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第 4 4卷 2 0 1 6 年 2月 分析化学 ( F E N X I H U A X U E ) 研究报告 C h i n e s e J o u rna l o f An a l y t i c a l C h e mi s t r y 第 2期 2 3 22 4 0 D OI ： 1 0 1 1 8 9 5 j i s s n 0 2 5 3 - 3 8 2 0 1 5 3 5 C辅助的超高效液相色谱 三重 四极杆质谱联 用方法 精确分析毕赤酵母胞 内代谢物浓度 郭孟磊 刘晓云 黄明志 李敏超 储 炬 庄英萍 张嗣 良 ( 华东理工大学国家生化工程技术研究中心( 上海) ， 上海 2 0 0 2 3 7 ) 摘要毕赤酵母作为一种高效的外源蛋白表达平台， 其蛋白表达水平与胞内代谢物浓度紧密相关。但胞内 代谢物种类多、 物化性质差异大 、 浓度低、 周转快 ， 对其绝对浓度的精确检测一直难于实现。本研究将超高效 液相色谱 三重四极杆质谱联用分析方法与” c同位素标记技术相结合， 探索解决该难题的方法。首先 ， 优化 了超高效液相色谱的操作条件， 利用 3 种色谱柱实现了 6 4种常见中间代谢物的分离； 对三重四极杆质谱仪的 检测离子对和碰撞电压等操作条件进行优化， 找到了对各种物质具有专一性的检测离子对。然后 ， 利用全标 记” c标记底物培养细胞， 收集胞内的全标记代谢物用作定量内标物 ， 建立 了5 3种中间代谢物的标准曲线。 实验结果表明， 本方法不但精确性高， 标准曲线相关系数达到 0 9 9以上， 而且重现性好， 受实验条件和仪器操 作条件的影响很小。将本方法应用于毕赤酵母胞内代谢物浓度的绝对定量分析 ， 成功获得了胞内各种代谢物 的浓度水平， 为后续深入研究毕赤酵母代谢调控机理， 实现外源蛋白的高效生产奠定了基础。 关键词超高效液相色谱一 三重四极杆质谱；” C同位素标记； 代谢物浓度；毕赤酵母 1 引 言 毕赤酵母是一种高效的蛋白表达平台， 已用于 1 0 0 0多种外源蛋白的表达， 其表达水平与胞内代谢 物浓度紧密相关。掌握毕赤酵母胞内中间代谢物的浓度信息对理解其代谢调控机理， 实现外源蛋白的 高效生产具有重要意义 “ 。 中间代谢物具有种类多、 物化性质差异大、 浓度低和周转快等特点， 色谱 质谱联用技术已大量应用 于这些物质的定性与定量分析。常用的质谱定量方法包括气相色谱一 质谱法( G C M S ) 和液相色谱 质谱 联用法( L C M S ) 。气相色谱不适于分离强极性代谢物， 液相色谱一 质谱更适合于中间代谢物的定量分 析 。 ， 但其定量 性 能受 到 离子 抑 制效 应 和样 品前 处理 过 程 的 影 响。为 弥 补这 些 不 足 ， wu和 B e n n e t t 等提 出同位素稀释一 质谱定量法 ( 简称 I D MS ) ， 通过测量样 品的未标记代谢物 和作为 内标的 全标记代谢物的比值实现定量分析 j 。 I D MS已应用于大肠杆菌和面包酵母等多个细胞体系 ， m J 。已有研究者尝试将其引入到毕赤酵母 体系中， 如 C a r n ic e r 等H 对比了5种淬灭方法的影响， 发现温度一 2 7 、 甲醇含量 6 0 时效果最好； T r e d w e l l 等 分析了不同提取方法的影响 ， 指出沸乙醇提取方法具有优越性 ； J o r d 等_ 1 将其与非稳态 c 代谢通量分析技术相结合 ， 探讨了外源蛋 白表达对毕赤酵母胞 内代谢 的影响。尽管 I D MS理论上是 一 种准确度和精度较高的方法 ， 仍有多种因素可能会影响其定量性能。毕赤酵母的代谢活性很强 ， 在定 量分析其胞内代谢物浓度时， 与传统定量方法相比， 有关 I D MS方法的优势和不足 尚缺乏深人研究 。本研 究优化了L C M S M S 检测毕赤酵母胞内代谢物的操作条件， 建立各种代谢物的标准曲线， 评估 I D M S 方法 在定量分析不同代谢物时具有的优势和不足 ， 探讨实现毕赤酵母胞内代谢物浓度可靠检测的方法 。 2 实验部分 2 1 仪器与试剂 超高效液相色谱 三重四级杆串联质谱( T h e r m o F i s h e r 公司) ， A C Q U I T Y U P L C R B E H A m i d e色谱 2 0 1 5 -0 8 1 0收稿 ； 2 0 1 5 1 0 - 2 9接受 E ma i l ：2 4 9 5 3 3 9 6 9 q q c o rn 第 2 期 郭孟磊等： 辅助的超高效液相色谱- 三重四极杆质谱联用方法精确分析毕赤酵母胞内代谢物浓度 2 3 3 柱( 1 0 0 m m2 1 m m， 1 7 Ix m， Wa t e r s 公司) ； X s e l e c t 。M H S S T 3色谱柱( 1 5 0 m m2 1 m m， 3 5 m， Wa t e rs 公司) ； X s e l e c t mH S S T 3色谱柱( 1 0 0 mm2 1 mm， 1 8 I x m) ； 振荡器 ( T h e r m o F i s h e r 公 司) ； 移液 器( G I L S O N公司) ； S H Z D ( ) 循环水式真空泵( 上海予华仪器设备有限公司) ； 纤维滤膜( M i ll i p o r e 公 司) ； p H计( M e t t l e r T o l e d o 公司) 。 标准品和甲酸、 乙酸、 二甲基己二胺、 三丁胺、 甲酸铵等试剂( S i g m a 公司) ； 流动相甲醇、 异丙醇、 乙 腈、 超纯水( F i s h e r C h e m i c a l 公司) 。u c葡萄糖( C a m b r i d g e I s o t o p e L a b o r a to r ie s 公司) 。 2 2 菌种和培养条件 毕赤酵母 一 半乳糖苷酶生产菌株 G H L 。培养基组成为葡萄糖 2 0 g L ， M g S O 7 H O 1 4 9 g L ， K 2 s 0 4 1 8 2 g L ， 8 5 H 3 P O 4 2 6 8 mL L ， 无水 C a 2 S O 4 0 9 3 g L ， K O H4 1 3 g L ， 消泡剂( 1 ： 1 0 0 0 ， WV ) 。微 量元素溶液( 1 2 ： 1 0 0 0 ， V V ) 其中微量元素： K 1 0 0 8 g L ， C u S O 4 5 H 2 O 6 0 g L ， M n S O 4 H 2 0 3 0 g L ， F e S O 4。 7 H 2 0 6 5 0 g L ， H 2 S 0 4 ( 1 ： 2 0 0， ) ， N a Mo O 4 2 H 2 O 0 2 g L ， C o C 1 2 0 5 g L， Z n C 1 2 2 0 0 g L ， H 3 B O 4 0 0 2 g L ， 生物素 0 2 g L 。培养条件 ：接种量 1 0 ， 温度 3 0 C， p H 5 5 ， 每升发酵液 的通气量 1 Lrai n。 C全标记菌体的培养采用 u C葡萄糖为唯一碳源 ， 接种量 1 ， 空气 中 C O 用 N a O H溶液除去 ， 其它条件与上述相同。提取菌体胞内代谢物检测 u c代谢物所占比例， 发现其中仅含有极微量的 c 代谢物 ， 不影响化合物浓度的定量分析。 2 3 ” C全标菌体样品的处理 发酵结束后， 将 1 0 0 m L发酵液加入- 2 0 预冷的含有 5 0 0 mL 6 0 甲醇的补料瓶 中， 搅拌混匀后分 装到 3 0个试管 中， 每个试管 2 0 mL ， 4 C， 1 2 0 0 0 r m i n离心 1 0 m i n ， 弃上清液。在试管加入 7 0 预热的 2 0 m L 7 5 乙醇， 9 5 保温 1 0 m i n 。冷却至室温后， 4 、 以 1 2 0 0 0 r m i n离心 1 0 m i n ， 取上清液， 将 3 0支试管中上清液混合后再分装。 2 4 标记实验样品的处理 样品取 出后直接放人 2 7 C预冷的含有 3 m L 6 0 甲醇的试管灭活 ， 取样量为 1 mL 。用 0 8 I z m 纤维滤膜过滤， 去离子水清洗菌体； 滤膜与菌体均加人 7 0 C 预热的含有3 0 m L 7 5 乙醇的试管中， 9 5 C 保温 1 0 m i n ， 用于 定量 分 析 的样 品 同时还 加入 1 0 0 Ix L内标 。提 取代 谢 物后 将 滤膜 取 出， 4 q C， 以 1 2 0 0 0 r m i n 离心 1 0 mi n ， 取上清液 。上清液用快速旋转蒸发仪蒸干后- 8 0 保存待测 。 2 5 色谱条件 2 5 1 有机 酸 与磷酸 糖 类 采用 A c q u i t y T 3色 谱 柱 ( 1 5 0 m m 2 1 mm，1 8 I x m) 。流 动相 A： 5 m mo l L三丁胺 ， 1 5 m mo l L乙酸， 5 甲醇 ； 流动相 B： 异丙醇。柱温 ： 4 0 。梯度洗脱 ： 0 5 mi n ， 1 0 0 A ；51 6 mi n，1 0 0 一91 A ；1 6 1 9 mi n，91 一5 0A ；1 92 5 mi n，5 0A ；2 52 6 mi n， 5 0 一1 0 0 A。流速 0 2 m L m i n 。 2 5 2 核苷酸类采用 X s e l e e t T M H S S T 3色谱柱( 1 0 0 mm 2 1 mm， 1 8 I L m) 。流动相 A： 5 m mo l L三 丁胺 ，以甲酸调至 p H 4 9 5 ；流动相 B： 5 m mo l L三丁胺 ，1 0 0 A C N， 0 5 甲酸。柱温 ： 4 0 。梯度 洗脱 ： 0 3 0 m i n ，1 0 0 一 5 0 A。流速 0 2 mL m i n 。 2 5 3 氨基酸类采用 A C Q U I T Y U P L C R B E H A m i d e 色谱柱( 1 0 0 m m 2 1 m m， 1 7 m) 。流动相 A： 5 mm o l L三丁胺 ，以甲酸调至 p H 3 0 ；流动相 B： 5 m mo l L三丁胺 ， 8 5 A C N， 0 5 甲酸。柱 温 ： 4 0 。梯度洗脱 ： 0 3 0 ra i n ， 1 0 0 7 5 B 。流速 0 2 m L m i n 。 2 6 质谱条件 氨基酸的检测采用正离子模式 ：喷雾电压 3 5 k V，汽化温度 3 0 0 o 【 二 ，鞘气压 l 5 p s i ， 离子扫描气压 0 p s i ， 辅助气压1 O p s i ， 毛细管温度3 0 0 。 有机酸、 磷酸糖和核苷类物质的检测采用负离子模式： 喷雾电压 - 3 0 k V， 汽化温度 2 0 0 C， 鞘气压 1 5 p s i ， 离子扫描气压 0 p s i ， 辅助气压1 0 p s i ， 毛细管温度 2 0 0 C。 2 7 标准 曲线的建立 分别采用传统方法和 I D M S 方法进行胞内代谢物浓度的绝对定量分析。传统方法只利用标准品浓 2 3 4 分 析 化 学 第4 4卷 度与峰面积之间的对应关系建立标准曲线。采用 I D M S 方法时， 将不同浓度梯度的化合物标准品( 未标 记) 与 u “ c内标按 4 ： 1比例混合， 根据未标记代谢物与全标记代谢物的峰面积比值与标准品浓度建立 标准曲线。 2 8加标回收实验 回收率( ) 定义为： R ( ) = ( - 1 ) 1 0 0 ( 1 ) 其中， A C 是添加已知浓度 C标准品后与添加前测定值之差， A C是理论上添加前后的差值， ( 2 ) 其 中 C 。为未添加前代谢物浓度 ；V o 为未添加前样品体积 ；C 和 分别是添加标准品的浓度和体积 。 3 结果与讨论 3 1 色谱操作条件优化 胞内有机酸、 磷酸糖和核苷类物质由于极性大， p 蜒 值低， 存在同分异构体 ， 使得对该类化合物的分 离成为难题， 而氨基酸类物质极性差异大， p 值范围广， 也成为分离氨基酸的最大障碍。根据这 3类 物质性质的不同， 首先利用选择离子扫描模式 对色谱分离方法进行了优化， 利用 3 根色谱柱有效分 离了包括有机酸、 磷酸糖、 核苷类物质和氨基酸在内的6 4 种常见胞内代谢物( 图1 一 图3 ) 。质谱通过质 荷比来鉴别化合物， 但是不能区分同分异构体， 因此色谱分离至关重要 ， 本研究有效分离了上述几种化 合物， 尤其是实现了 G 6 P 、 F 6 P 、 M 6 P等同分异构体的分离， 为更有效鉴别代谢物奠定了基础。 ： j 。 j t ( ra i n ) 图 1 有机酸、 磷酸糖选择离子扫描总离子流图 F i g 1 T o t a l i o n e h r o ma t o g r a ms o f s u g a r p h o s p h a t e s a n d e a r b o x y l i e a c i d s 1 ，G l y o x y l i c a c i d； 2 ，P y r u v a t e ( P YR )； 3 ，L a c t i c a c i d ( L A C) ； 4，F u ma r a t e( F U M) ；5 ，S u c e i n a t e( s u c )； 6 ，Ma l a t e ( MAL ) ；7，n O x o g l u t a r a t e( AK G) ；8 ，C i t r a t e( c r r ) ；9，2 - P h o s p h o g l y c e r a t e( 2 P G) ；1 0，E r y t h r o s e - 4 p h o s p h a t e ( E 4 P) ；1 1 ，R i b u l o s e - 5 一 p h o s p h a t e ( R L 5 P)；1 2，R i b o s e - 5 - p h o s p h a t e(R 5 P) ；1 3 ，G l u c o s e - 6 一 p h o s p h a t e(G 6 P) ； 1 4， F r u c t o s e - 6 一 p h o s p h a t e( F 6 P )； 1 5， 6 - P h o s p h o g l u c o n a t e( 6 P G) ；1 6 ，S e d o h e p t u l o s e -7 一 p h o s p h a t e( S T P )；1 7，F r u c r o s e - 1 ， 6 - d i p h o s p h a t e( F B P ) 3 2 质谱仪操作条件优化 用标准品进行质谱操作条件优化， 获得了 6 4 种代谢物的专一检测离子对及最佳操作条件， 如表 1 所示。化合物在碰撞池中发生电离， 虽然不同的化合物电离方式不同， 但相似化合物电离方式具有相似 性， 例如磷酸糖类化合物特征离子多为P o ； 一 ， 有机酸类化合物以 羧基为主， 表l 给出了所有化合物子离 子分子式， 为后续代谢物的检测和合理选择标记化合物离子对提供了依据。 一 一 0 景P 皇 第 2 期 郭孟磊等： 辅助的超高效液相色谱一 三重四极杆质谱联用方法精确分析毕赤酵母胞内代谢物浓度 2 3 5 ： - ： - ： 一 ll 、 llllJ孟 。 ： 一 。 9 。l t ( rai n ) 图2 核苷类物质选择离子扫描总离子流图 F i g 2 T o t a l i o n c h r o ma t o g r a ms o f n u c l e o s i d e s 1 ，C y t i d i n e m o n o p h o s p h a t e ( C M P) ； 2 ，U r i d i n e mo n o p h o s p h a t e( U MP ) ； 3， A d e n o s i n e m o n o p h o s p h a t e( A MP ) ； 4，I n o - s i n e mo n o p h o s p h a ( I MP) ；5，G u a n o s i n e m o n o p h o s p h a t e( G MP) ；6 ，C y t i d i n e d i p h osp h a t e( C D P) ；7，A d e n o s i n e d i p h osp h a t e( AD P ) ； 8 ， I n o s i n e d h osp h a t e( I D P ) ； 9 ，A d e n osi n e t r i p h osp h a t e( AT P ) ；1 0 ， N i e o t i n a m i d e a d e n i n e d i n u c l e o fi d e n ed ( N AD) ； 1 1 ， Ni c o t i n a mi d e ade n i n e d i n u c l e o t i d e r e d u c e d( N A D P H) ；1 2 ，G u a n osi n e t r i p h o s p h a t e ( ) - - _ 一 - _ - 孑 o - 一- ( l2 - ll _ 1 L t ( rai n ) 图 3 2 0种氨基酸物质选择离子扫描总离子流图 F i g 3 T o t a l i o n c h r o ma t o g r a ms of 2 0 a mi n o a c i d s 1 ， G l y e i n e ( G l y ) ；2，A l a n i n e ( a ) ；3，S e fi n e ( S e r ) ； 4，P r o l i n e ( P r o ) ；5 ，V a l ；6，P ro l i n e ( T h O ，7 ，I s o l e u c i n e ( 玎 L E) ，L e u c in e( L e a ) ；8，A s p a r a g i n e ( A s n) ；9 ，O r n i t h i n e(O r n )；1 0 ，A s p a r a t e ( A s p) ；1 1 ，G l u t a mi n e( G i n ) ； 1 2 ，L y s in e ( L y s ) ；1 3， G l u t a m a t e ( G l n ) ；1 4，M e t h i o n i n e ( Me t ) ；1 5，H i s t id in e ( H i s ) ；1 6，A m i n o a d i p i c a c i d( A 从 ) ； 1 7。 P h e n y l a l a n i n e( P h e ) ；1 8， A r g i n i n e( A r s ) ；1 9 ，T y r osi n e( ) ； 2 0， T y r p t o p h a n ( T r p ) 3 3 标准曲线 从表2可见， 对于大多数物质而言， 基于 c内标的标准曲线的线性系数要好于传统的 C方法。 但是部分物质， 如 C D P ， S U C ， O X A和部分氨基酸， C方法所得的线性系数反而小于 c方法。究其原 因， 可能是这些物质提取时在胞内降解太快， 可保留用作” C内标物的量较少， 导致内标峰面积的测定 误差变大 ， 使得其线性系数反而变小 ， 有些化合物的 I D MS标准曲线甚至无法建立。 理论上， 标记代谢物与未标记代谢物具有色谱同一性， 因此基于 c内标的标准曲线方程的斜率只 与该u C 代谢物在标记细胞中的含量和稀释比例有关。 在进样量确定时， 两者保持不变， 标准曲线斜 一 一 曩_P 蛊 r I 一 一 0 口 爵 I I 2 3 6 分 析 化 学 第 4 4卷 表 1 S I M检测离子对 Ta b l e 1 I o n p a i r o f S I M 编号 化合物 子 ecu 式 l N u mb e r Co mp o u n d u l a 怨 蔫 誉 P olarit Fra gm ene-F ragm 片en( m lz) (m ) ( )7 ? b u 协 Gl Al S e r P r o T h r Va l As n As p I l e L e u 0m Gi n Gl u L v s Me t Hi s AAA P h e Ar g Ty r Tr p Tr p Cv s t i n e Gl y o x y l i c PYR L AC F UM S UC 0XA MAL AKG PE P G3 P S EM 2 P G CI T E4 P R5 P RL5 P G6 P F 6 P G1 P M6 P 6 PG s 7 P FB P C MP UMP c AMP AMP I MP GMP CDP C 2 H5 O2 N C3 H7 O2 N C3 H7 O3 N C5 H9 O2 N C4 H9 O3 N C 5 HI 1 O2 N C4 H8 O3 N C4 H7 O4 N C 6 Hl 3 O2 N C5 H1 2 N2 O2 C5 H1 0 O3 N2 C5 H9 O4 N C6 Hl 4 O2 N2 C5 Hl 1 O2 NS C6 Hl 1 N3 O2 C6 Hl 1 NO4 C9 Hl 1 NO2 C 6 Hl 4 N4 O2 C9 Hl 1 NO3 Cl 1 H1 2 N2 O2 Cl 1 H】 2 N2 O2 C 6 H1 3 N2 O4 S 2 C2 H2 O3 C3 H4 O3 C3 H6 O3 C 4 H4 O4 C4 H6 O4 C 4 H4 O5 C4 H6 O5 C 5 H6 O5 C3 H6 O6 P C3 H7 O6 P C7 H1 0 O5 C3 H7 O7 P C 6 H9 O7 C4 H9 O7 P C5 Hl 1 O8 P C5 Hl l O8 P C6 H1 3 O9 P C6 Hl 3 O9 P C6 Hl 3 O9 P C6 Hl 3 O9 P C6 H1 3 O1 0 P C7 H J 5 O】 0 P C6 H14O1 2 P 2 C 9 H1 4 N3 O8 P C 9 Hl 3 N2 O9 P C1 0 H1 2 N5 O6 P Cl 0 H1 4 N5 O7 P C1 o Hl 3 N4 O8 P C1 0 H1 4 N5 O8 P C 9 Hl 5 N3 Ol 2 P 2 1 7 6 2 2 9 2 3 O 2 1 3 2 1 8 2 4 8 2 1 9 2 6 2 2 5 6 2 1 4 2 1 1 2 6 2 2 1 5 2 5 7 2 3 2 2 6 3 6 5 7 2 1 6 2 5 9 8 7 5 8 71 2 6 8 l 1 2 8 1 1 7 0 1 0 2 0 1 3 9 6 1 3 8 O 1 3 9 7 1 4 1 4 1 4 3l 1 4 8 2 1 O 9 8 8 O 6 1 O 1 5 1 4 5 8 1 0 6 6 1 O 3 3 1 0 3 3 9 3 3 9 4 2 9 3 4 9 3 4 8 3 4 9 7 7 9 0 2 2 O 9 2 0 9 5 6 9 4 9 4 2 1 9 4 4 5 2 1 2 7 6 1 3 4 9 O 1 1 7 1 0 6 1 4 0 1 1 6 1 4 9 1 1 8 1 3 6 l 1 8 1 5 5 1 3 1 1 3 9 1 3 2 1 2 3 1 3 2 1 6 5 1 3 3 1 7 0 1 4 5 1 51 1 4 6 1 2 4 1 4 7 1 5 4 1 5 O 1 2 5 1 5 6 1 2 9 1 6 0 1 3 8 1 6 6 1 41 1 7 5 1 7 3 1 8 2 1 4 4 2 0 3 1 6 9 2 0 5 1 5 9 2 41 1 1 2 7 3 1 1 9 8 7 1 2 5 8 9 1 3 8 1 1 5 0 9 3 1 1 7 1 1 4 1 31 0 6 0 1 3 3 1 0 1 1 4 5 1 0 4 1 6 7 0 6 0 1 6 9 0 8 3 1 7 3 0 9 4 1 8 5 0 4 4 1 91 1 0 1 9 9 O 81 2 2 9 0 7 7 2 2 9 0 8 7 2 5 9。 0 7 9 2 5 9 0 8 9 2 5 9 1 0 6 2 5 9 1 2 2 2 7 5 O 7 6 2 8 9 1 0 3 3 3 9 0 51 3 2 2 1 3 3 3 2 3 1 1 5 3 2 8 1 3 7 3 4 6 1 5 3 3 4 7 1 2 3 3 6 2 1 3 6 40 2 1 1 4 5 9 1 4 7 3 0 3 6 0 1 8 7 0 1 9 7 4 2 4 7 2 2 1 1 3 2 8 8 8 1 8 8 6 2 7 0 1 9 l 2 7 3 2 1 2 8 1 7 8 4 1 7 1 3 3 1 2 1 1 0 1 5 1 1 6 2 2 1 2 0 1 6 7 0 1 8 9 1 1 6 1 1 6 1 5 1 8 8 1 9 1 5 2 O 5 4 5 1 7 4 3 1 6 4 3 1 6 71 1 9 7 3 1 5 8 7 0 3 I 1 5 O 6 1 01 1 1 7 9 1 1 7 9 1 5 9 3 0 7 7 9 0 4 l 1 1 1 0 5 7 9 1 4 7 9 0 3 7 9 O 5 7 9 0 3 7 9 0 4 7 9 1 2 7 9 1 2 7 9 0 3 8 7 9 0 5 3 7 9 0 3 4 7 9 1 0 8 7 9 1 1 1 3 4 1 9 7 9 1 3 7 9 0 7 7 9 1 1 7 9 1 1 3 8 3 5 3 7 4 7 4 2 4 2 4 8 31 3 6 4 0 5 7 3 6 3 7 4 0 4 9 2 7 4 9 5 7 5 0 6 4 7 6 5 7 5 8 3 3 5 0 4 4 4 4 1 2 4 0 3 3 3 5 3 2 6 7 4 9 3 8 5 0 5 7 4 9 6 O 6 7 6 0 6 4 6 5 6 3 6 5 9 5 6 9 8 4 8 4 8 9 9 0 1 6 6 + + + + + + + 上 C2 H2 02 C 3 I 4 4 O2 C2 H5 ON C4 H7 ON C3 H9 ON C 4 H9 N C4 H5 03 N C 3 H7 O2 N C 5 Hl 1 N C4 H7 N C 5 H8 O2 N2 C 5 H7 03 N C5 H9 N C5 H8 O2 S C5 H9 N3 C 5 H“NO2 C8 H9 N C3 H8 NO2 C8 H7 N CH9 NO2 C3 H6 NO2 S 2 C H2 02 C2 H4 0 C2 H4 0 C 3 H4 0 2 C 3 H6 O2 C 3 H4 03 C 4 H4 04 C 4 H6 03 C3 H6 O3 PO PO C 5 H5 03 P 0， PO3 P 0 PO PO P O PO P O P O1 P O P O， P O C5 N5 H4 P O P O1 P O NH NH C 02 H2 C O2 H2 C0 C O2 H2 H 0 C 0 CO2 H2 COOH，NH4 H O H O C00H ， NH4 NH， CO2 H2 CO ， C02 H2 C6 H4 O C 3 H5 O2 N NH C 3 H7 O2 N C0 CO， CH2 O2 C0， C0 CO， H2 O CO， PO C 3 H7 O3 C 3 H7 04 CO2， 2 H2 O C4 H9 0 4 C5 Hl 】 O5 C5 HI 1 O5 C6 HI 3 O6 C6 H1 3 O7 C6 H1 3 O8 C6 H1 3 O9 C6 H1 3 O 7 C7 H1 5 0 9 P C6 H1 4 N3 O5 C9 Hl 4 N3 O5 P C9 H1 3 N2 O3 C 5 Hs O6 P C】 0 H1 4 N5 O4 C1 0 H1 3 N4 O5 C1 0 H1 4 N5 O5 P Os C9 H1 5 N3 O9 P + + + 一 十 一 一 + + m n 9 “ 8 8 6 6 7 9 m 弛 M 粥 2 3 4 5 6 7 8 9 m M ” 加 “ 弘 甜 舵 们 钉 铝 第 2期 郭孟磊等 ： 辅助的超高效液相色谱一 三重四极杆质谱联用方法精确分析毕赤酵母胞内代谢物浓度 2 3 7 续表 1 ( C o n ti n u e d t o T a b l e 1 ) 表 2 标准曲线相关系数( 值) T a b l e 2 C o r r e l a t i o n c o e ff i c i e n t s( R 2 v alt l e 8 )o f c a l i b r a t i o n l i n e s 代谢物 基 于”C 基于 C 内标 代谢物 基 于” C 基于 C 内标 Me t a b o l i t e 1 3 C b a s e d 1 2 C b 8 s e d I n t e rn a l s t a n d a r d Me t a b o l i t e 1 3 C b a s e d C_ b a s e d I n t e rn a l s t a n d a r d CDP O 9 9 4 5 0 9 9 71 CDP FUM 0 9 9 6 3 0 9 9 7 2 F UM ADP 0 9 9 7 9 0 9 9 7 3 ADP S UC 0 9 91 5 0 9 93 3 S UC I DP 0 9 9 9 1 0 9 91 6 I DP 0XA 0 9 9 7 7 0 9 9 9 6 0XA PYR 0 9 9 7 9 0 9 9 7 5 P YR G6 P 0 9 9 9 6 0 9 9 91 G 6P L AC n d 0 9 9 31 一 I 6 P 0 9 9 7 6 0 9 9 7 0 S 7 P 率就不会发生变化， 因此该斜率不会随仪器状态和不同的分析样品批次的变化而变化， 而挖 c方法因缺 少内标物 ， 峰面积会发生一些变化 ， 从而影响其斜率。为了验证 ， 依照上述方法做出标准曲线 ， 连续测量 4次， 得到不同进样批次之间标准曲线斜率的变化情况( 表 3 ) 。从表 3可知 ， ” c法标准曲线 比 C法具 有更好 的稳定性 。 表3 4次重复实验中标准曲线的斜率及其 9 5 的置信区间 T a b l e 3 S l o p e s a n d t h e i r 9 5 c o n fi d e n c e s i n t e r v a l s i n f o u r L C- E S I - MS MS r u n s 3 4回收 率 表4 给出了部分化合物的回收率偏差， 从回收率偏差上可以看出， I D M S 方法回收率偏差小于传统 C方法 ， 证明本方法的优越性和重要性。 3 5 毕赤酵母胞 内代谢物定量分析结果 不同菌株的细胞在不同生长状态下其胞内代谢物浓度存在一定的差异， 但是对于特定种类生物而 言， 其胞内代谢物浓度水平和细胞的容量具有相似性。 将I D M S 方法与传统 c ( L a c ， A s p 等) 方法相结 2 3 8 分 析 化 学 第4 4卷 ： m o l g细胞 干重( I L mo l g d r y c e l l w e i g h t ，D C W) 。 合 ，能更完整地测定毕赤酵母胞 内代谢物。图 4给 出了毕赤酵母胞 内代谢物的定量结果 ， 无论是胞 内 各种代谢 物 的浓 度水 平 ，例 如有机 酸、 磷 酸糖 ( 0 0 15 0 Ix m o l g细胞干 重 ( D C W) ) 、 核 苷类 物质 ( 0 0 11 0 I x m o l g D C W) 、 游 离 氨 基 酸 ( 0 11 0 0 t x mo l g D C W) ， 还 是 胞 内游 离 氨 基 酸 的 总 量 ( 3 7 8 0 2 tx m o l g D C W) ， 或者不同氨基酸在毕赤酵母胞内的百分含量， 都与文献 1 2 ， 1 5 ， 1 6 报道一致， 说 明了本定量方法的可靠性。 冬鸯 图4 毕赤酵母 G H L胞内代谢物浓度( Ix m o l g细胞干重) F i g 4 I n t r a c e l l u l a r me t a b o l i t e s c o n c e n t r a t i o n i n Pi c h i a p a s t o r i s GHL I n t r a c e l l u l a r c o n c e n t r a t i o n o f me t a b o l i t e s p o o l s a r e g i v e n i n Ix mo l g DC W A： 有机酸和磷酸糖 ；B： 核苷类物质 ；C：氨基酸 。 A ：S u g a r p h o s p h a t e s a n d c a r b o x y l ic a c i d s ；B：Nu c l e o s i d e s ；C ：Ami n o a c i d s 5 0 5 O 5 O 2 0 7 5 2 ( ，1 ， 【0 g J ( 8l I 1 0 q B 苗g一 第2 期 郭孟磊等： 辅助的超高效液相色谱 三重四极杆质谱联用方法精确分析毕赤酵母胞内代谢物浓度 2 3 9 4 结 论 比较了 I D M S方法与传统定量方法在毕赤酵母胞内代谢物定量分析方面的优劣 ， 说明了 I D MS 方法 的优越性， 但是也不能忽略传统方法在测量可快速降解代谢物方面的作用， 将两者结合， 将使得毕赤酵 母胞内代谢物的定量分析更加精确完整， 为后续深入研究毕赤酵母代谢调控机理， 实现外源蛋白的高效 生产奠定了基础。 I f e r e nc e s 1 F a n H， L i S P ， X i a n g J J ，L a i C M， Y a n g F Q，G a o a J L ， 2 O g a w a T，Wa s h i o J，T a k a h a s h i T，E c h i g o S，T a k a h a s h i N 1 1 8 ( 2 ) ： 2 1 8 2 2 5 Wa n g Y T A n a 1 C h i mA c t a ， 2 0 0 6， 5 6 7 ( 2 ) ： 2 1 8 2 2 8 O r a l S u r g Or a 1 Me d O r a 1 P a t h o 1 O r a 1 R a d i o 1 ，2 0 1 4， 3 X i a M L H u a n g D， L i S S ， We n J P ， J i a X Q， C h e n Y L B i o t e c h n o 1 B i o e n g ， 2 0 1 3 ，1 1 0 ( 1 0 ) ： 2 7 1 7 2 7 3 0 4 Wa s y l e n k o T M， S t e p h a n o p o u l o s G B i o t e c h n o 1 B i o e n g ， 2 0 1 4 ，1 1 2 ( 3 ) ： 4 7 0 4 8 3 5 B u c h h o l z A， T a k o r s R， Wa n d r e y C A n a 1 B i o c h e m ， 2 0 0 1 ， 2 9 5 ( 2 ) ：1 2 9 - 1 3 7 6 v a n D a m J C，E m an M，F r a n k J ，L a n g e H C ，v a n D e d e m G W K，H e ij n e n S J A na1 C h i m A c t a ， 2 0 0 2 ， 4 6 0 ( 2 ) ： 2 0 9-21 8 7 wu L ， Ma s h e g o M R， v a n D a m J C， P r o e l l A M， V i n k e J L， R a s C ，v a n Wi n d e n W A，v a n G u l i k W M，H e n e n J J A na1 B i o c h e m ， 2 0 0 5 ， 3 3 6 ( 2 ) ：1 6 4 1 7 1 8 B e n n e t t B D， Y u a n J ，K i m b a l l E H， R a b i n o w i t z J D N a t u r e P r o t o c o l s ， 2 0 0 8 ， 3 ( 8 ) ： 1 2 9 9 - 1 3 1 1 9 H e l l e r s t e i n M K， N e e s e R A A m P h y s i o l ， 1 9 9 9， 2 7 6 ( 6 ) ：l l 4 6 1 1 7 0 1 0 Mc C l o s k e y D。Ga n g o i t i G A ，K i n g Z A ，N a v i a u x R K， B a r s h o p B A ， P a l s s o n B O，F e i s t A MBi o t e c h n o 1 Bi o e n g ， 2 0 1 4， l 1 1 ( 4 ) ： 8 0 3 8 1 5 1 1 C a r n i c e r M， C a n e l a s A B， P i e r i c k A， Z e n g Z， D a m J ， A l b i o l J ， F e r r e r P ，H e n e n J J ，G u l i k WMe t a b o l o mi c s ， 2 0 1 2 ， 8 ( 2 ) ： 2 8 4 2 9 8 1 2 T r e d w e l l G D ，E d w a r d s J o n e s B ， L e a k D J ，B u n d y J G P L o S O n e ， 2 0 1 1 ， 6 ( 1 ) ： e 1 6 2 8 6 1 3 J o r d i a J ， R o j a s H C， C a mi c e r M， wa J l l A， F e r r e r P ， A l b i o l J Me t a b o l i t e s ， 2 0 1 4 ， 4 ( 2 ) ： 2 8 1 2 9 9 l 4 L I Mi n C h a o。HUANG Mi n g Z h i ，L I U Yu - We i ，C HU J u，Z HUANG Yi n g - P i n g ，Z HANG S i L i a n g C h i nes e I， A na 1 C h e m 2 0 1 4 ， 4 2 ( 1 0 ) ：1 4 0 8 1 4 0 3 李敏超，黄明志， 刘玉伟， 储 炬 ， 庄英萍， 张嗣良分析化学， 2 0 1 4 ， 4 2 ( 1 0 ) ：1 4 0 8 1 4 0 3 1 5 J o r d i a J ， S u a r e z C， C a r n i c e r M，t e n P i e r i c k A，H e n e n J J ，G u l i k W， F e r r e r P， A l b i o l J ，Wa h l A B MC B i o 1 ， 2 0 1 3， 7 ( 1 ) ：l 一 1 6 1