PCR仪原理及其应用.ppt

PCR仪的原理及其操作应用,1. PCR仪的技术原理 2. PCR仪的分类与应用 3. PCR仪的操作步骤,轻纺与食品学院 报告人：裴乐乐 指导老师：林教授,1.PCR原理简介 PCR(Polymerase Chain Reaction)即聚合酶链式反应，主要用于DNA片段的体外扩增，基本原理类似于DNA的天然复制过程 ，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。PCR由变性-退火-延伸三个基本反应步骤构成。,PCR Cycle - Step 1 - Denaturation Template DNA by Heat (94oC),Target Sequence,Target Sequence,PCR原理示意图,模板DNA的变性：模板DNA经加热至94左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；,PCR Cycle - Step 2 Temperature is lowered (Tm ) and primers anneal to target sequences,Target Sequence,Target Sequence,Primer 1,Primer 2,5,3,5,5,3,5,3,3,模板DNA与引物的退火(复性)：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；,PCR Cycle - Step 3 - At 72 o C Taq DNA polymerase catalyses primer extension as complementary nucleotides are incorporated,Target Sequence,Target Sequence,Primer 1,Primer 2,5,3,5,5,3,5,3,3,Taq DNA Polymerase,引物的延伸：DNA模板-引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的DNA 链。,End of the 1st PCR Cycle Results in two copies of target sequence,Target Sequence,Target Sequence,每完成一个循环需24分钟， 23小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。,Target Amplification,No. of No. Amplicon Cycles Copies of Target 1 2 2 4 3 8 4 16 5 32 6 64 20 1,048,576 30 1,073,741,824,1 cycle = 2 Amplicon,2 cycle = 4 Amplicon,3 cycle = 8 Amplicon,4 cycle = 16 Amplicon,5 cycle = 32 Amplicon,6 cycle = 64 Amplicon,7 cycle = 128 Amplicon,2.PCR仪的分类与应用,普通PCR仪：一次PCR扩增只能运行一个特定退火温度的PCR仪，如果要做不同的退火温度需要多次运行。 梯度PCR仪：一次性PCR扩增可以设置一系列不同的退火温度条件（温度梯度），因为被扩增的不同DNA片段，其最适退火温度不同，通过设置一系列的梯度退火温度进行扩增，从而一次性PCR扩增，就可以筛选出表达量高的最适退火温度，进行有效的扩增。主要用于研究未知DNA退火温度的扩增，这样节约成本的同时也节约了时间。,普通PCR,梯度PCR,原位PCR,荧光定量PCR,四种PCR仪示意图,3. PCR的操作步骤 1.配置反应体系：引物、模板、buffer，dNTPs,酶，Mg2+,(如果是荧光定量PCR，则还有染料或探针）。 2.在PCR仪上设置程序：一般是94变性5min使模板充分变性,之后“94变性、退火（不同引物温度不同）、72延伸”共30-35个循环，再72延伸10min， 使产物延伸完整，设置完程序后启动机器运行。 3.如果是常规PCR，则后面还有电泳实验，如果是荧光定量PCR则可以实时观察实验过程。,PCR反应,PCR反应条件 PCR过程 PCR的特点,PCR反应,PCR反应条件 PCR过程 PCR的特点,重复13步 2530轮,目的DNA片段 扩增100万倍以上,DNA双螺旋,DNA单链 与引物复性,DNA变性 形成2条单链,子链延伸 DNA加倍,模板DNA,PCR的基本原理,PCR反应条件 PCR过程 PCR的特点,引物1,引物2,PCR的基本原理,PCR反应条件 PCR过程 PCR的特点,引物1,引物2,Taq酶,Taq酶,PCR的基本原理,PCR反应条件 PCR过程 PCR的特点,第1轮结束,第2轮开始,PCR的基本原理,PCR反应条件 PCR过程 PCR的特点,Taq,Taq,Taq,Taq,PCR的基本原理,PCR反应条件 PCR过程 PCR的特点,第2轮结束,PCR的基本原理,PCR反应条件 PCR过程 PCR的特点,模板DNA,第1轮扩增,第2轮扩增,第3轮扩增,第4轮扩增,第5轮扩增,第6轮扩增,理想拷贝数=2n n 循环次数 实际拷贝数=(1+x)n X 平均效率,约为0.85 n 循环次数,最近自己做的PCR扩增实验 1.提取样品中酵母菌的DNA 2.配置好体系后用普通PCR仪进行扩增(所用引物是EF3和EF4) 3.做琼脂糖凝胶电泳实验，并用凝胶成像仪观察DNA条