GB-T 13080.2-2005 饲料添家剂蛋氨酸铁(铜、锰、锌)螯合率的测定 凝胶过滤色谱法.pdf

I C S 6 5 . 1 2 0B 4 6通 ,中 华 人 民 共 和 国 国 家 标 准GB / T 1 3 0 8 0 . 2 - 2 0 0 5饲料添加剂蛋氨酸铁( 铜、 锰、 锌)鳌合率的测定凝胶过滤色谱法F e e d a d d i t i v e -De t e r mi n a t i o n o f c h e l a t i o n p e r c e n t a g e o f i r o n , c o p p e r ,m a n g a n e s e a n d z i n c m e t h i o n i n e -G e l f i l t r a t i o n c h r o ma t o g r a p h y2 0 0 5 - 0 9 - 0 5发布2 0 0 6 - 0 2 - 0 1实施中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局中 国 国 家 标 准 化 管 理 委 员 会发 布GB / T 1 3 0 8 0 . 2 -2 0 0 5月 g舌 本标准是在国内生产实际基础上研究制定的。 本标准由全国饲料工业标准化技术委员会提出并归口。 本标准起草单位: 国家饲料质量监督检验中心( 武汉) 、 长沙兴嘉生物工程有限公司、 广州康瑞德生物技术有限公司。 本标准主要起草人 : 杨林、 杨海鹏、 杨先奎、 刘贤荣、 黄逸强、 陈玻、 钱沁。GB / T 1 3 0 8 0 . 2 -2 0 0 5饲料添加剂蛋氨酸铁( 铜、 锰 、 锌)鳌合率的测定凝胶过滤色谱法范围 本标准规定了用凝胶色谱法测定蛋氨酸、 经基蛋氨酸与可溶性铁、 铜、 锰、 锌盐反应生成的赘合物鳌合率的方法 本标准适用于蛋氨酸铁 、 蛋氨酸铜、 蛋氨酸锰、 蛋氨酸锌、 经基蛋氨酸铁、 经基蛋氨酸铜、 经基蛋氨酸锰、 经基蛋氨酸锌等鳌合物赘合率的测定。规范性 引用 文件 下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注 日期的引用文件， 其随后所有的修改单( 不包括勘误的内容) 或修订版均不适用于本标准， 然而， 鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件， 其最新版本适用于本标准。 G B / T 6 6 8 2 分析实验室用水规格和试验方法( n e q I S O 3 6 9 6 : 1 9 8 7 ) G B / T 1 3 8 8 5 饲料中铁、 铜、 锰、 锌、 镁的测定原子吸收光谱法 G B / T 1 4 6 9 9 . 1 饲料采样原 理 试样在水中加热、 离心后， 分成沉淀和溶液两部分。溶液中所含的可溶性氨基酸鳌合物及金属离子经过凝胶分离， 在 规定条件下洗脱， 金属离子形成氢氧化物沉 淀， 将固定在凝胶柱顶端无法洗脱， 可溶性氨基酸鳌合物则可通过配体氨基酸的携带从凝胶柱上洗脱下来， 实现和金属离子的分离; 可溶性氨基酸赘合物洗脱分离完成后， 加人 E D T A溶液洗脱， 使金属离子从色谱柱上洗脱。用原子吸收光谱法测定沉淀态氨基酸赘合物、 可溶性氨基酸鳌合物及金属离子的含量， 分别计算出沉淀态氨基酸鳌合物、 可溶性氨基酸鳌合物占金属元素总量的比例即可计算出相应的氨基酸鳌合物的鳌合率试剂和溶液 实验用水应符合G B / T 6 6 8 2 中二级用水的规格。所用试剂除特殊规定外， 均为分析纯。4 . 1 氢氧化钠溶液 c ( Na O H) =0 . 1 m o l / L : 称取 2 . 0 0 g 氢氧化钠溶于5 0 0 ml, 水中， 混匀。4 . 2 硼酸溶液 c ( H, B O O=0 . 4 m o l / L 习 :称取 1 2 . 2 8 g 硼酸溶于 5 0 0 m l _ 水中， 混匀。4 . 3 氯化钾溶液 c ( K C D=0 . 2 m o l / L : 称取 7 . 4 5 5 g氯化钾溶于 5 0 0 mL水中水， 混匀。4 . 4 洗脱液的配制4 . 4 , ， p H7 . 。的洗脱液: 分别量取 1 . 0 m L氢氧化钠溶液( 4 . 1 ) , 1 2 . 5 mL硼酸溶液( 4 . 2 ) , 1 2 . 5 mL氯化钾溶液0 4 . 3 ) ， 注人 1 0 0 ml ， 容量瓶， 用水稀释至刻度4 . 4 . 2 p H9 . 0的洗脱液: 分别量取 2 0 . 8 mL氢氧化钠溶液( 4 . 1 ) , 1 2 . 5 ml硼酸溶液( 4 . 2 ) , 1 2 . 5 mL氯化钾溶液( 4 . 3 ) ， 注人 1 0 0 mL容量瓶， 用水稀释至刻度。4 . 4 . 3 p H1 0 . 。的洗脱液: 分别量取 4 3 . 7 mL氢氧化钠溶液( 4 . 1 ) , 1 2 . 5 mL硼酸溶液( 4 . 2 ) , 1 2 . 5 mL氯化钾溶液( 4 . 3 ) ， 注人 1 0 0 m工容量瓶， 用水稀释至刻度。4 . 5 乙二胺四乙酸二钠( E D T A) 溶液 c ( E D T A) =0 . 1 mo l / L : 称取 3 7 . 2 g乙二胺四乙酸二钠加热溶于 1 0 0 mL水中， 混匀。G B/ T 1 3 0 8 0 .2 -2 0 0 54 . 6 葡聚糖凝胶: G - 1 5 ,4 . 7 盐酸溶液: 将 1 体积的盐酸加人到 1 0体积的水中， 混匀。5仪器5 . 1 恒温水浴锅: 3 0 0C - 8 0 可调5 . 2 原子吸收分光光度计: 波长范围 1 9 0 n m-9 0 0 nn5 . 3 离心机:3 0 0 0 r / mi n .5 . 4 色谱柱: 长 3 0 0 m m， 内径9 mme5 . 5 恒流泵。6 试样 制备 按G B / T 1 4 6 9 9 . 1 取有代表性的样品至少2 k g ， 用四分法缩减至约2 5 0 g ， 粉碎过 。 . 4 2 mm孔筛，混匀， 装人样品瓶内密闭保存， 备用。7测定步骤7 . 1 试样预处理 称取试样约 0 . 5 g ， 精确到 0 . 0 0 0 2 g , 置于 2 5 m L离心管中， 加人 1 5 mL水， 于 6 0 水浴中加热3 0 m i n ， 不时搅拌， 使试样充分溶解， 用离心机于 3 0 0 0 r / mi n离心 1 0 mi n 。将上清液小心移人 2 5 mL容量瓶中， 沉淀分别用 4 m L热水( 6 0 0C) 洗涤、 离心三次， 上清液一并移人 2 5 m L容量瓶中， 定容， 得到可溶性氨基酸赘合物及游离金属离子溶液， 称为溶液 A。沉淀用 1 0 mL盐酸溶液( 4 . 7 ) 溶解， 转人另一2 5 mL容量瓶中， 用水稀释至刻度， 得沉淀态氨基酸鳌合物溶液， 称为溶液B ,7 . 2 凝胶色谱7 . 2 . 1 凝胶的制备 称取约1 0 g G - 1 5 凝胶( 4 . 6 ) 于5 0 m L 水中， 室 温下溶 胀3 h 以上， 配 制成凝胶悬浮液。7 . 2 . 2 凝胶的装柱及平衡 将色谱柱垂直安装在无直接光照射处， 加人 p H7 . 0 ( 4 . 4 . 1 ) 洗脱液， 除去气泡， 气泡除尽后立即关闭出口开关。沿玻璃棒将排尽气泡的凝胶悬浮液( 7 . 2 . 1 ) 一次倾人色谱柱内， 待凝胶全部倾人柱内后，开启柱下面的出口 开关， 使凝胶自 然沉降( 注意不得流干) ， 控制 凝胶部分长度在1 5 c m -2 0 c m 接上恒流泵， 开启柱下面出口开关， 用约5 0 m L p H7 . 0 洗脱液( 4 . 4 . 1 ) 洗涤凝胶柱。7 . 2 . 3上样 排出洗脱液至凝胶表面近于流干， 关闭出口开关。用吸管移取 0 . 2 mL溶液 A( 7 . 1 ) ， 吸管口离凝胶表面约 1 mm， 小心加人， 使之均匀渗人凝胶表面。打开出口开关， 用少量洗脱液小心洗涤柱壁周围及残留在凝胶表面的样品。注人洗脱液， 并接上恒流泵。测定铜、 铁、 锌的鳌合物时， 用 p H9 . 0 洗脱液( 4 . 4 . 2 ) ; 测定锰的赘合物时， 用 p H 1 0 . 。洗脱液( 4 . 4 . 3 ) 07 . 2 . 4 洗脱分离7 . 2 . 4 . 1 可溶性鳌合金属元素的分离 用相应 p H的洗脱液洗脱， 流速为 。 . 7 mL / min ， 收集洗出组分约 1 0 0 mL ， 定容至 1 0 0 mL ， 得可溶性氨基酸 鳌吾物溶液， 称为溶液C ,7 . 2 . 4 . 2 游离态金属离子的分离 可溶性氨基酸鳌合物分离完成后， 在色谱柱顶端用吸管移人1 m L E D T A溶液( 4 . 5 ) ， 用p H 7。 洗脱液( 4 . 4 . 1 ) 继续洗脱， 合并所有洗出组分， 定容至 1 0 0 m L， 得金属离子溶液， 称为溶液 D,8测定 将上述溶液 A( 7 . 1 ) , 溶液 B ( 7 . 1 ) , 溶液C ( 7 . 2 . 4 . 1 ) , 溶液 D ( 7 . 2 . 4 . 2 ) 稀释至一定浓度( 稀释倍数GB / T 1 3 0 8 0 . 2 -2 0 0 5视含量而定) ， 按 G B / T 1 3 8 8 5上机测定， 分别测定溶液中金属元素的含量。9鳌合率的计算氨基酸赘合物鳌合率按式( 1 ) 计算:C A V、C l ,VfC B VgCA VA+CB VBC Vc+Cp VpC A VA+ 偏VBX 1 0 0 (1) 式中 : X氨基酸鳌合物赘合率， %; C A , C B , C C , C D 分别为A , B , C , D 溶液中金属离子的含