地衣芽孢杆菌对亚硒酸盐的还原.pdf

专题研究 矿物岩石地球化学通报 Bu l l e t in o f M in e r a l o g y， P e t r o l o g y a n d Ge o ch e mis t r y Vo 1 3 0 No 3， J u l y 2 0 1 i 地衣芽孢杆 菌对 亚硒 酸盐 的还原 朱建明 ， 雷 磊 ， 肖 湘。 ， 袁永强L ， 秦海波 ， 苏 惠 i 中国科学 院 地球 化学研究所 ， 环境地球化学国家重点实验室 ， 贵 阳 5 5 0 0 0 2 ； 2 中国科学院 研究 生院 ， 北京 1 0 0 0 4 9 ； 3 国家海洋局第三海洋研究所 ， 厦 门 3 6 1 0 0 5 ； 4 湖北省恩施 自治州疾病预 防控制 中心 ， 胡北 恩施 4 4 5 0 0 0 摘 要 ： 利用高硒碳质泥岩 中筛选 出的地衣芽孢 杆菌 ( B a cil l u s l i ch e n if o r mi) ， 研 究 了该 菌对亚硒 酸盐硒 的耐受 与还 原行为 。 结果表 明， 液体培养基( YE G) 中， 它能耐受 3 2 0 mM 亚硒酸盐硒 的浓度， 耐 受硒酸盐硒 的浓度可高达 1 0 0 0 mM。然而， 高 浓度 的亚硒酸盐硒对它的生长有明显的抑制作用。在有氧表厌氧的环境中， 地衣芽孢杆菌均能还原亚硒酸盐中的硒： 将四价硒还 原为纳米球状 的元 素硒颗粒 ， 使其分布在菌体的周边 和细胞 内。在含 5 mM 亚硒 酸钠 的液体培养基 中， 还 原亚硒酸钠硒 成为 元素 硒的平均效率约为 4 2 。地 衣芽孢 杆菌在 生存环境 无严格 要求 的条件 下， 其还 原亚硒酸 盐硒形成 纳米元 素硒颗粒 的现 象， 是研究生物合成低毒 的纳米活性元素硒和生物修复硒污染技术 的基础， 也为硒 的微 生物矿 化过程提供 了契机 。 关键词 ： 地 衣芽孢杆菌；亚硒酸盐硒 的还原 ； 元 素硒 中图分类号 ： P 5 9 3 文 献标识码 ： A 文章编号 ： 1 0 0 7 - 2 8 0 2 ( 2 0 1 1 ) 0 3 - 0 2 4 5 0 6 T h e R e d u ct io n o f S e l e n it e b y B a cil l u s l ich e n if o r mis Z HU J ia n - min g ， L EI Le i ， XI A0 Xia n g 。 ， YUAN Yo n g q ia n g ”，QI N Ha i- b o ， S U Hu i 1 S t a t e Ke y La b o r a t o r y o f En v ir o n me n t a l Ge o ch e mis t r y， I n s t it u t e o f Ge o ch e mis t r y， Ch i n e s e Aca d e my o f S ci e n ce s ， G u iy a n g 5 5 0 0 0 2 ， C h in a ； 2 G r a d u a t e S ch o o l o f C h in e s e A ca d e my o f S ci e n ce s ， B e i j in g 1 0 0 0 4 9 ， C h in a ； 3 Ke y L a b o r a t o r y o f Ma r i n e Bio g e n e t ic Re s o u r ce s ， I n s t it u t e o f O ce a n o g r a p h y S t a t e O ce a n ic Ad min i s t r a t io n ， Xia me n 3 6 1 0 0 5 ， C h in a ； 4 C e n t e r f o r Di s e a s e C o n t r o l a n d P r e v e n t io n o f E n s h i Pr e f e ct u r e ， En s h i， Hu b e i 4 4 5 0 0 0， Ch in a Ab s t r a ct ： B a cil l u s Lich e n if o r mi， wh i ch ca n r e d u ce t h e t o x i c s e l e n i t e a n i o n t o r e d e l e me n t a l s e l e n iu m ( S e 。 ) ， wa s is o l a t e d f r o m a ca r b o n a ce o u s mu d s t o ne wit h h ig h co n t e n t o f Se Th e r e s u l t s s h o we d t h a t t h is s t r a in ca n s t a n d in 3 2 0 mM S e Oia n d in mo r e t h a n 1 0 0 0 mM S e 0 一 Ho we v e r ， t h e h ig h co n ce n t r a t i o n o f S e 2 一ca n in h ib it t h e g r o wt h o f t he s t r a in in 1 i q u id me d i um ( YEG) No ma t t e r in a e r o b ic cu l t u r e o r a n a e r o b ic cu l t u r e t ha t t he s t r a in wa s in o cu l a t e d， it ca n r e d u ce s e l e n it e a n io n t o n a n o s p h e r i c e l e me n t a l s e l e n iu m g r a n u l e s ， d is t r i bu t e d a r o u n d o r wi t h in t h e ce l l s I n t h e l i q u i d YEG me d i u m co n t a in s 5 mM o f s e l e n it e， t h e t r a n s f o r me d e f f icie n cy o f S e t 0 Se 。b y Ba cil l u s l ich e n i f o r mi wa s 4 2 a p p r o x ima t e l y S i n ce n 0 r ig o r o u s r e q u i r e me n t f o r Ba cil l u s l ich e n if o r r n i t o l iv e ， it is s u it a b l e t o b e s e l e ct e d i n micr o b ia l r e me d ia t i o n t e ch n iq ue s a s t h e s t r a i ns t h a t co p e wit h s e l e n iu m p o l l u t i o n s， a n d t o p r o d u ce t h e n a n o - Se g r a n u l e s wi t h b io a v a il a b iI it y At t h e s a me t ime， t h e p h e n o me n a o f s e l e ni t e a n i o ns r e d u c e d t o e l e me n t a l S e b y t he b a ct e r i a l p r o v i de s a ch a n ce t o f u r t he r u n d e r s t a n d t he mi e r o b ia l mi ne r a l iz a t io n o f s e l e n i u m in t h e e n v ir o n m e nt Ke y wo r d s ： B a cil l u s l ich e n i f o r mi；r e d u ct i o n o f s e l e n it e ；e l e me n t a l s e l e n i u m 硒 是人 体和 动物必 需 的一种 微量元 素 。硒在 自 然界中主要以 4种价态存在 ， 即 S e 2 一、 S e 。 、 S e ( 本 文 中以亚硒 酸 钠 代 表 亚 硒 酸盐 硒 ) 和 S e ( 以硒 酸 钠代 表硒 酸盐硒 ) 引。其 中， 硒 酸盐容 易发生 迁 收稿 日期 ： 2 0 1 卜0 1 - 1 0收到 ， O 4 1 2改回 资助项 目： 中国科学 院知识创薪丁程重要方向项 目( KZ C X 2 一 Yw J e t 0 1 ) ； 国家 自然科学 基金创新群体项 目( 4 0 7 2 1 0 0 2 ， 4 0 9 7 3 0 8 5 ) ； 矿床地球化 学国家重点实验室开放项 目资助项 目( 2 0 0 9 1 2 ) 第一作者简介 ： 朱建 明( 1 9 6 9 一) ， 男 ， 研究员， 从事环境 、 微生物与非传统同位素的地球 化学研究 E - ma i l ： z h u j i a n min g v i p g y i g a c c 2 46 朱建明等 地衣芽孢杆菌对亚硒酸盐的还原 移 ， 易被生物利用 ； 亚硒酸盐较其他价态硒有更强的 毒性 】 。微生物在硒的生物地球化学循环及其形 态转化中发挥了重要作用 3 。微生物可将毒性较 高的亚硒酸盐 、 硒酸盐还原为毒性较低的元素态硒 ， 或同化还原合成硒蛋 白、 含硒蛋白， 甲基化为具高挥 发性的二甲基硒( D MS e ) 等 。一些细菌也能在 还原硒 酸盐 、 亚硒 酸盐 的过程 中获 取 能量 ， 同时把氧 化态的高价硒转化为低价态 的 S e 。和 S e 卜 ， 降低硒 的毒性 ， 以便能在高硒环境中生长【 3 。 以往的研究发现 ， 可以进行硒异化还原作用 的 微生物遍及整个微生物界 ， 而不仅仅是原核生物 中 的特定类群 3 “ 。代表 的微生物有嗜热细菌 ( t h e r - mo p h il ic b a ct e r ia ) 、 高和低 G+C ( 1 o w a n d h ig h G+ C ) 含量 细菌 、 革兰 氏 阳性 菌 ( G r a m p o s it iv e b a ct e r i a ) 、 变形菌( Pr 0 0 妇c a ) 以及光合型的微生物一 紫 细菌 ( p u r p l e b a ct e r ia) 等 3 “ 。这 些 微 生 物在 生 理学 特性上 具有 较 大差 异 ， 呈 现 多样 性 。 目前 已从 土壤 中分离出 1 l 9种放线菌 和 6 O种细菌能与硒酸 根或亚硒 酸根作用形成元 素硒 。比较典型有 大 肠 杆 菌 ( E s ch e r ich ia co l i ) 8 3 、荚 膜 红 细 菌 ( R h o d o b a ct e r ca p s u l a t u s ) L g 、 罗 斯 通 氏 菌 C H3 4 ( Ra l s t o n ia 口 r 伽 5 CH3 4 ) l 1 、 枯草 芽孢杆 菌 ( B a cil l u s s u b t il is ) 等u 。鉴 于 以往 的研 究 多是 从 富硒的环境 中筛选与分离细菌I 3 ， 且特异的环 境中必生长有特定的微生物群落 ， 在我们前期调查 湖 北恩 施 渔 塘坝 特 高 硒碳 质 泥岩 ( 硒 含量 大 于 5 0 0 mg k g ) 中微生物 多样性 的基 础上 ， 选 定兼 性厌 氧 细 菌地衣芽孢杆 菌 ( B 1 ich e n if o r mis ) 为研究对 象 ， 调查其对硒酸盐 、 亚硒酸盐耐受性 的同时 ， 也研 究其产物 中元素硒的特征。该研究对硒的微生物地 球化学过程及其矿化认识有一定 的指导意义 ， 同时 为 纳米 活性元 素硒颗粒 的制 备和硒 污染 的生物修 复 技术提供依据。 1 材料与方 法 1 、 1 样 品采 集 本研究中的高硒碳质泥岩于 2 0 0 7 年和 2 0 0 8年 8月采 自湖北省恩施市双河乡渔塘坝北部二叠系茅 口组顶部的碳质硅质岩层 ， 有关该研究 区的地理与 地质特征可参阅文献- 1 3 ， 1 4 。采样时使用一次性 无菌采样器 ， 刮去表层泥岩， 垂直采取泥岩芯体 ， 并 在同一位点重复取样。采集 的样 品低温保存并在 2 4 h 内运回实验室置于超低温冰箱内冷冻保存 。 1 2 地衣 芽孢杆 菌 的筛选 、 分离与 鉴定 泥岩样品在无菌条件下分装， 取约 I g样品于 1 0 0 mL无菌 Mil l iQ( MQ) 水 中分散 ， 在培养箱中震 荡混合均匀后分取 1 mL混合清液均匀涂抹在几个 含 1 0 1 0 0 mg k g四价硒 ( 本 文 中 以亚硒 酸 钠硒 代 表可溶的亚硒酸盐硒) 的平板固体( 主成份是酵母膏 +葡萄糖， 本文中简称 YE G培养基) 培养基上， 在 超净台静置 3 d ， 观察到 出现周边红色或 发红 的菌 落 ， 使用灭菌牙签挑取后转移置含不同 4价硒浓度 的平板固体培养基上 ， 反复纯化确保单一 的菌落后 转移置含 4价硒 ( i0 0 mg k g ) 的液体 Y E G培养基 中 ， 在生长 3 h后 开始在不 同时 间段取 样 ， 并 在 显微 镜和透射电镜下观察细菌的形貌特征 。 除观察细菌的显微形貌外 ， 采用分子生物学的 方法进行鉴定。基本流程是 ： 先进行菌体 D NA 的 提取和纯化， 使用上海生工生物工程技术服务有限 公 司 合 成 的两 对 1 6 S r D NA 部 分 片 段 E u b a c2 7 F： ( 5 一 AGA GTT TGA TC C TGG CTC AG一 3 ) 、 Eu b a c1 4 9 2 R：( 5一 GGT TAC C TTGTT ACG AC T T一3 ) 作为通用引物 ， 进行 P C R扩增 。P C R 条件为 9 5 变性 1 min ， 6 0 复性 4 0 S ， 7 2 延伸 1 0 0 S ， 共 3 5个循环 ， 最后 在 7 2 再延伸 1 0 min 。 P C R扩增产物纯化后克隆到 p MD- 1 8 T 质粒中， 然 后导入 E co l i DH5 a ， 由上海英骏生 物技术有限公 司完成测序。将所测的 1 6 S r D NA序列提交 E MB L 和 Ge n B ANK 数 据 库 ( 登 录 号 E F 6 5 6 4 5 5 ) ， 采 用 F AS TA 和 B l a s t程序， 进行序列相似性对 比分 析 ( 相似性大于 9 9 ) ， 确定该菌株是地衣芽孢杆菌。 1 3 地 衣芽 孢杆菌 的计数 与 电镜 观察 细菌的计数主要使用细胞计数板测量培养液中 的菌体数量 ， 同时进行 吸光度 的测定。透射 电镜观 察时先进行 培养液 中菌 体的离心 分离 ， 使用无 菌 MQ水 洗 涤 和不 同浓度 ( 7 5 9 6 、 5 0 、 2 5 、 1 0 ) 的 戊 二 醇脱 水后 进行样 品 的包埋 、 固化 和切 片 ， 测试 时 样 品载在 4 0 0目铜 网 。同时对 脱水后 的样 品在元水 酒精中分散 ， 用铜网捞取后在灯下烘干。透射 电镜 为 国家海 洋 局 第 三海 洋 研 究 所 的 J E M l O O C X I I 和 中 国 科 学 院 地 球 化 学 研 究 所 的 J E M一 2 0 0 0 F XI I ( E D X： 元 素 B U) 。 1 4 硒浓度 的测定 所有样品中硒 的测定使用氢化物一 原子荧光法 ( HG AF S ) 。岩石样 品研 磨 至 1 6 0目以 上 的 0 1 g 干燥 粉 末 样 ， 放 人 特 富 龙 密 闭 消 解 罐 中， 加 入 3 2 mL HN O。 + HF的混 合消 解 液 ， 拧 紧后 放 入 1 5 0 1 5 5 烘箱 恒温加热 1 6 h 。冷却后谨 慎 打开消解 罐 ， 补 加 1 2 mL H2 O ， 在 9 O 下 盖 盖 加 热 4 5 ra i n 后 取下 冷却， 转移至1 5 m E P F A杯中， 于7 O 矿物岩石地球化学通报 的电热板上蒸至近于补加 0 5 mL HNO 。 二次驱氟 并 蒸 至近 干后用 6 mo l L HC L定容 至 3 mL， 然后 转移到 2 5 mL的比色管 中于 9 5下水浴 4 5 min ， 稀释至 2 5 mL待测 2 。本研究 中筛选细菌 的泥岩 样 品中硒含量均为 2 0 0 1 0 0 0 0 mg k g 。 取 含菌 体 的培 养 液 快 速 离 心 后 的 上 清 液 0 1 mL， 加入 0 1 mL 硝 酸混 合 并 静 置一 段 时 间 ， 使 用 MQ水逐级稀释( 1 ： 1 0 0 ) 稀释 ， 待合适浓度直接使用 0 7 2 M (6 ) 的 HC L稀 释 后上 机 待 测 。YE G 培 养 基 中加 入 亚 硒 酸钠 硒 的初 始 量为 5 、 1 0 、 2 5 mM 。 细 菌 耐硒实 验 中加人 亚硒 酸钠 和硒酸 钠硒 的量 均是 l O 0 i0 0 0 mM 。 2 结果与讨论 2 1 地衣 芽孢杆 菌对 硒 的耐受性 实验 将该 菌 划线 于含 有 亚 硒 酸盐 、 硒 酸 盐 不 同 浓度 梯 度 的 YE G平 板 固体 培养 基 上 ， 恒 温培 养 后 观察 地衣芽孢杆菌生长的菌落形态 ， 并统计平板上菌落 的 大小 。菌 落特征 一般 是表 面湿润 ， 光 滑 ， 边缘 有 不 规则 状开 裂 ； 含硒平 板均 有红 色物质 析 出 ， 与无 硒平 板对照， 证实红色物质应是菌株的代谢产物， 扫描电 镜能谱可鉴定为元素硒颗粒( 图 1 ) 。菌落直径随四 价硒浓度的升高逐渐变小 ， 菌落数量也减少， 当硒浓 度超过 3 2 0 mM 时进人显 著降低 阶段 ， 硒浓 度在 6 0 0 mM 时细 菌 停止 了生 长 。奇怪 的是 ， 当 六 价 硒 浓度由 0 mM 逐渐升高到 2 5 mM 时菌落直径 随之 逐渐增大 ， 但当六价硒浓度高于 2 5 mM 时菌落直径 随之逐渐减小 ， 硒浓度直至 1 0 0 0 mM 时仍有菌落的 生 长 ， 但 菌 落大小 和数 量 明显减少 。这 一结果 表 明 ， 低 浓度 的硒 酸盐 硒 对该 菌 株 的 生 长有 促 进 作 用 ， 并 且 当浓 度 为 2 5 mM 时 菌 落 直 径 达 到 最 大 ， 高浓度 的硒酸盐硒也会 抑制菌株 的 生 长 。这 说 明地 衣 芽孢 杆 菌 菌株 对 亚 硒 酸 盐硒 和硒 酸盐 硒 耐 受程 度 是存 在 差 异 的 。 目前 已发现 的 菌株 能 够 耐受 亚 硒 酸 盐 硒 的 浓 度 多 在 1 0 0 mM 以 下 ， 1 0 0 2 0 0 mM 的只有少 量报道n 引， 如 国内王 东 亮 等 发 现 的 一 种 固 氮 红 细 菌 ( R h o d o b a ct e r a z o t o f o r m a n s ) ， 其耐受亚 硒酸盐硒 的最高浓度 1 2 5 mM 1 。在我 们研究 中发现 的地 衣芽孢杆 菌 ， 其在平 板培养基 中最高耐受亚硒酸硒 的浓度 约 为 6 0 0 mM ， 但在 含 3 2 0 mM 亚 硒 酸盐 硒 的液体培 养基 中也能够 生 长 ， 这足 以证 明 其抵 抗亚硒 酸盐 硒 的毒 性是 非 常强 的 。 g 昌 斗 挺 翘 2 47 Se m mo卜L 图 1 地 衣芽孢杆 菌对亚硒 酸盐 与硒酸盐硒 的耐受性 F i g 1 Th e E f f e ct s o f s e l e n it e( S e O 一)a n d s e l e n a t e( S e O 一 ) o n t h e g r o wt h o f Ba cil l u s Lich e n if o r m s 地衣 芽孢 杆菌 是一类 能 产生 内生孢 子 ( 芽孢 ) 的 细菌， 常见于土壤中； 它也是一种嗜热的革兰氏阳性 菌 ， 其适生温度大约为 5 O ， 酶分泌 的最适温度为 3 7 ， 可 以 以芽孢形 式存 在抵抗 恶劣 环境 ， 在适 宜环 境下生长 。目前主要通过培养地衣芽孢杆菌获取能 用 于洗衣 粉添加 剂 的 蛋 白酶 ， 或者 作 为 动 物饲 料 添 加剂 或肠 道微生 物制 剂等 。从人 身安 全和硒 污染 的 生物修复角度上 ， 我们在高硒碳质泥岩中筛选 的地 衣芽孢 杆 菌有可 能成 为硒 污染 生物修 复技术 中的首 选 菌株 之一 。 2 2 地衣 芽孢杆 菌对 亚硒 酸盐硒 的还 原 在 暴 露光和 氧 的 条件 下 ， 地 衣 芽孢 杆 菌 能 在 含 硒酸钠的平板固体培养基代谢形成红色的元素硒颗 粒 ， 但在兼性厌氧 的液体培养基 中并不 出现硒酸钠 中硒 的还原 。反 之 ， 该 菌无论 在含 亚硒 酸钠 ( 代表亚 硒酸盐硒) 的平板 固体 ， 还是液体培养基 中生长时， 均 有 四价硒 的还 原 ， 并 以 出现 红 色 的元 素 硒 颗粒 为 特 征 。图 2显 示 了该菌株 接入 含 5 mM 亚硒 酸钠 的 液体 培 养基 中 ， 于 3 7 1 5 0 r p m 摇 床培 养 并定 时取 样得到的菌株生长 曲线。从 生长 曲线可以看 出， 含 t h 初始浓度为 5 mM 硒 Th e in it ia l co n ce n t r a t io n is 5 m M s e l e n it e 图 2 亚硒酸钠硒 的还原与细菌细胞数的变化 F i g 2 T h e r e d u ct i o n o f s e l e n it e( S e O g 一 )a n d t h e v a r ia t ion of b a ct e r ia l ce l l co un t 2 48 朱建 明等 地衣芽孢杆菌对亚硒酸盐 的还原 亚硒酸钠培养基中菌株的生长状况比不含硒的培养 基中菌株生长状况稍微有些滞后( 该数据未在图中 显示 ) ， 前者 在生 长前 的 6 h内对 菌株 生 长有 明显 的 抑制作用 ， 而菌株的生长在 6 h之后开始加快。培 养基 中的硒浓度也开始逐渐降低 ， 在菌株生长 2 4 h 后硒浓度显著降低。这表明该菌株对硒的还原主要 发生在生长的稳定期 ， 其体 内有可能形成了某种解 毒的机制， 使菌株生长不再受到抑制 。按 5 mM 亚 硒酸钠培养基中硒浓度 的变化 ， 可 以估算出地衣芽 孢杆菌对亚硒酸钠 中四价硒的平 均还 原效率约为 4 2 。 利用下面公式可分别计算得到该菌株的倍增时 间( D丁 ) 、 生长速率( G 尺) 和生长抑制指数( ， GI ) 。 DT( h ) - ， GR( H一 ) 一 ， GI c) 一 i 0 0 。 以添加 2 0 mM 的亚硒 酸钠 、 硒酸钠 为例 。在不 添加亚硒酸钠的培养基中该菌生长较快 ， 倍增时间 短 ， 为 1 7 2 h ， 生长速 率是 0 1 8 h _ 。 ； 而 在 添加 了亚 硒酸钠和硒酸钠的培养基中， 倍增时间分别为 2 7 O h和 1 8 6 h ； 生 长速率 为 0 1 6 h 和 0 1 1 h _ 。 ； 生长 抑制指数为 9 2 8 和 8 0 0 。这表明在添加高浓 度硒的培养基中， 细菌生长受到了不同程度 的抑制， 且在添加亚硒酸钠培养基中的生长明显慢于添加硒 酸钠培养基内的生长， 也证实 了亚硒酸盐硒对该菌 的毒性强 于硒酸 盐硒 。 菌株在含有亚硒酸钠的液体培养基中出现了较 长的延滞期 ， 而在含硒酸钠液体培养基 中生长的菌 株 并没有 这一 现象 ， 仅 相对 于 不 添加 硒 的 培养 基 中 菌 株生长 速率较 慢 。这 说 明菌株 对 亚 硒 酸钠 、 硒 酸 钠 中四价 硒 、 六 价硒 的反应 机 制 或代 谢 途 径 是不 同 的 。细 菌对高 价态 硒 的耐 受机制 通常 表现为 同化还 原作用合成硒蛋 白或含硒蛋 白， 异化 还原( 呼吸作 用) 作用( S e 汁 S e 一S e 。 ) 过程中获取生长 的能量 或者使硒甲基化降低周 围环境 中的硒； 这些生化反 应过程的完成与细菌基 因表达的不同酶系统息息相 关 ， 。该菌在未加入含亚硒 酸钠 的液体培养基 之前 ， 对亚硒酸钠的还原能力较低 ， 很可能菌株在生 长在不含亚硒酸钠 的培养基 中时 ， 不表达亚硒酸盐 还原酶或表达量较低 ， 因此菌株的亚硒酸盐还原酶 为诱导表达型酶类 ； 而菌株在生长在不含硒酸盐的 培养基中时 ， 也表达 了对硒酸盐有还原能力的酶类 ， 硒 酸盐对 于这 种酶 原 本 的底 物 有竞 争 性 抑 制作 用 。 基于现有实验室的条件， 这部分工作将在后续的工 作 中进一步完成。 本 研究 中获取 的菌株 能够在 高浓 度的亚 硒酸盐 培养基 中生长( 大于或等于 3 2 0 mM) ， 仅经过较短 时 间( 2 4 h ) 延 滞期 后就能 高效 的还原 亚硒 酸盐 。因 此这一发现对于高硒污染的土壤及水体都可以起到 生物修复的作用 ， 高效 的将具有毒性和高生物可利 用性的硒氧化物还原为无毒不可溶于水的红色单质 硒纳米颗粒 ， 从而降低生物毒害。 2 3 元素 硒在 地衣芽孢 杆菌 中的分 布 在含 5 2 5 mM 亚硒酸盐硒的 Y E G液体培养 基 中 ， 该菌 生长 3 h以后 培养基 颜色 转红 ， 硒 浓度 越 高 红色越 深 ， 表 明有 元 素硒 的形 成 。 图 3 A 和 图 3 B 显示了元素硒在菌液中的分布。图 4是以能谱证 明 培养基中沉降的颗粒物为元素硒。该菌还原亚硒酸 盐硒形成 的元素硒初始时主要在分布在 菌体的周 边 ， 包裹着菌体 ， 尔后 随菌体的分解进入培养基 中。 细菌体内也有元素硒 的形成， 但明显不同于其他细 菌周质空间的元素硒 1 6 , 1 7 3 ， 而是分布在菌体 内部 ； 这表明 4价硒在细菌的胞内可被还原。该菌形成元 素硒 的颗粒一 般为无 定型 、 球 状 ， 大小 2 O 1 0 0 n m， 部分颗粒因发生团聚作用而形成不规则的团聚体 ， 在低倍显微镜下即可观察。 细菌形成的元素硒颗粒均可附着积累于细胞 质 、 周 质空 间和细 菌 表 面 。硒 的这 一异 化 还 原作 用 可能有 多个 途径 ， 但 对 于 细胞 外 的 元 素硒 是 通 过 细 胞裂 解而逸 出 ， 还 是通 过 细胞 膜 上 整 合 的还 原 酶及 膜上的转运通道将其泵 出细胞外 尚无定论 。不过 ， 从微 生物 成矿机 制和元 素硒在 地衣芽 孢杆菌 中的分 布特 征来看 ， 该 菌形 成 的元 素硒 颗粒大 小相对 均一 ， 球状 特征 明显 ， 应 该属 于菌 体 内部 形 成后 泵 出胞 外 的 ， 可能 为细 菌诱 导 型 的产 物_ 1 ， 这 也 是 除 个 别 畸 变菌体外 ， 在正常生长的细菌体内元素硒颗粒在透 射 电镜下 较难 发现 的一个原 因 。 0r e ml a n d等n 利用三 种 系统 发育 和 生理 学 上 不 同的细菌合成了胞外元素硒。这些元素硒在胞外 形成 稳定 、 均 一 的 具 单 斜 晶系 结 构 的纳 米 硒 颗 粒 。 收集清洗后获得的纯化胞外纳米颗粒在光学性质上 有很大的不同， 具独特的硒原子排列结构 ， 不能通过 目前化学合成的方法得到的。我们采集到的元素硒 颗粒在形貌上与 Or e ml a n d j 使用细菌合成的硒颗 粒非常相似， 但在 T E M 下没有观察到选 区衍射的 花样 ， 说明合成的元素硒颗粒不具 晶体结构 ， 但在光 A 矿物 岩石地球化学通报 透射电镜照片 TEM p h o t o s 图 3 元素硒颗粒在 细菌 中的分布 Fi g 3 Th e d i s t r i b u t i o n o f e t e me n t a l s e l e n i u m p a r t i cl e s f o r me d b y B a cil l u s Lich e n if o r m s s t r a i n s j 土上 I - _ b 自 z t d “ 8 B 拙d 日 | h d d 曼 k n “ 自 I 曼 m 曼 n - 图 4 元素硒颗粒 的能谱 图( k e V ) Fig 4 EDX a n a l y s is o f e l e me nt al s e l e niu m pa r t icl e s f o r me d b y Ba ci l l u s Lich e n i f o r mis s t r a i n s ( k e V) 照 下 能 产 生 移 动 ， 明 显 有 别 于 细 菌 的 运 动 ， 并 在 3 7 下 能缓 慢转 化 为灰 色 的元 素硒 ， 表 明其 物 理 性 质 有一 定 的不稳 定性 。 生 物方 法制 备 的纳米元 素 硒颗 粒 大小 一 般 为 5 2 O O r i m 1 5 , 1 8 3 ， 具与亚硒酸盐硒的类似生物活性 ， 但毒性远小于亚硒酸盐 中的四价硒离子。具生物活 性 的纳 米硒 颗 粒 已在 实 验 中用 于 畜 禽 的饲 料 添 加 剂 ， 而地 衣芽 孢杆 菌 本 身被 广 泛 用 于 畜 禽饲 料 的 添 加剂 。因此 ， 地衣芽孢杆菌在富硒食 品和 医药的开 发应用方面极具潜在价值 ， 同时对微生物的矿 化机 制 认识 方 面也有一 定 的启迪 。 结 论 2 49 微 生物 在硒 的生 物地球 化学 循环 和形态 转化 中 发 挥着 重要 作用 ， 现 今 发现 的许 多 微 生物 均 能 还 原 四价硒、 六价硒， 它们对其他有毒金属元素也有显著 的抵抗力 ， 地衣芽孢杆菌也不例外 。本研究中使用 从高硒碳质泥岩中筛选 出的地衣芽孢杆菌， 重点探 讨了它对亚硒酸盐硒 的还原能力。研究发现 ， 地衣 芽孢 杆 菌能 在高浓 度 的亚 硒 酸盐 环 境 中生长 ， 对 液 体培养基 中亚硒酸钠 的耐受至少为 3 2 0 mM， 对硒 酸盐钠的耐受则可达 1 0 0 0 mM。该菌具有较强 的 环 境适 应 性 ， 无 论在 有氧 和厌 氧 的环 境下 ， 都会 将亚 硒 酸钠中的四价硒还原为 1 O 1 0 0 rim球状的元素 硒颗粒 ， 并分布在菌体的周围或细胞 内。同时 ， 高浓 度 的亚硒酸钠对细菌的生长也有 明显的抑制作用。 在含 5 mM 亚硒酸钠的兼性厌氧液体培养基 中， 该 菌把亚硒酸钠中四价硒还原为元素硒的平均效率约 为 4 2 ， 类似于其他能还原亚硒酸盐硒为元 素硒 的 效率 。由于地衣芽孢 杆菌是一种有益的细菌 ， 且有 较强的环境适应性 ， 还可以作为畜禽饲料的添加剂 ， 这对利用该菌开发低毒性活性元素硒的医药或饲料 添 加剂 有一 定 的潜 在 价 值 。 同时 ， 在 硒 污染 的生 物 修复技术方面也可以回收细菌合 成的元素硒 ， 以做 到资源的综合利用。此外 ， 该菌株把 四价硒转化为 元素硒 的过程 ， 从地质微生物学的角度理解 ， 本身就 是硒的生物矿化过程 ， 对 深人理解硒的微生物地球 化学过程及其矿化机制有着极其重要的意义。 25 0 朱 建明等 地衣芽孢杆菌对亚硒酸盐 的还原 致 谢 ： 感谢在 实验过程 中得到国家海洋局第 三海 洋研 究所王凤 平研 究 员及 其课 题 组 成 员、 谷 力 助理研究员在透射 电镜实验 中的指导； 文章撰稿和 修改过程中得到 中国科学院地球化学研究所连宾研 究 员的帮助 ， 谨此 致谢 。 参考 文献 ( R e f e r e n ce s ) ： Fr a n ke n b e r g e r W T J， Be ns o n S S e l e n iu m in e n v ir o n me n t M Ne w Y o r k： Ma r ce l De k k e r ， 1 9 9 4 ： 1 4 1 6 朱建 明， 秦海波 ， 李 璐， 魏 中青 ， 雷磊 ， 苏宏 灿 高硒环境样 品中 硒 的形态分析方法 E J 3 矿物岩石地球化学通报 ， 2 0 0 7 ， 2 6 ( 3 ) ： 2 0 9 2 1 3 Zhu J ia n min g， Qin Ha ib o， Li Lu ， W e i Zh o n g q in g， Le i Le i， S u Ho ng ca n Th e me t h o d f o r a n a l y z in g s t a t e o f s e l e n iu m in Se r ich e n v i r o n me n t a l s a mp l e s J B u l l e t i n o f Mi n e r a l o g y ， P e t r o l o g y a n d Ge o che mis t r y， 2 0 0 7， 2 6( 3) ： 2 0 9 2 1 3 ( in Ch in e s e wit h En g l is h a b s t r a ct ) S t o l z J F， 0r e ml a n d R S Ba ct e r ia l r e s p ir a t io n o f a r s e n ic a n d s e - l e n i u m J F E MS Mi cr o b i o l o g y Re v i e w， 1 9 9 9 ， 2 3 ： 6 1 5 6 2 7 S t o l z J F， Ba s u P， S a n t in J M ， Or e ml a n d R S Ar s e n ic a n d s e l e n i u m i n mi cr o b i a l me t a b o l i s m J An u Re v Mci r o b i o 1 ， 2 0 0 6 ， 6 0： 1 0 7 1 3 O 雷磊 ， 朱建明， 秦海波 ， 苏惠 ， 冯新斌 硒的微生物地球化学研究 进展 刀 地球与环境， 2 0 1 1 ， 待刊 Le i Le i， Zh u J ia n ming ， Qin Ha ib o ， Su Hui， Fe ng Xin bin Pr o g r e s s in micr o b ia l g e o ch e mis t r y o f s e l e n iu m in t h e e n v ir o n me n t J E a r t h a n d E n v i r o n me n t ， 2 0 1 1 ( i n p r e s s ) ( i n C h i n e s e wi t h Eng l is h a bs t r a ct ) Du n g a n R S， Fr a n k e n b e r g e r W T J Micr io b ia l t r a n s f o r ma t io n o f s e l e n iu m a n d t he b io r e d e mia t io n o f s e l e n if e r o u s e nv ir o n me n t s J B i o r e me d i a t i o n J ， 1 9 9 9 ， 3 ( 3 ) ： 1 7 1 1 8 8 Do r a n J W Micr o o r g a nis ms a n d t h e b io l o g ica l cy cl in g o f s e l e n i u mE J Ad v a n ce d i n Mi cr o b i a l E co l o g y ， 1 9 8 2 ， 6 ： 1 3 1 Tu r n e r R J， W e in e r J H， Ta y l o r D E Se l e niu m me t a b o l is m in Es ch e r i ch i a co l ii - J B i o me t a l s ， 1 9 9 8 ， 1 1 ： 2 2 3 2 2 7 Kcs s i J En z y mic s y s t e ms p r o p o s e d t o be in v o l v e d in t he d is s imil a t o r y r e d u ct io n o f s e l e n it e in t h e p u r p l e n o n -s u l f ur b a ct e _ r i a Rh o d o s p i r i l l u m r u b r u m a n d R h o d o b a ct e r ca p s u l a t u s J M icr o b io l o g y， 2 0 0 6， 1 5 2： 7 3 1 7 4 3 1 0 1 Ro u x M， S a r r e t G， P i g n o t P a i n t r a n d I ， F o n t e e a v e M ， C o v e s J Mo b i l i z a t i o n o f s e l e n i t e b y r a l s t o n i a me t a l l i d u r a n s C H3 4 J App 1 En v i r o n M icr o b io 1 ， 2 0 0 1， 6 7： 7 6 9 7 7 3 1 1 Ga r b i s u C， C a r l s o n D， A d a mk i e w i cz M ， Ye e B C， Wo n g J H， Re s t o E， Le ig h t o n T， Bu ch a n a n B B Mo r p h o l o g ica l a n d bi o ch e mi ca l r e s p o n s e s o f B a cil l u s s u b t i l i s t o s e l e n i t e s t r e s s J Bio f a ct o r ， 1 9 9 9， 1 0： 3 1 1 3 1 9 1 2 1 Hu n t e r W J ， Ku y k e n d a l l L D Re d u ct i o n o f s e l e n i t e t o e l e me n t a l r e d s e l e n i u m b y Rh iz o b iu m s p s t r a i n B 1 J C u r t Mi cr o bi o 1 ， 2 0 0 7， 5 5： 3 4 4 3 4 9 1 3 朱建明， 李社红 ， 左维， S y k o r o v a I ， 苏宏灿 ， 郑宝 山， P e