤溶酶活性筛选，得到 1 株高产纤溶酶菌株，经鉴定，该菌株为枯草芽孢杆菌。大量研究表明产豆豉纤溶酶的微生物主要为枯草芽孢杆菌。 但是彭勇59等从豆豉中筛选出一株纤溶活性高达 520IU/mL并且具有良好体外溶栓效果的细菌菌株，经鉴定为解淀粉芽孢杆菌。 近几年，我国对豆豉纤溶酶的分子量、等电点、稳定性、作用底物进行了初步研究。 17第二章 材料与方法 阎家麒等60测得豆豉纤溶酶的分子量为 31KD，是一种单链多肽酶；等电点为 8.6；该酶在 40以下稳定性良好，50，1h严重失活，60活性全部丧失，反复冻融对酶活性基本无影响，pH711 范围内稳定，而在pH值低于 5 时，很快失活。该酶有其特异的蛋白水解作用和识别位点，最敏感的底物是枯草杆菌蛋白酶和胰凝乳蛋白酶的底物，其次是血浆纤溶酶底物，这对于豆豉溶栓酶的开发以及酶活的测定具有较高的价值。此外，李江伟61等测定纯化的豆豉纤溶酶的分子量为 36KD。韩润林62等分离得到的溶栓酶的分子量有 20、27、28、30kD等多种。由此可见，溶栓酶的分子量有一定差异，分析原因可能是所选择的豆豉种类不同或者测定方法的不同造成的差异。 1.2.2.5 褐色色素 褐色色素也称蛋白黑素或类黑精（Melanoidin），是大豆蛋白质以及它的分解产物多肽类与还原糖之间作用发生美拉德 （Mailand） 反应生成的。 呈水溶性， 等电点为pH23，为一类弱酸性高分子，具有一种特有的强蓝色萤光，在酸或碱条件下很容易被水解，但不受消化酶降解。它具有强的抗氧化活性（目前豆豉、酱油中的类黑精的抗氧化效果已经被证实）。褐色色素还有类似食物纤维功能、胰蛋白酶抑制剂活性、抑制生成亚硝胺作用、及抑制ACE活性等功能63。 传统发酵大豆食品中的褐色色素类物质主要是一类类黑精素（Melanoidin） 。豆豉加工大都需要几个月的后熟期，在此期间发生美拉德反应。结果在终产品中生成大量褐色色素。 阚建全64等对豆豉类黑精深入研究， 发现毛霉型豆豉非透析类黑精具有较强消除自由基能力，在干燥物系中对猪油有较明显的抗氧化作用，且对N-二甲基亚硝胺合成有很强的抑制作用，进一步说明它可作为豆豉中保健功能成分之一。并测定重庆永川豆豉中类黑精含量为 3.61%65。此外，日本浓口酱油中的类黑精素含量为 5%、仙台豆酱中为4%、信州豆酱为 1%、日本大酱平均为 17%。 1.2.2.6 其它生理活性成分 大豆发酵食品中除以上几类生理活性成分之外， 还含有许多生理活性成分66，67， 如大豆中天然存在的大豆皂甙（soybean saponin）。现代研究表明大豆皂甙具有以下许多生理功能：:通过结合胆汁酸起到降低固醇的作用；抑制肝脏功能障碍作用；通过氧化脂质生成以及分解的作用;抑制或延缓肿瘤的作用；溶血作用；抗HIV病毒作用；活性氧消去作用等。此外，大豆发酵制品中还产生其它活性物质，如胆碱和亚油酸之类。 18第二章 材料与方法 1.2.3 大豆发酵食品风味物质的研究现状 中国的酱油、腐乳、豆瓣酱、豆豉、日本的纳豆（natto）和味增（miso）、东南亚的天贝（temph）等。由于它们独特的风味，这些食品成为人们生活饮食中的重要组成部分。二十世纪八十年代以来，人们开始对他们的风味进行研究。 1.2.3.1 风味物质的提取方法 获取风味成分的方法很多，可根据原型食品的特性要求（如固态或液态）及风味成分本身的性质（如挥发性、极性等）来确定，并没有一个固定的模式70。随着各种先进分析仪器和分析技术的出现，特别是气谱（GC）和气-质联用（GC-MS）技术的发展，对食品的风味研究推进了一大步。现在常用的风味物质的提取方法有：液液萃取法（Liquid-Liquid Extraction）、减压蒸馏法（Vacuum Distillation and Extraction）、同时蒸馏萃取法（Simultaneous Distillation and Extraction，SDE）、超临界流体萃取法（Supercritical fluid extraction， SCFE）、吹扫捕集法（Purge and Trap），顶空法（Head Space）、固相微萃取法（Solid PhaseMicroextraction， SPME）等。 1.2.3.2 风味物质化学成分的鉴定 大豆发酵食品的风味成分非常复杂，不同的大豆发酵食品（腐乳、豆豉、日本纳豆）又有着不同的化学成分。 1、腐乳（sufu） Liu，C.L68分别在白腐乳和红腐乳中辨认了 52 种和 40 种风味化合物。并且指出白腐乳的芳香主要归功于茴香脑（anethole），而红腐乳的芳香主要归功于酯和酒精。Hau（1999）69在三个品牌的红腐乳中总共识别 111 种挥发性的化合物，主要的化合物为醇和酯。Hau （2000）70采用 GC-MS-Sniffing嗅探装置，对腐乳的挥发性成分进行描述性感官分析。分析显示大多数果味状的、双乙酰的、哈密瓜似的气味最先被洗提，接着是肉的风味，玫瑰的、 梅脯类的芳香；重要的是在这篇文章中，他指出乙基 2-丙酸甲酯，2，3-丁二酮，丁酸乙酯，乙基 2-丁酸甲酯，3-（methylthio）丙醛，苯乙醛（benzeneacetaldehyde）和乙基-3-丙酸苯是红腐乳的特征风味成分。 2、豆豉（Dou Chi） 关于中国豆豉的风味研究，余爱农（2002）71用干馏法提取细菌型豆豉香气成分，气相色谱法分离，质谱法鉴定结构并与计算机系统储存的已知物质的质谱进行比较。共鉴定出 27 个挥发化合物，其中关键香味化合物是：月桂醛、12-羟基-7-桉叶-4-烯-6-酮、 19第二章 材料与方法 月桂醇、4-甲基-2，6-二叔丁基-4-羟基-2，5-环己二烯-1-酮、2，6-二叔丁基、4_甲基-2，6-二叔丁基苯酚、2-丁基-5-异丁基噻吩、1-（2-辛基环丙基） -1-辛酮、丙烯酸月桂醇酯、十五醛、六氢金合欢基丙酮、2，6-二叔丁基-4-硝基苯酚、5-十二烷基-2（3H）-呋喃酮13 个化合物。 3、纳豆（Natto） Tadayoshi和Zenya（1993）72用GC-MS分析在纳豆发酵室中的挥发性成分：共有 11种醇，5 种醛，13 种酮，9 种脂肪酸，4 种吡嗪，13 种烃，5 种硫化物，3 种呋喃，氨和吡咯。Tanaka（1998）73确认了丙酮和异丁酸甲酯是Natto的主要风味成分。Leejeerajumnean74确认了乙偶姻、2-甲基丁酸、吡嗪、二甲基二硫化物、2-戊基呋喃是纳豆的主要风味成分。由此可以看出，由于采用的检测方法不同，得出的主要风味成分也有所差异。 1.2.3.3 风味物质的形成 风味物质的形成十分复杂，其来源主要由大豆中的蛋白质、淀粉等大分子物质经微生物酶水解后生产的各种次级产物和小分子最终产物， 微生物在发酵过程中产生的代谢产物， 以及这些物质之间所产生的复杂的生物化学、 化学反应的产物。 主要有以下几点： 1、蛋白质水解分解成蛋白肽、多肽、二肽等中间产物，最终生成各种氨基酸；其中有些氨基酸如谷氨酸、天门冬氨酸等具有鲜味；而酪氨酸、色氨酸和苯丙氨酸氧化后可生成黑色素。 2、淀粉的水解生成糊精、麦芽糖，最终生成葡萄糖，葡萄糖经酵母菌、乳酸菌发酵，又可产生多种低分子物质，如乙醇、乙醛、乙酸、乳酸等。这些物质既是他们的成分，又可与其他物质作用生成色素、酯类等香气成分。 3、脂肪水解成甘油和脂肪酸，脂肪酸又通过各种短链脂肪酸是构成酯类的来源之一。 4、纤维素水解纤维素二糖和 -葡萄糖，并进一步生产其他低分子物质和高分子物质，如与氨基酸作用生产色素等。目前，各国学者还没有进一步对风味成分的形成机理进行探讨。 1.3 存在的问题 细菌型豆豉和根霉型豆豉在国外已得到深入的研究，且己经规模化、标准化生产， 20第二章 材料与方法 然而我国豆豉尽管生产历史悠久，但厂家分散，规模较小，生产还处于落后的手工作业阶段，靠经验操作，没有对技术改造提出更高的要求，对产品的研究没有引起重视。因而对豆豉的研究存在下述问题： 1、对发酵微生物及其发酵机理、生产工艺和产品的安全性等研究甚少。 2、没有筛选出合适的生产菌株，不能实现生产的工业化、标准化。 3、对豆豉发酵过程中的成分变化，没有进行系统的研究，不了解发酵过程与豆豉营养、风味和功能间的关系。 4、对豆豉生理功能的研究一直被忽视，其机理至今尚不明确。 1.4 研究内容和目标 本课题是基于上述背景和我国豆豉的生产和研究现状提出的。 主要目标是通过研究豆豉发酵微生物和生产工艺，为产品的工业化提供理论依据。同时，对混合菌种发酵豆豉新产品的生产工艺、活性物质、风味物质进行研究。探索豆豉发酵的理论基础，为大豆深加工寻求新的发展方向，开拓新的应用途径。 本课题的主要研究内容： 1、从 6 种大豆原料中选取出大豆蛋白和异黄酮含量相对较高的大豆作为豆豉发酵的原料。 2、豆豉发酵菌株的选取及鉴定。从自然发酵的豆豉中筛选出产 -葡萄糖苷酶和纤溶酶酶活较高的霉菌和细菌，并进行鉴定。 3、大豆发酵产品的功能性成分主要与异黄酮和豆豉纤溶酶有关，因此以 -葡萄糖苷酶活性和豆豉纤溶酶活性为指标，分别优化枯草芽孢杆菌和黄-米曲霉制豆豉曲的工艺条件，并对混合菌种制豆豉曲工艺进行优化。以氨基氮为指标，对豆豉的后酵工艺进行优化。 4、研究混合菌种发酵豆豉过程中活性成分的变化，如单菌种和混合菌种在发酵制曲过程中微生物量的变化；两种酶活在发酵过程中的变化；pH 值的变化；还原糖含量的变化；异黄酮含量的变化；水分含量的变化等。 5、对混合发酵产品风味进行研究，从而提高豆豉产品的风味。主要研究氨基氮在豆豉中的变化。 21第二章 材料与方法 第二章 材料与方法 2.1 实验材料 2.1.1 菌株 枯草芽孢杆菌（本实验室筛选的产豆豉纤溶酶活性较高的细菌）、曲霉菌（本实验室筛选的产 -葡萄糖苷酶活性较高的霉菌）。 2.1.2 培养基 1、种子培养基：蛋白胨 1% ，牛肉膏 0.5% ，NaCl 0.5% ，琼脂 2% ，pH 7.27.4 2、液体种子培养基：蛋白胨 1% ，牛肉膏 0.5% ，NaCl 0.5% ，pH 7.27.4 3、PDA 培养基：取去皮马铃薯 200g，切成小块，加水 1 000mL，煮沸 30min，滤去马铃薯块，将滤液补充至 1 000mL，加葡萄糖 20g，琼脂 15g，溶化后分装，121灭菌 30min。 4、察氏琼脂培养基：Sucrose （蔗糖）30g，NaNO3 3g，MgSO47H2O 0.5g，KCl 0.5 g，FeSO47H2O 0.01 g，K2HPO4 1 g，Agar （琼脂）13 g，Distilled water（蒸馏水）1 000 mL，pH 7.07.2。 5、察氏酵母膏培养基：Sucrose （蔗糖） 30 g，NaNO3 3 g ，MgSO47H2O 0.5 g，KCl 0.5 g，FeSO47H2O 0.01 g，K2HPO41 g，Agar （琼脂） 13 g，酵母膏 5 g，Distilled water （蒸馏水）1 000mL，pH 7.07.2。 6、营养琼脂培养基：Pepton （蛋白胨）5g，Beef extract（牛肉膏）10g，NaCl 5g ，Agar（琼脂）15g，Distilled water （蒸馏水）1 000mL， pH 7.07.2。 2.1.3 药品与试剂 蛋白胨 牛肉膏 生化试剂 生化试剂 浙江王环生化试剂厂 北京奥博星生物技术责任有限公司 22第二章 材料与方法 琼脂粉 酵母膏 琼脂糖 纤维蛋白 蔗糖 磷酸氢二钾 磷酸二氢钾 硫酸铜 硫酸镁 硼酸 硫酸钾 浓硫酸 甲醇 乙醇 乙醚 氯化钠 巴比妥钠 D-葡萄糖 甲醇 甲醛 水杨苷 吐温 80 纳它霉素 3,5-二硝基水杨酸 4种异黄酮标准品 牛纤维蛋白原 凝血酶 脱脂乳粉 氢氧化钠 冰醋酸 醋酸钠 生化试剂 生化试剂 生化试剂 生化试剂 分析纯 分析纯 分析纯 分析纯 分析纯 分析纯 分析纯 分析纯 分析纯 分析纯 分析纯 分析纯 分析纯 分析纯 色谱纯 分析纯 工业纯 分析纯 分析纯 分析纯 色谱纯 生化试剂 生化试剂 生化试剂 生化试剂 生化试剂 生化试剂 北京奥博星生物技术责任有限公司 北京奥博星生物技术责任有限公司 北京奥博星生物技术责任有限公司 中国医药集团上海化学试剂公司 沈阳市新西试剂厂 天津市天河化学试剂厂 沈阳市新西试剂厂 沈阳市新西试剂厂 沈阳市新西试剂厂 沈阳市新西试剂厂 天津市天河化学试剂厂 天津市天河化学试剂厂 大连市华中试剂厂 大连市华中试剂厂 大连市华中试剂厂 天津市广成化学试剂有限公司 天津市佳惠天新精密化工开发中心 沈阳市新西试剂厂 南京大唐化工有限责任公司 大连市华中试剂厂 天津市广成化学试剂有限公司 广州汇科精细化工有限公司 山东鲁抗医药公司 杭州富马化工有限公司 天津一方科技有限公司 中国药品生物制品检定所 中国药品生物制品检定所 黑龙江省完达山乳业股份有限公司 沈阳市新西试剂厂 沈阳市新西试剂厂 沈阳市新西试剂厂 23第二章 材料与方法 2.1.4 仪器与设备 YXQ-SG46 不锈钢手提式蒸汽灭菌锅 DHG-907A 电热恒温鼓风干燥箱 DK-S22 电热恒温水浴锅 电热恒温培养箱 LQE-211 落地式全温震荡器 生化培养箱 DHS-3C 精密 pH 计 HH-6 型数显恒温水浴锅 电子调温万用电炉 LG16-W 高速微量离心机 SCW-CJ-2FD 洁净工作台 722 光栅分光光度计 KDN-05A 蛋白质测定仪 微量进样器 KDN-4C 蛋白质消化仪 万能粉碎机 高效液相色谱JSM-6460LV 扫描电子显微镜 电子天平 Z323K 冷冻离心机 上海博迅有限公司 上海精密实验仪器有限公司 上海精密实验仪器有限公司 DNP-9082 上海精密实验仪器有限公司 上海精密实验仪器有限公司 SHP-150 上海精密实验仪器有限公司 上海雷磁仪器厂 江苏省金坛市荣华仪器 龙口市先科仪器公司 北京医用离心机有限公司 苏州宏瑞净化科技有限公司 高密彩虹分析仪器有限公司 上海贝特仪电设备厂 杭州力明仪器有限公司 上海贝特仪电设备厂 天津市泰斯特仪器有限公司 大连伊利特分析仪器有限公司 日本电子公司 北京赛多利斯仪器有限公司 HERMLE GERMANY 2.2 实验方法 2.2.1 大豆原料的选取 为了提高豆豉产品的保健功能性，本论文选购黑农 43、东农 690、合丰 25、期货、新绥农 14、新东农 690 6 种不同品种的大豆作为豆豉发酵原料，万能粉碎机粉碎，105烘箱烘至恒重，测定其大豆蛋白和大豆异黄酮的含量，选择大豆蛋白和大豆异黄酮含量较高的品种作为豆豉的原料。采用凯氏定氮法测定大豆蛋白；高效液相色谱法测定大 24第二章 材料与方法 选购黑农 43、东农 690、合丰 25、期货、新绥农 14、新东农 6 906 种不同品种的大豆，万能粉碎机粉碎，烘箱烘至恒重，测定其大豆蛋白和大豆异黄酮含量，选择大豆蛋白和大豆异黄酮含量较高的品种作为豆豉的原料。采用凯氏定氮法测定大豆蛋白；高效液相色谱法测定大豆异黄酮。取过 60 目筛的干燥的黄豆样品 1g 左右，加 20mL 甲醇于25mL 容量瓶中，80下超声提取 70min，提取后 4 000r/min 离心，倒出上清液，再用10mL 甲醇溶解沉淀离心，定容至 25mL（挥发），过 0.45L 膜，上机测定。 2.2.2 菌种微生物的研究 2.2.2.1 枯草芽孢杆菌生长曲线的确定 根据比浊法，420nm 下测 OD 值。 2.2.2.2 霉菌的鉴定75 761、菌落形态 首先根据霉菌在 PDA ， CYA 和 CA 培养基上的菌落形态对其进行初步分类，将菌株分别接种于不同的培养基，并分别在不同的温度下培养，以观察其菌落形态。具体步骤为：在倒好培养基平皿中，用接种针从斜面挑取少许孢子在培养皿中按三角形顶点位置三点式接种。察氏培养基平皿分别在 25和 37下培养 712d，察氏酵母琼脂培养基平皿在 25和 5下培养 712d，PDA 培养基平皿在 25下培养 712d，形成巨大菌落后进行特征观察并记录。 2、电镜观察 将导电胶贴于样品台上，从培养皿中取冷冻干燥后的菌丝少许置于胶上，真空喷金镀膜后，置于 JSM-6460LV 扫描电子显微镜下观察、测量及照相，产孢结构的描述主要依据 Samson 和齐祖同文献中的名词术语和所定标准。对菌株进行观察、测量后，根据真菌鉴定手册的曲霉属分群检索表初步鉴定其菌群类别，再将菌株的菌落形态、菌丝形态、产抱结构与文献描述进行反复对照鉴定。 2.2.2.3 107孢子悬浮液的制备 将曲霉菌接种于灭过菌的含有PDA培养基的大试管中， 在 30下培养 3d后用 10mL灭菌生理盐水洗脱。将洗脱的孢子悬浮液按 10 倍稀释度逐级稀释，直至 10-8。取稀释 25第二章 材料与方法 后的悬浮液 1mL涂布于平皿中，在 25下培养 2d后计数。用生理盐水将孢子悬浮液中的孢子数调至 1.0107个孢子/mL。将此孢子悬浮液置于 4冰箱中，作为菌种保存，保存期不得超过一个月。 2.2.3 双菌种混合制豆豉曲生产工艺的研究 2.2.3.1 原料预处理 将筛选好的大豆作为原料，加入 3 倍水在 40下浸泡 3.5h，淋干水分，采用高压灭菌锅 121蒸煮 35min，将大豆蒸至软，酥，透，冷却至 50以下，接种，制曲，后酵。 2.2.3.2 枯草芽孢杆菌制豆豉曲生产工艺的研究 豆豉在制曲过程中受到很多因素的影响，主要包括发酵时间、发酵温度、接菌量等因素，这些因素可能会对豆豉所产纤溶酶的活性大小产生影响，因此，选定不同的发酵时间、 发酵温度和接菌量， 分别做单因素实验， 获得豆豉产纤溶酶活力最大时的单因素，从而确定豆豉最佳的发酵时间、发酵温度和最适接菌量。然后做单因素正交试验，确定三个因素的最优组合，以获得枯草芽孢杆菌制豆豉曲最佳的发酵条件。 1、豆豉制曲发酵时间的确定 称取7份25g新绥农14黄豆，用3倍水浸泡，放入40水浴中恒温3.5h，采用121蒸煮35min，接菌量为2%，放入37生化培养箱，选择发酵时间为12h、24h、36h、48h、60h、72h，取出，纤维蛋白平板法测定纤溶酶酶活，确定最佳发酵时间。 2、豆豉制曲发酵温度的确定 称取5份25g新绥农14黄豆，用水浸泡，放入40水浴中恒温3.5h，采用121蒸煮35min，接菌量为2%，选择发酵温度为20、25、30、37、42，发酵时间为20h，取出，纤维蛋白平板法测定纤溶酶酶活，确定最佳发酵温度。 3、豆豉制曲接菌量的确定 称取5份25g新绥农14黄豆，用水浸泡，放入40水浴中恒温3.5h，采用121蒸煮35min，选取接菌量分别为1%、2%、3%、4%、5%，放入37生化培养箱中，发酵时间为20h，取出，纤维蛋白平板法测定纤溶酶酶活，确定最佳接菌量。 4、豆豉制曲最佳发酵条件的确定 称取16份25g新绥农14黄豆，用水浸泡，放入40水浴中恒温3.5h，采用121蒸煮35min。选取发酵温度、发酵时间、接菌量三个因素，各取四个水平，以豆豉纤溶酶活 26第二章 材料与方法 性大小为指标，采用L16（43）正交试验法发酵，见表2-1。 表 2-1 试验因素水平表 Table 2-1 Factor level of orthogonal experiment 水平 A 温度（） B 时间（h） C 接菌量（%） 1 27 24 1 2 32 36 2 3 37 48 3 4 42 60 4 2.2.3.3 曲霉菌制豆豉曲生产工艺的研究 1、曲霉菌制曲条件的优化 豆豉在制曲过程中受到很多因素的影响，主要包括发酵时间、发酵温度、接菌量等因素，这些因素可能会对豆豉产-葡萄糖苷酶的活性大小产生影响，因此，选定不同的发酵时间、发酵温度和接菌量，分别做单因素实验，获得豆豉产-葡萄糖苷酶活性最大时的单因素，从而确定豆豉最佳的发酵时间、发酵温度和最适接菌量。然后做单因素正交试验，确定三个因素的最优组合，以获得曲霉菌制豆豉曲最佳的发酵条件。 2、豆豉制曲发酵时间的确定 称取7份25g新绥农14黄豆，用3倍水浸泡，放入40水浴中恒温3.5h，采用121蒸煮35min，接菌量为4%，放入30生化培养箱，选择发酵时间为36h、48h、60h、72h、96h、120h、144h，取出，水杨苷法测定-葡萄糖苷酶相对活性，确定最佳发酵时间。 3、豆豉制曲发酵温度的确定 称取5份25g新绥农14黄豆，用水浸泡，放入40水浴中恒温3.5h，采用121蒸煮35min，接菌量为4%，选择发酵温度为15、20、25、30、35，发酵时间为60h， 27第二章 材料与方法 取出，水杨苷法测定-葡萄糖苷酶相对活性，确定最佳发酵温度。 4、豆豉制曲接菌量的确定 称取5份25g新绥农14黄豆，用水浸泡，放入40水浴中恒温3.5h，采用121蒸煮35min，选取接菌量分别为1%、2%、3%、4%、5%，放入30生化培养箱中，发酵时间为60h，取出，水杨苷法测定-葡萄糖苷酶相对活性，确定最佳接菌量。 5、豆豉制曲最佳发酵条件的确定 称取16份25g新绥农14黄豆，用水浸泡，放入40水浴中恒温3.5h，采用121蒸煮35min。选取发酵温度、发酵时间、接菌量三个因素，各取四个水平，以豆豉-葡萄糖苷酶相对活性大小为指标，采用L16（43）正交试验法发酵，见表2-2。 表 2-2 试验因素水平表 Table 2-2 Factor level of orthogonal experiment 水平 A 温度（） B 时间（h） C 接菌量（%） 1 20 36 1 2 25 48 2 3 30 60 3 4 35 72 4 2.2.3.4 混合菌种制曲接菌方式的研究 接菌方式 1 为先接入枯草芽孢杆菌，按其制曲的最优条件发酵，然后加入曲霉菌，再按曲霉菌最优条件发酵。 接菌方式 2 为同时加入二菌种，选择相对最优的条件进行发酵。 接菌方式 3 先接入曲霉菌，按其制曲的最优条件发酵，然后加入枯草芽孢杆菌，再按枯草芽孢杆菌最优条件发酵。 比较这三种方式对两种酶活的影响， 确定最佳接菌方式。 2.2.3.5 后酵工艺条件的确定 后酵工艺对风味的影响较大， 通过对不同温度下发酵不同时间的豆豉中氨基氮含量 28第二章 材料与方法 的比较，确定后酵工艺。取经过上述优化的较好的制曲条件下的豆豉曲，用自来水冲洗去除表面霉菌或粘丝，沥干。称取样品 2kg，加入盐 300g，混匀后装入 8 个玻璃瓶中，装时层层压实，并在表面各加入 95%的酒精 lmL 和盐 2.0 g，分别置于 25 ， 30，35和 40下培养，定期取样进行氨基氮含量测定，确定豆豉的发酵条件，并对最终产品进行感官评定。 2.2.4 豆豉发酵过程中酶活与微生物量的变化 2.2.4.1 样品处理 分别取上述优化条件下枯草芽孢杆菌、 曲霉菌以及双菌种发酵制曲的 12h、 24h、 36h、48h、60h、72h豆豉曲 1g，加入 10m1 灭菌后的生理盐水（加 0.l % v/v吐温 80），浸泡l5 分钟后摇匀，取上述液体 1mL，注入灭菌后的试管中，在超净工作台中用灭菌生理盐水按 10 倍比例逐级稀释到 10-6，10-7，10-8。此样品稀释液用于细菌总数和霉菌的计数。 2.2.4.2 微生物计数54 1、细菌总数 纳它霉素（Natamycin，0.1%，w/v）溶液配制：取纳它霉素 0.2g 用少量无菌生理盐水溶解，再在超净工作台中用 0.45m。的微孔滤膜过滤，滤液滴入灭菌后的三角瓶中待用。 培养基：营养琼脂培养基。 搅拌均匀，121灭菌 20min。冷却至 5060后，加入上述纳它霉素溶液，以防霉菌和酵母的生长。将冷却后的培养基倒平板，待凝固后取稀释倍数为 10-6，10-7，10-8的样品液 1mL涂布接种，在培养箱中 37培养 48h后进行细菌总数计数。 2、霉菌总数 培养基：PDA 培养基。 将上述培养基搅拌均匀， 121灭菌 20min， 冷却后倒平板。 取稀释倍数为 10-6， 10-7，10-8的样品液 1mL涂布于平皿中，在 25下培养 48h后进行菌落计数。 2.2.4.3 酶活测定77 78 采用纤维蛋白平板法和水杨苷法测定二种酶活。 29第二章 材料与方法 2.2.5 豆豉发酵过程中成分的变化 2.2.5.1 豆豉发酵过程中 pH 值的变化 按上述优化的发酵条件制曲、后酵。样品的制曲时间延长至 72h，并每隔 12h 取样一次。取豆豉曲样品 5. 00 g.，加入蒸馏水 50mL，搅拌均匀后测定此悬浮液的 pH 值。 2.2.5.2 豆豉发酵过程中水分含量的变化 按上述优化的发酵条件制曲、后酵。样品的制曲时间延长至 72h，并每隔 12h 取样一次。进行水分含量的检测，样品水分含量的测定采用常压恒重法，即 105烘干至恒重。 2.2.5.3 豆豉发酵过程中还原糖含量的变化 按上述优化的发酵条件制曲、后酵。样品的制曲时间延长至 72h，并每隔 12h 取样一次。取粉碎后的豆豉曲样品各 5.000g 溶于 50mL 容量瓶中，在 45水浴中加热 1h，并持续振荡。冷却后定容，混匀。放置 30min，离心后取上清液过滤（0.45um 滤纸），滤液即为样品液。 采用DNS法测定豆豉曲中的还原糖含量，取 1mL样品液，加入 3mLDNS试剂，沸水浴 5min，取出后冷水冷却，加入蒸馏水 10mL。550nm下测OD550值。 2.2.5.4 豆豉发酵过程中异黄酮含量的变化79按上述优化的发酵条件制曲、后酵。将制曲时间 48h 的豆豉曲、后酵 15d 的样品研磨粉碎，烘箱干燥至恒重，取过 60 目筛的经过干燥粉碎的样品 1.0g，加 20mL 甲醇于25mL 容量瓶中，80下超声提取 70min，提取后 4000r/min 离心，倒出上清液，再用10mL 甲醇溶解沉淀离心，定容至 25mL（挥发），过 0.45 微升膜，上机测定。在 254nm下检测，按峰面积计算染料木苷、染料木素、黄豆苷、黄豆素的含量。配制 0.35mg/mL的染料木苷，染料木素，黄豆苷，黄豆素的标准混合液，用外标法进行定量分析。 2.2.5.5 豆豉发酵过程中风味物质的变化 按上述优化的发酵条件制曲、后酵。样品的制曲时间延长至72h，并每隔12h取样一次。采用甲醛滴定法测定豆豉发酵过程中氨基氮含量的变化。 30第二章 材料与方法 2.3 测定方法 2.3.1 蛋白质含量的测定 采用凯氏定氮法测定蛋白质含量。 样品的消化：精确称取 0.5g 黄豆粉末（干燥至恒重），将样品放入蛋白质消化仪的消化管内，加入 10mL 浓硫酸、0.3g 硫酸铜粉末、3g 硫酸钾。开始消化，消化至消化液至透明的绿色后，继续加热半小时，停止消化，待消化管冷却后，进行下一步实验。 消化液的蒸馏：将消化液定容至 100mL，取 10mL 定容的消化液加入消化管中，蛋白质测定仪检测。其中蛋白质测定仪调整为手动，加 40%NaOH 大约 20mL，开始蒸汽8min。用加入 3 滴混合指示剂的 25mL4%硼酸（250mL 锥形瓶）吸收。 滴定：用 0.1mol/L 的盐酸溶液滴定。待溶液由蓝色变为粉红为滴定终点。 蛋白质含量：C=（V2-V1）N0.014F100/W5 。 其中 F 值为 5. 71；N 值为所配盐酸浓度，本实验为 0.09876。 2.3.2 异黄酮含量的测定79色谱条件： 流 动 相：A 泵甲醇；B 泵水 洗脱程序：018min40%甲醇 1840min4090%甲醇 4045min9040%甲醇 4560min40 %甲醇 柱温：室温；流速：1mL/min；波长：254nm；进样量：20L。 2.3.3 氨基氮含量的测定 采用甲醛滴定法。 取豆豉曲样品 1g用 50mL蒸馏水稀释、 摇匀， 然后用 0.05N NaOH将pH滴定至 8.5，记录NaOH用量V1。在悬浮液中加入 20mL中性甲醛溶液，摇匀后再用0.05N NaOH将pH滴定至 8.5，记录NaOH用量V2，以空白样为对照。总酸和氨基氮含量按下式计算： 总酸（%）=N（V1-V0） 0.09100/W 氨基酸态氮（%）=N（V2-V01） 0.014100/W 31第二章 材料与方法 N为NaOH的当量浓度；V0，V01为空白样滴定时NaOH的用量（mL）；W为样品量（g）； 0.014 为氮的毫克当量；0.09 为乳酸的转换系数。 2.3.4 纤溶酶酶活的测定方法77 y = 0.4398x + 1.5161R2 = 0.99521.51.71.92.12.32.50.20.71.21.72.2酶浓度的对数（Log IU/mL）水解圈面积的对数Log mm2 图 2-1 尿激酶标准曲线 Fig.2-1 Standard curve of Urokinase 2.3.4.1 尿激酶标准曲线的建立 纤维蛋白平板法测定的纤溶酶活性是相对于尿激酶的单位，所以要先绘制标准曲线，将尿激酶标准品用缓冲液依次稀释为 100，50，25，12.5，5IU/mL，分别取 10L点在纤维蛋白平板上，加盖后保温 18h，绘制标准曲线，结果如图 2-1。 2.3.4.2 纤维蛋白平板的制备 把5mL 0.1%的琼脂糖在55混入2.5mL 4BP/mL的凝血酶及7.5mL的纤维蛋白原，混匀倒入平板中，静置冷却。 2.3.4.3 制备酶液 取 10g 豆豉研细，加入 15mL 生理盐水搅拌均匀，4浸提 1h，取出置于高速离心机中，10 000r/min 离心 10min，取上清夜，即为粗酶液待用。 32第二章 材料与方法 2.3.4.4 测定纤溶酶活性 采用微量取样器吸取 10L 粗酶液注射到纤维蛋白平板中，30培养 18h 后，用游标卡尺测量溶圈直径，算出溶圈面积。 根据标准曲线计算出每克曲的纤溶活性相当于尿激酶的单位数。 2.3.5 -葡萄糖苷酶相对活性的测定782.3.5.1 水杨苷底物的配制 取醋酸钠5.4g， 加水50mL使溶解， 用冰醋酸调节pH值至4.6， 再加水稀释至100mL。称取 0.5g 水杨苷（25%），用 pH4.6 的醋酸缓冲液定容至 50mL。将杂质用滤纸滤掉。 2.3.5.2 粗酶液制备 取10g豆豉研细， 加入100mL蒸馏水搅拌均匀， 室温浸提2h， 高速离心机10 000r/min离心 10min，取上清夜，即为粗酶液待用。 2.3.5.3 酶活测定 取 0.5mL 粗酶液，0.5mL 水杨苷底物于具塞试管中，置 50下保温 30min。取 5mL酶液，100下灭酶 10min。吸取 0.5mL 经灭酶的酶液，0.5mL 底物于具塞试管中作为空白样。 加入 3mLDNS 试剂， 沸水浴 5min， 取出后冷水冷却， 加入蒸馏水 10mL， 550nm下测 OD 值。 2.3.5.4 标准曲线的测定 配制葡萄糖含量为 0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6 的葡萄糖标准溶液，向 2mL标准液中加入 1.5mL水杨酸显色，测定其OD550，绘制标准曲线。其中葡萄糖经 105干燥至恒重。所测结果绘制标准曲线，如图 2-2 所示。 2.3.5.5 酶活单位 酶活力单位为每 30min 产生相当于 1mg 葡萄糖所需的酶量。 2.3.5.6 DNS 试剂的配制 将 6.3g 3,5二硝基水杨酸和 262mL 2mol/LNaOH 溶液，加到 500mL 含有 185g 酒石酸钾钠的热水溶液中，再加 5g 结晶酚和 5g 亚硫酸钠，搅拌溶解。冷却后加蒸馏水定 33第二章 材料与方法 容至 100mL，储于棕色瓶中备用（稳定 7d）。 y = 11.509x - 0.0092R2 = 0.999100.10.20.30.40.50.600.010.020.030.040.050.06葡萄糖浓度（mg/mL）OD550 图 2-2 DNS 标准曲线 Fig.2-2 Standard curve of DNS 34第三章 结果与讨论 第三章 结果与讨论 3.1 大豆原料的选取 通过凯氏定氮法和高效液相色谱法测定出 6 种品种大豆的蛋白质和异黄酮含量， 其含量如图 3-1、表 3-1 所示。图 3-2 为异黄酮标准图谱。 新东690市售黄豆新4合丰25东农690黑农433435363738394041424344123456大豆品种蛋白质含量(%) 新绥农14绥农1期货图 3-1 不同品种大豆蛋白质的含量 Fig.3-1 Protein content of different soybean 本实验大豆原料的选取主要依据蛋白质和异黄酮为指标， 这是因为蛋白质在发酵过程中会产生丰富的酶类，从而提高豆豉的功能性；选取异黄酮作为依据主要是因为异黄酮是大豆中重要的活性成分， 它分为糖苷型异黄酮和苷元型异黄酮， 很多研究表明39，40，大豆异黄酮各组分中能够产生生理活性的是游离甙元，而不是结合糖苷，因此，游离甙元（主要是Gen和Den）是大豆异黄酮的主要活性组分。本实验主要研究大豆异黄酮在发酵过程中糖苷型异黄酮向苷元的改变， 因此选用糖苷型异黄酮含量高的大豆作为豆豉原料。 通过图 3-1、表 3-1 可知，新绥农 14 中的蛋白质含量为 41.09%，仅次于东农 690的 43.14%，新绥农 14 的糖苷型异黄酮含量黄豆苷 1.037 mg/g，染料木苷 0.850 mg/g， 25第三章 结果与讨论 含量最高，因此适合本实验关于异黄酮转化的研究。综合考虑以上因素，本实验选用新绥农 14 作为豆豉原料。 表 3-1 不同品种大豆的异黄酮含量 Table 3-1 Isoflavone content of different soybean 6种大豆品种 黄豆苷（mg/g）染料木苷 （mg/g） 黄豆素（mg/g） 染料木素 （mg/g）黑农43 0.316 0.342 0.353 0.033 东农690 0.537 0.669 0.273 0.057 合丰25 0.510 0.570 0.231 0.045 期货 0.314 0.383 0.170 0.029 新绥农14 1.037 0.850 0.008 0.004 新东农690 0.388 0.531 0.005 0.004 黄豆素染料木素 染料木苷黄豆苷 图 3-2 异黄酮测定标准图谱 Fig.3-2 Standard spectrum of isoflavone 26第三章 结果与讨论 3.2 菌种微生物的研究 3.2.1 枯草芽孢杆菌生长曲线的测定 菌种生长曲线是反映一个菌种生长情况的曲线， 选用处于不同生长期的菌种， 对发酵过程中菌种的生长繁殖以及发酵之后产纤溶酶的活性大小有很大影响。 通常会选用处于对数生长期的菌种来接种，因为在这个时期，菌种繁殖最快，生长最旺盛。测定的筛选菌的生长曲线如图 3-3 所示。 -0.500.511.522.53010203040时 间 （ h） OD420 图 3-3 枯草芽孢杆菌生长曲线 Fig.3-3 Growth curve of the bacillus subtilis 取二环活化后的枯草芽孢杆菌， 接入装有40mL液体种子培养基的250mL锥形瓶中，30下 150r/min 摇瓶培养，每隔 3h 取样，直到 48h，以同条件下未接种的培养基为空白对照，测 OD420值。时间为横坐标，OD420值为纵坐标，作枯草芽孢杆菌的生长曲线，如图 3-3，在 2733h 这一时期，枯草芽孢杆菌处于生长的稳定期。因此本实验选择发酵 27h 的种子液进行接种发酵。 3.2.2 霉菌的鉴定 菌株的菌落形态、菌丝形态和产孢结构如图 3-4、3-5 所示，其描述及鉴定结果分别 27第三章 结果与讨论 叙述如下： 图 3-4 菌株的菌落形态 Fig.3-4 The hyphal configurations of strain 图 3-5 菌株不同放大倍数产孢结构的电镜照片 Fig.3-5 The different magnification aspergillum photo of strain 察氏琼脂培养基：25下培养 3d，菌落较薄，平坦，有小沟纹，无褶皱，无渗出液和可溶性色素，质地絮状，菌落大部分为白色，菌落直径约 2cm，部分浅黄色，黄白相间，菌落反面白色。 PDA ：25下培养 3d，绿色絮状菌落，直径大约 5cm，有同心圆，反面无色至淡 28第三章 结果与讨论 褐色，边缘白色，无液渗出和可溶性色素。 察氏酵母：25下培养 3d，菌落较薄，菌落淡黄色，菌落直径约 4-5cm。菌丝体白色，有辐射状沟纹，菌落反面无色至淡褐色。 37下培养 3d，在察氏琼脂，察氏酵母，PDA 三种培养基上的形态同上。 菌丝形态及产孢结构：分生孢子梗粗糙有麻点，直径 20m；分生孢子半圆形，直径 4m；顶囊球形，直径 50m。 鉴定结果75，76： 根据真菌鉴定手册的曲霉属分群检索表初步鉴定其为曲霉属， 将菌株的菌落形态、菌丝形态、产孢结构与中国真菌志第五卷的描述进行对照鉴定，鉴定其为黄-米曲霉，本菌在工业上用途很广，主要酿造酒精、味精、酱油等。 3.2.3 107孢子悬浮液的制备 将曲霉菌接种于灭过菌的含有PDA培养基的大试管中， 在 30下培养 3d后用 10mL灭菌生理盐水洗脱。将洗脱的孢子悬浮液按 10 倍稀释度逐级稀释，直至 10-8。取稀释后的悬浮液 0.5 mL涂布于平皿中，在 25下培养 2d后计数。发现当稀释至 10-8时，平板上的孢子数为 1。由此可计算出当稀释倍数为 10-1时，悬浮液中的孢子数为 1.0107个孢子/mL。 3.3 双菌种混合制豆豉曲生产工艺的研究 3.3.1 枯草芽孢杆菌制豆豉曲生产工艺的研究 3.3.1.1 发酵时间对豆豉纤溶酶活性的影响 选取发酵时间为单因素， 测定不同发酵时间对豆豉纤溶酶相对活性的影响。 以发酵时间为横坐标，溶圈直径为纵坐标，如图 3-6 所示。发酵时间在 48h 之前，随着发酵时间的延长，豆豉纤溶酶相对活性逐步增大，特别是在 34h 至 48h 之间，纤溶酶相对活性显著增大，在 48h 溶圈直径达到最大值为 2.20cm。发酵时间在 48h 之后，纤溶酶相对活性显著降低，因此，确定适宜的发酵时间为 48h 左右。 一般来说，发酵时间过短，纤溶酶活性没有达到最大值，豆豉的保健功效没有完全体现出来；而发酵时间过长，不但浪费时间和能源，而且溶圈直径反而降低，这是因为发酵时间过长，发酵过程中产生的一些代谢产物对纤溶酶起到了抑制作用。 29第三章 结果与讨论 22.042.082.122.162.22.24012243648607284发酵时间(h)溶圈直径(cm) 图 3-6 发酵时间对纤溶酶相对活性的影响 Fig. 3-6 The effects of fermentation time on the thrombolytic enzyme 00.511.522.501020304050发酵温度()溶圈直径(cm)图 3-7 发酵温度对纤溶酶相对活性的影响 Fig.3-7 The effects of fermentation temperature on the thrombolytic enzyme 30第三章 结果与讨论 3.3.1.2 发酵温度对豆豉纤溶酶活性的影响 选取发酵温度为单因素，测定不同发酵温度对豆豉纤溶酶相对活性的影响。以发酵温度为横坐标，溶圈直径为纵坐标，如图 3-7 所示。在发酵温度为 20时豆豉纤溶酶没有活性，溶圈直径为 0；发酵温度在 20至 37之间，纤溶酶相对活性逐渐增大，在37时，纤溶酶相对活性达到最大，溶圈直径为 2.00cm；而发酵温度在 37之后，纤溶酶相对活性又开始降低。因此，确定适宜的发酵温度为 37左右。 发酵温度在 25以下，无溶圈现象，分析原因可能是该菌种在 25下生长缓慢，不利于纤溶酶的生成。发酵温度在 37下，纤溶酶相对活性最大，分析其原因为该温度下枯草芽孢杆菌适合生长，代谢旺盛，利于纤溶酶的生成。 3.3.1.3 接菌量对豆豉纤溶酶活性的影响 22.12.22.32.42.50123456接菌量(%)溶圈直径(cm) 图 3-8 接菌量对纤溶酶相对活性的影响 Fig.3-8 The effects of the strain amount on the thrombolytic enzyme 选取接菌量为单因素，测定不同接菌量对豆豉纤溶酶相对活性的影响。以接菌量为横坐标，溶圈直径为纵坐标，如图 3-8 所示。接菌量在 2%之内，随着接菌量的增大，纤溶酶相对活性逐渐增大；当接菌量大于 2%时，纤溶酶相对活性基本保持不变。因此确定适宜的接菌量为 2%左右。 31第三章 结果与讨论 表 3-2 正交试验结果与分析 Table 3-2 The results and analysis of the orthogonal experiments 实验号 A温度（） B时间（h） C接菌量（%） 溶圈直径（cm）1 1（27） 1（24） 1（1） 1.900 2 1 2（36） 2（2） 2.018 3 1 3（48） 3（3） 2.000 4 1 4（60） 4（4） 1.910 5 2（32） 1 2 1.940 6 2 2 1 2.118 7 2 3 4 2.010 8 2 4 3 1.820 9 3（37） 1 3 2.000 10 3 2 4 2.040 11 3 3 1 2.290 12 3 4 2 1.950 13 4（42） 1 4 1.800 14 4 2 1 1.910 15 4 3 2 1.960 16 4 4 3 1.900 K17.828 7.640 8.218 K27.888 8.086 7.868 K38.280 8.260 7.720 K47.570 7.580 7.760 k11.957 1.910 2.055 k21.972 2.022 1.967 k32.070 2.065 1.930 k41.893 1.895 1.940 极差R 0.177 0.170 0.125 32第三章 结果与讨论 1.81.851.91.9522.052.1A1 A2 A3 A4B1 B2 B3 B4C1 C2 C3 C4因素水平溶圈直径(cm) 图 3-9 溶圈直径与因素水平趋势图 Fig.3-9 The trend of polysaccharides content at different factor and level 3.3.1.4 最适工艺条件的确定 在单因素的基础上，对影响制曲工艺的发酵温度、发酵时间、接菌量三个因素进行L16（43） 正交试验， 确定最佳制曲工艺条件。 正交试验结果及极差分析如表 3-2 和图 3-9。 极差分析结果表明，影响纤溶酶相对活性的因素主次顺序为ABC，即：发酵温度发酵时间接菌量，各因素的最优水平组合为：A3B3C1，即：发酵温度为 37，发酵时间为 48h，接菌量为 1%。采用最佳制曲条件测得纤溶酶相对活性为 2.34cm，纤溶酶酶活 520.40IU/g。 为了更直观的反映发酵条件对纤溶酶相对活性的影响，分别以各因素水平为横坐标，以纤溶酶相对活性的平均值为纵坐标，绘制试验因素与指标趋势图，见图 3-9。 3.3.2 曲霉菌制豆豉曲生产工艺的研究 3.3.2.1 发酵时间对 -葡萄糖苷酶活性的影响 选取发酵时间为单因素，测定不同发酵时间对豆豉曲的 -葡萄糖苷酶活性的影响。以发酵时间为横坐标，-葡萄糖苷酶活性为纵坐标，如图 3-10 所示。 发酵时间在 48h之前，随着发酵时间的延长，-葡萄糖苷酶相对活性逐步增大，在48h， OD550达到最大值为 0.220。 发酵时间在 48h之后， -葡萄糖苷酶相对活性逐渐降低， 33第三章 结果与讨论 因此，确定适宜的发酵时间为 48h左右。 发酵时间过短，-葡萄糖苷酶活性没有达到最大值，豆豉的保健功效没有完全体现出来；而发酵时间过长，不但浪费时间和能源，而且 -葡萄糖苷酶活性反而降低，这是因为发酵时间过长，发酵过程中产生的一些代谢产物对 -葡萄糖苷酶起到了抑制作用。 00.050.10.150.20.2520406080100时间（h）OD550 图 3-10 发酵时间对 -葡萄糖苷酶相对活性的影响 Fig.3-10 The effects of the fermentation time on the-glucosidase 3.3.2.2 发酵温度对 -葡萄糖苷酶活性的影响 OD 55000.040.080.120.160.210152025303540温度()OD550 图 3-11 发酵温度对对 -葡萄糖苷酶相对活性的影响 Fig.3-11 The effects of the fermentation temperature on the-glucosidase 34第三章 结果与讨论 选取发酵温度为单因素，测定不同发酵温度对 -葡萄糖苷酶相对活性的影响。以发酵温度为横坐标，-葡萄糖苷酶相对活性为纵坐标，如图 3-11 所示。 发酵温度在 30以下，-葡萄糖苷酶相对活性随着温度的升高而逐渐增加，当发酵温度达到 30时，OD550达到最大，为 0.181。30以上，-葡萄糖苷酶相对活性随着温度的升高而逐渐减小。因此，确定适宜的发酵温度为 30左右。 随着温度的升高，-葡萄糖苷酶活性逐渐增加是因为该霉菌的新陈代谢活动随着温度的升高逐渐加剧，产生的代谢产物丰富且活力旺盛；当温度超过30时，过高的发酵温度阻碍了该霉菌的正常代谢，从而抑制了代谢产物的合成，使得-葡萄糖苷酶活性降低。 0.050.10.150.20123456接菌量(%)OD550 图 3-12 接菌量对 -葡萄糖苷酶相对活性的影响 Fig.3-12 The effects of the strain amount on the-glucosidase 3.3.2.3 接菌量对 -葡萄糖苷酶活性的影响 选取发酵温度为单因素，测定不同发酵温度对-葡萄糖苷酶相对活性的影响。以发酵温度为横坐标，-葡萄糖苷酶相对活性为纵坐标，如图3-12所示。随着接菌量的增大，-葡萄糖苷酶相对活性逐渐增大；当接菌量大于3%时，-葡萄糖苷酶相对活性基本保持不变。因此确定确定适宜的接菌量为3%。-葡萄糖苷酶活性没有随着接菌量的增大而逐步增大，分析原因可能是发酵过程中接入3%的菌量已经可以使豆豉发酵完全。接菌过多对-葡萄糖苷酶的产生没有太大影响。 35第三章 结果与讨论 3.3.2.4 最适工艺条件的确定 表 3-3 正交试验结果与分析 Table 3-3 The results and analysis of the orthogonal experiments 实验号 A温度（） B时间（h） C接菌量（%） OD5501 1（20） 1（36） 1（1） 0.028 2 1 2（48） 2 （2） 0.014 3 1 3（60） 3（3） 0.045 4 1 4（72） 4（4） 0.017 5 2（25） 1 2 0.01 6 2 2 1 0.094 7 2 3 4 0.049 8 2 4 3 0.055 9 3（30） 1 3 0.084 10 3 2 4 0.118 11 3 3 1 0.124 12 3 4 2 0.173 13 4（35） 1 4 0.174 14 4 2 1 0.172 15 4 3 2 0.117 16 4 4 1 0.042 K10.104 0.296 0.288 K20.208 0.398 0.314 K30.499 0.335 0.356 K40.505 0.287 0.358 k10.026 0.074 0.072 k20.052 0.100 0.079 k30.125 0.084 0.089 k40.126 0.072 0.090 36第三章 结果与讨论 在单因素实验的基础上，对影响制曲工艺的三个因素：发酵温度、发酵时间、接菌量进行L16（43）正交试验。结果见表 3-3。 极差分析结果表明，影响-葡萄糖苷酶活性的因素逐次顺序为：ABC，即发酵温度发酵时间接菌量，各因素的最优水平组合为：发酵温度为 35，发酵时间为 48h，接菌量为 4%。采用最佳制曲条件测得-葡萄糖苷酶相对活性为OD550 0.174，葡萄糖苷酶活为 31.8IU/100g，大于张建华的-葡萄糖苷酶活性 25.5IU/100g54。 为了更直观的反映实验因素对胞内多糖提取率的影响趋势，分别以各因素水平为横坐标，以 K 值的平均值为纵坐标，绘制因素与指标趋势图，见图 3-13。 00.020.040.060.080.10.120.14A1 A2 A3 A4B1 B2 B3 B4C1 C2 C3 C4因素水平OD550 图 3-13 OD550与因素水平趋势图 Fig.3-13 The trend of OD550 at different factor and level 3.3.3 混合菌种制曲条件的优化 3.3.3.1 混合菌种制曲接菌方式的研究 如表 3-4 所示，三种接菌方式对豆豉纤溶酶相对活性的影响以接菌方式 3 最大；其次影响较大的是接菌方式 1； 而接菌方式 2 的豆豉纤溶酶相对活性 2.35cm 基本等于最优条件下的 2.34cm，无影响因素。以上现象说明黄-米曲霉及其产生的代谢产物对枯草芽孢杆菌的产酶有抑制作用，而接菌方式 3 的先接入黄-米曲霉而使得豆豉纤溶酶相对活性受抑制影响最大。 三种接菌方式对 -葡萄糖苷酶活性的影响以接菌方式 2 最大， 接菌方式 2 的 -葡萄 37第三章 结果与讨论 糖苷酶相对活性 0.268 明显高于最优条件下的 0.174；其次影响较大的是接菌方式 1；而接菌方式 3 的影响非常小。 以上现象说明枯草芽孢杆菌及其产生的代谢产物对 -葡萄糖苷酶活性有促进作用，而接菌方式 3 由于先接入黄-米曲霉而使得 -葡萄糖苷酶活性基本无变化。 故本实验选择接菌方式 2 作为混合菌种制豆豉曲的最佳接菌方式。 表 3-4 不同接菌方式相对酶活性的比较 Table 3-4 Compare of enzyme activity with different addition strain ways 酶活 接菌方式1 接菌方式2 接菌方式3 豆豉纤溶酶相对活性 2.114cm 2.35cm 1.80cm -葡萄糖苷酶OD5500.208 0.268 0.164 3.3.3.2 混合菌种制曲条件的确定 由上述可知，枯草芽孢杆菌与曲霉菌的发酵条件分别为 37和 35的发酵温度，1%和 4%的接菌量，48h 和 48h 的发酵时间。由于二者发酵温度和发酵时间较为接近，故本实验直接选定发酵温度为 36，发酵时间为 48h，按接菌方式 2 发酵作为混合菌种制曲的最优条件。 3.3.4 后酵工艺条件的确定 表 3-5 不同温度下后酵不同时间的氨基氮含量（%） Table 3-5 Amino nitrogen content of different fermentation time in different temperature（%） 后酵时间 25 30 35 40 10d 1.0 1.25 1.4 1.20 15d 1.35 1.40 1.7 1.45 20d 1.40 1.55 1.75 1.50 后酵过程中氨基氮的变化如表 3-5 所示。 由表中结果可以看出 35时产品的氨基氮 38第三章 结果与讨论 含量最高，为较佳的后酵温度。豆豉曲在 25，30下后酵，明显没有达到蛋白酶的适宜温度，氨基氮的含量较低。虽然 40为许多蛋白酶的最适作用温度，但在此温度下酶活性会逐渐降低；此外，温度越高，豆豉的水分下降越快，食盐浓度升高对酶活性有抑制，因此发酵效果反而不如 35。根据发酵期间氨基氮的变化，确定后酵条件为:温度35，发酵时间 15d。此时样品呈棕褐色，味道鲜美，有清香的豆瓣酱风味。 3.3.5 豆豉发酵过程中酶活性与微生物量的变化 表 3-6 枯草芽孢杆菌最优条件发酵过程中酶活性与微生物量的变化 Table 3-6 Changes of enzyme activity and microbial biomass in the optimum fermentation conditions of Bacillus subtilis Douchi 发酵时间（h） 12 24 36 48 60 72 枯草芽孢杆菌数107个/g 0.82 2.34 2.67 3.0 2.57 1.73 纤溶酶相对活性（cm） 0 2.20 2.45 2.45 2.35 2.00 表 3-7 黄-米曲霉最优条件发酵过程中酶活性与微生物量的变化 Table 3-7 Changes of enzyme activity and microbial biomass in the optimum fermentation conditions of A.flavus-oryZae Douchi 发酵时间（h） 12 24 36 48 60 72 黄-米曲霉数107个/g 0.15 2.7 9.2 9.4 8.6 7.4 -葡萄糖苷酶相对活性 0.046 0.094 0.112 0.178 0.177 0.127 由表 3-6、 3-7 可知， 豆豉纤溶酶相对活性和 -葡萄糖苷酶相对活性与微生物量均在48h 达到最大。这说明酶的产生与微生物的变化有着密切的关系，微生物量的增大使其新陈代谢加剧，从而产生各种酶类。微生物量最大时，新陈代谢活力最大，产生的酶与酶活性也最大；随着微生物进入衰退期，微生物不断死亡，培养基中一些具有副作用的代谢产物不断增加，从而造成了酶活性的降低。由表 3-8 的数据可以得出，变化机理与上述基本一致，但是不同的是纤溶酶相对活性在整体上比表 3-6 中的数据略有下降，-葡萄糖苷酶相对活性在整体上比表 3-7 中的数据有所增加，结合 3.3.3.1 的实验现象，可 39第三章 结果与讨论 能是因为黄-米曲霉及其产生的代谢产物对枯草芽孢杆菌的产酶有抑制作用，而枯草芽孢杆菌及其产生的代谢产物对 -葡萄糖苷酶活性有促进作用的原因。 表 3-8 混合菌种最优条件发酵过程中酶活性与微生物量的变化 Table 3-8 Changes of enzyme activity and microbial biomass in the optimum fermentation condition of multi-strain fermention Douchi 发酵时间（h） 12 24 36 48 60 72 后酵15d枯草芽孢杆菌数107个/g 0.78 2.24 2.78 3.24 3.04 2.33 0 纤溶酶相对活性（cm） 0 2.20 2.25 2.35 2.28 1.80 2.32 黄-米曲霉数107个/g 0.12 2.3 8.2 9.6 9.4 8.4 0 -葡萄糖苷酶相对活性 0.0440.0890.2220.2680.2620.167 0.220 3.3.6 豆豉发酵过程中活性成分与风味物质的变化 3.3.6.1 豆豉制曲发酵过程中 pH 值的变化 0123456789122436486072发酵时间(h)pH 图3-14 发酵过程中 pH 的变化 Fig.3-14 Changes of pH values during fermentation period 40第三章 结果与讨论 发酵对产品pH值的影响如图3-14所示。制曲过程中产品的pH值有所上升，成曲的pH值均在7.5左右，分析其原因是在制曲阶段霉菌繁殖使氨基氮含量增加的结果。在后酵过程中由于乳酸菌等微生物的作用，产生了氨基酸、有机酸等酸性代谢产物，使得后酵产品的pH值较低，在5.5左右。 3.3.6.2 豆豉制曲发酵过程中水分含量的变化 010203040506070012243648607284发酵时间(h)水分含量(%) 图3-15 发酵过程中水分的变化 Fig.3-15 Changes of water contents during fermentation period 豆豉发酵过程中水分含量的变化如图3-15所示，结果表明随着发酵的进行，大豆的含水量不断下降，因此发酵时间延长不利于微生物的生长。 3.3.6.3 豆豉制曲发酵过程中还原糖含量的变化 发酵期间还原糖的变化如图 3-16 所示。 024h 还原糖的含量不断升高， 在 24h 达到峰值 1.523，即 18.638mg/g。然后维持到 36h，随后不断下降。上述结果说明在发酵开始阶段，微生物的生长需要能量，分解了部分碳水化合物，使淀粉等生物大分子分解产生还原糖，再利用小分子碳水化合物和脂肪合成生物有机体，因此发酵过程中存在固形物损失。3648h，微生物的生长更加旺盛，大量的菌丝体在此期间形成，此阶段为产酶的旺盛期，一方面酶将大分子物质分解为小分子物质，并释放能量，另一方面微生物利用这些分解后的物质合成生物体，因此，此阶段还原糖含量急剧下降。 41第三章 结果与讨论 0.811.21.41.612243648607284发酵时间(h)OD550 图3-16 发酵过程中还原糖含量的变化 Fig.3-16 Changes of reducing sugar contents during fermentation period 3.3.6.4 豆豉发酵过程中异黄酮含量的变化 发酵过程中异黄酮含量的变化如图 3-17、3-18、3-19 所示。随着发酵时间的延长，糖苷型异黄酮的含量不断下降，而苷元的含量不断增加。新绥农 14，按干重计，黄豆苷1.037 mg/g，染料木苷 0.850 mg/g，黄豆素 0.008mg/g，染料木素 0.004mg/g。混合菌种制曲 48h 的豆豉曲，按干重计，黄豆苷 0.167 mg/g，染料木苷 0.379 mg/g，黄豆素 0.248 mg/g，染料木素 0.198 mg/g。后酵 15d 的豆豉曲，按干重计，黄豆苷 0.142 mg/g，染料木苷 0.215 mg/g，黄豆素 0.380mg/g，染料木素 0.440 mg/g。 由此可以计算出， 在豆豉制曲 48h时， 黄豆苷的转化率为 83.90%， 染料木苷 55.41%，均大于张建华54的黄豆苷转化率 74.8%，染料木苷 49.8%；在后酵 15d时，黄豆苷的转化率为 86.31%，染料木苷 74.71%，略小于张建华54的黄豆苷的转化率为 95.3%，染料木苷 85.4%。 42第三章 结果与讨论 图 3-17 异黄酮测定标准图谱 Fig.3-17 Standard spectrum of isoflavone 图 3-18 制曲 48h 时异黄酮的含量 Fig.3-18 Isoflavone Content on the 48th hour of fermentation 43第三章 结果与讨论 图 3-19 后酵 15d 时异黄酮的含量 Fig.3-19 Isoflavone Content on the 15th day of fermentation 3.3.6.5 豆豉发酵过程中风味物质的变化 00.10.20.30.4012243648607284发酵时间(h)氨基氮含量(%) 图 3-20 发酵过程中氨基氮含量的变化 Fig.3-20 Changes of amino nitrogen contents during fermentation period 发酵时间对氨基氮含量的影响如图 3-20 所示，氨基氮含量可反映出蛋白的水解程度， 从图中的结果可看出相对于成品的氨基氮含量水平， 豆豉曲中氨基氮含量都不太高。但是随着制曲时间的延长，氨基氮的含量不断增加，60h 以后增长缓慢。 44第四章 结 论 第四章 结论 通过以上研究，得出如下结论： 1、从黑农 43、东农 690、合丰 25、期货、新绥农 14、新东农 690 这 6 种不同品种中选择出新绥农 14 为最佳原料，大豆蛋白含量为 41.09%（干重），异黄酮含量为黄豆苷 1.037 mg/g，染料木苷 0.850mg/g、黄豆素 0.008 mg/g、染料木素 0.004 mg/g。 2、微生物鉴定结果：筛选出的细菌为枯草芽孢杆菌；所选用的霉菌，通过观察菌株的菌落形态、菌丝形态、产孢结构，确定其为黄-米曲霉；枯草芽孢杆菌选择发酵 27h的种子液进行接种发酵。 3、豆豉发酵工艺的优化条件：枯草芽孢杆菌发酵豆豉的制曲优化条件为：发酵温度为 37，发酵时间为 48h，接菌量为 1%，豆豉纤溶酶活性 2.34cm(520.40IU/g) ；黄-米曲霉发酵豆豉的制曲优化条件为：发酵温度为 35，发酵时间为 48h，接菌量为 4%，-葡萄糖苷酶活性 0.174(31.8IU/100g)。双菌种混合制豆豉曲的优化条件为：发酵温度为36，发酵时间为 48h，最优接菌方式为同时接入枯草芽孢杆菌和黄-米曲霉。双菌种混合发酵豆豉的最佳后酵条件为：发酵温度 35，发酵时间 15d； 4、在枯草芽孢杆菌、黄-米曲霉菌、混合菌种最优制豆豉曲工艺条件下，随着枯草芽孢杆菌和黄-米曲霉的微生物量均在 48h达到最大，豆豉纤溶酶与-葡萄糖苷酶的相对活性也达到最大，分别为 2.45cm；0.178；2.35cm，0.268。同时混合菌种制曲 48h的pH值达到最大， 为 7.5； 水分含量从 12h的 58.7%降到 72h的 30.2%； 还原糖含量在发酵 24h达到峰值OD550 1.523， 即18.638mg/g； 在混合菌种制曲48h时， 黄豆苷的转化率为83.90%，染料木苷 55.41%；最佳后酵条件下，纤溶酶相对活性为 2.32cm(500.48IU/g)，黄豆苷的转化率为 86.31%,染料木苷 74.71%;氨基氮含量随着发酵时间的增加逐渐增大，在 72h达到 40%。 45参考文献 参考文献 1 蒋慕东，盖钧镒中国大豆应自主沉浮J中国食物与营养，2006，（8）：47 2 张士功，禾军，王道龙，等我国大豆生产和贸易现状及新形势下的发展对策研究J现代化农业，2001，265（8）：25 3 梅方权中国大豆发展战略分析J中国食品与营养，2001，（1）：1012 4 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