乙型、丙型、庚型肝炎病毒多重感染研究

1 / 10 乙型、丙型、庚型肝炎病毒多重感染研究 【摘要】 目的 探讨庚型肝炎感染患者是否存在双重感染和多重感染。方 法 应用庚型肝炎病毒 (HGV)NS3 区逆转录聚合酶链反应技术检测了 HGV 系列稀释的 质控血清及 Abbott GBV-C 参比样品中 HGV RNA，并对 90例丙型肝炎病毒 (HCV)RNA 阳性和 12 例乙型肝炎、丙型肝炎双重感染献血员进行了HGV RNA 的检测。结果 HGV 系 列稀释质控血清 10-1 10-5 均为阳性； 10-6 为阴性。 2份 Abbott GBV-C 样品均为 HGV RNA 阳 性。 90 例 HCV RNA 阳性样品中， 8 例 HGV RNA阳性 (17.8%)； 12 例乙、丙 双重感染者中 4 例 (4/12)HGV RNA 阳性。结论 不仅存在HCV 及 HGV 双重感染，也存在 多重感染。 【关键词】 肝炎病毒，庚型 肝炎病毒，丙型 逆转录聚合酶链反应 Studies on Multiple Infection with Hepatitis B, C and G Viruses Du Shaocai, Tao Qimin, Chang Jinghong, et al. Institute of Hepatology, 2 / 10 Peoples Hospital, Beijing Medical University, Beijing 100044 【 Abstract】 Objective To study if there exists superinfection and multiple infection in the patients with hepatitis G virus (HCV) infection. Methods Reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR) technique in non-structural gene 3 (NS3) region of HGV was used to detect HGV RNA in serially diluted quality control sera and HGV-C reference panel of samples provided by Abbott Co. Ltd, in 90 cases with positive hepatitis C virus (HCV) RNA, and 12 blood donors with super-infection of hepatitis B virus (HBV) and hepatitis C virus (HCV). Results Serially diluted quality control sera showed positive for HGV RNA at dilutions of 10-1to 10-5, but negative at dilutions of 10-6 to 10-8. HGV RNA was positive in two samples of HGV-C serum provided by Abbott Co. HGV RNA was positive in eight of the 90 cases with positive HCV RNA and in four of the 12 cases 3 / 10 with super-infection with HCV and HBV. Conclusion There are not only super-infection of HBV and HCV, but also multiple infection. 【 Key words】 Hepatitis G virus Hepatitis C virus Reverse transcription polymerase chain reaction 自从 1995 年美国 Simons 等及 Linnen 等证实存在庚型肝炎病毒 GBV- C 和 HGV 以来，引起了广大研究人员的极大重视。日本、西欧、澳大利亚、中国 等均有庚型肝炎病毒的存在。通过基因序列分析研究证实， GBV-C 和 HGV 两者具有 高度的同源性，为庚型肝炎病毒的不同株，一些流行病研究资料也证实，庚型肝 炎病毒与丙型肝炎病毒具有相同的传播方式。本文对 90例 HCV RNA 阳性的患者血 清及 10 例抗 -HCV 阳性的献血员进行了双重感染研究，结果如下： 材料与方法 一、材料 1.血清样品： 90 例 HCV RNA 阳性样品来自本院的门诊病人。 4 / 10 2.HGV RNA 质控血清来自我国河北地区 HBsAg 阳性献血员，并经日本自治医 科大学证实 HGV RNA 阳性。 3.GBV-C参照血清： 07648F9及 52953： 236血清均由 Abbott赠送。 4.HGV NS5 区 PCR 试剂盒来自本 研究所。 5.HGV NS3 区 PCR 试剂盒由本研究所生产， HGV NS3 区外引物序列按文献报道合 成，内引物正链 5 -CATTCVAAGGCGGAGTGYGC-3 ，负链 5 -TCYT TACCCCTRTAATAGGC-3 。 6.HCV RNA PCR 试剂盒由本研究所提供，按文献方法进行。 7.HBV 免疫 PCR 试剂盒由本研究所提供，按文献报道方法进行。 8.HBsAg EIA 试剂盒上海科华生物公司产品。 9.HBeAg、抗 -HBe EIA 试剂盒为本研究所产品。 二、方 法 1.HGV NS3 区 PCR：采用异硫氢酸胍裂解法， HGV RNA 提取方法及 PCR 程序如 下： (1)提取 RNA：取血清 20 l 加裂解液 (含异硫氢酸胍 )80 5 / 10 l ，混匀后置室温 5 分钟，加入氯仿：异戊醇 (491)40 l ，稀释液 (含RNasin)80 l ， 10 000 r/min 离心 10 分钟，吸取上清液 100 l ，加入等体积异丙醇 (或-20 保存 )， 12 000 r/min 离心 15 分钟，吸去上清，沉淀物含 HGV RNA。 (2)逆转录：在上述含 HGV RNA 原管内加入逆转 录反应混合液 (含 AMV Buffer dNTP 及 HGV 引物 )10 l ， 70 1 2 分钟后，加入 AMV反转录酶 3 4 个单位， 42 40 分钟后即可进行 PCR 扩增。 (3)第一次 PCR：在逆转录原管内加入第一次 PCR 反应混合液 (含缓冲液、引物 及 1 单位 Taq 酶 )20 l ，石蜡油封顶，超薄管扩增程序94 30 秒， 55 30 秒， 72 45 秒 35 个循环。 (4)第二次 PCR：取第一次 PCR 产物 3 l ，加第二次 PCR反应液 (含缓冲液引物 dNTP 及 1 单位 Taq 酶 )30 ml，在同一条件下扩增 35 个循环。 2.HGV NS5 区 PCR：引物设计与操作方法按文献方法进行。 6 / 10 3.PCR 产物的检测：采用聚丙烯酰胺 (PAGE)电泳技术检测PCR 产物， NS5 区第 一次 PCR 产物 380 bp，第二次 PCR 产物为 210 bp； NS3 区第一次 PCR 产物 158 bp 处有 cDNA 带，及第二次 PCR 产物 83 bp 处有 cDNA 带为 HGV RNA阳性。 结果 1.90 例 HCV RNA 阳性患者中 HGV RNA 检测结果： 90例 HCV RNA 阳性患者中 8 例 HGV RNA 阳性 ，阳性率为 17.8%。 2.HGV RNA 质控血清灵敏度检测结果：取参照血清 100 l加入无菌小牛血 清 900 l 定为 10-1，依次稀释至 10-6。结果表明，原血清 10-1 10-4 为强阳性， 10-5 为阳性， 10-6 为 HGV RNA 阴性 (附图 )。 3.GBV-C 参照血清 HGV RNA 检测结果：应用 HGV NS3 区套式 PCR 技术检测， Abbott 的两份样品 52953236 及 07648F9 均为阳性。 M 分子量标志物： Hae PGEM3DNA1 7 分别为原血清、10-1、 10-2、 10-3、 10-4、 10-5、 10-68 11 为 HGV RNA 阳性患者血清样品电7 / 10 泳条件为 6%聚丙烯酰胺凝胶、电极液 TAE 附图 HGV RNA 质控血清灵敏度检测结果 4.12 例 HBsAg 阳性的携带者中 HGV RNA 及 HCV RNA 检测结果： 2、 3、 4、 5、 7、 10、 11、 12 均为 HBV DNA 第一次 PCR 阳性，其中 1、 9为第二次 PCR 阳性， 6、 8 为二次 PCR 均为阴性。 HCV RNA 为 5端非编码区检测结果， HGV RNA 以 HG V NS3 区及 NS5 区两者同时阳性为判断标准 (附表 )。 附表 12 例 HBsAg 阳性携带者 HGV、 HCV RNA 检测结果 样品号 HBsAg HBeAg 抗 - HBe HBV DNA 抗 - HCV HCV RNA HGV RNA 1 + - + + + + - 2 + + - + + + - 3 + + - + + + - 4 + + - + + - - 5 + + - + + + - 8 / 10 6 + - + - + + - 7 + + - + + + + 8 + - + - + + - 9 + + - + + + + 10 + + - + + + + 11 + + - + + + + 12 + - 未测 + + + - 讨论 本文应用 HGV NS3 区套式 PCR 技术检测了美国 Abbott赠送的两株 GBV-C 样品， 并检测经日本证实为 HGV RNA 阳性样品 (为本研究所的质控血清 )，结果表明在 83bp 处均有较强的 cDNA 带，表明本试剂盒采用的 NS3 区套式 PCR 具有一定优势， 不仅能检出美国的 GBV-C 株，同时也能检出经日本检出的中国珠。 90 例 HCV 感染患者的 HGV RNA 检测 结果表明，有 HCV HGV双重感染的存在。 结果表明，在 12 例 HBV、 HCV 双重感染的献血员样品中检出 HGV RNA 阳性 4 例， 均未检测到 HDV、 EBV、 HAV、 HEV 及 CMV，提示至少存在HBV、 HCV 双重感染，这 9 / 10 种感染和多重感染是否对肝病的慢性化、肝硬化及肝癌有促进作用，有待进一 步研究证实。 作者单位：北京医科大学人民医院肝病研究所 100044 参考文献 1Simons JN, Leary TP, Dawson GJ, et al. Isolation of novel virus-like sequences associated with human hepatitis. Nat Med, 1995, 1:564-569. 2Linnen J, Wages J, Zhang-keck ZY, et al. Molecular cloning and disease association of hepatitis G virus: a transfusion-transmissible agent. Science, 1996, 271:505-508. 3 陈红松，王宇，魏来，等 .中国人庚型肝炎病毒部分