研究仙灵骨葆对兔膝骨性关节炎治疗作用

1 / 7 研究仙灵骨葆对兔膝骨性关节炎治疗作用 摘要： 目的 研究仙灵骨葆 (xianlinggubao, XLGB)对兔骨性关节炎关节软骨及软骨下骨的保护作用。 方法 30 只3 个月龄雄性日本大耳白兔，随机分为对照组 (Sham)、盐水组 (ACLT+NS)和仙灵骨葆组 (ACLT+XLGB)，每组各 10 只。盐水组和仙灵骨葆组行右膝关节前交叉韧带切断术 (anterior cruciate ligament transaction, ACLT)造成膝骨性关节炎模型。术后仙灵骨葆组 125 mg/(kgd) 灌胃 ;盐水组 则给予等剂量生理盐水。 6 周后处死动物，取股骨测量骨密度，之后脱钙制片，行 HE 染色、 Mankin 评分及 BMP-2、 MMP-13 免疫组化染色 ;取右膝胫骨近端包埋，制成硬组织切片，用于骨组织形态计量学测量。 结果 (1)Mankin 评分：仙灵骨葆组显著低于盐水组。 (2)股骨远端骨密度及胫骨近端软骨下骨骨量：仙灵骨葆组均显著高于盐水组。 (3)免疫组化：仙灵骨葆组 MMP-13 的表达显著低于盐水组， BMP-2 的表达显著高于盐水组。 结论 仙灵骨葆 125 mg/(kgd) 灌胃能够部分阻止骨关节炎兔关节软骨的退变，其作用 机制可能与下调MMP-13 的表达，上调 BMP-2 的表达，同时增加软骨下骨骨量，改善其微观结构有关。 关键词： 仙灵骨葆 ; 骨性关节炎 ; 软骨细胞 ; 软骨下骨 ; BMP-2; MMP-13 2 / 7 骨关节炎 (osteoarthritis， OA)是一种以关节疼痛、晨僵及功能损伤造成的活动受限为临床特征的慢性疾病。其病理学特点为降解代谢胜于合成代谢关节软骨的变性，表现为糜烂、溃疡和脱失、软骨下骨硬化和骨赘的形成。流行病学数据显示 1在中老年人群中 ,骨关节炎是一种发病率较高的、非常普通的肌肉骨骼疾病，但目 前还没有找到真正能够治愈的方法和药物 1。研究发现 2 4，仙灵骨葆 (XLGB)对成骨细胞和破骨细胞都具有显著的调控作用，并能改善骨小梁三维结构 5，可能存在对 OA治疗的巨大潜力。 本研究旨在观察仙灵骨葆对骨关节炎模型兔关节软骨的保护作用，同时检测软骨下骨量及骨关节炎发生促进因子 MMP-13 及骨关节炎发生保护因子 BMP-2 的表达，以期进一步探讨其可能的作用机制。 1 材料与方法 1.1 动物分组与处理 健康 3 个月龄雌性日本大耳白兔 30 只 (购自北京维通利华公司，批号： SCXK 京， XX-0002)。随机分为三组：对照组 (Sham)、盐水组 (ACLT+NS)和仙灵骨葆组 (ACLT+XLGB)。盐水组和仙灵骨葆组行右膝关节前交叉韧带切断术 (anterior cruciate ligament transaction, ACLT) 。 造 模 术 后 ，ACLT+XLGB 组行每日 1 次仙灵骨葆 (贵州同济堂公司 )灌胃125 mg/(kgd) ， ACLT+NS 组给予等量生理盐水灌胃。 Sham3 / 7 组只打开右膝关节，不行前交叉韧带切断术 ,缝合膝关节。 1.2 标本采集和处理 三组实验动物于 6 周后处死并取 材。将胫骨近端固定于 70%酒精，冠状面锯开胫骨，脱水固定，经甲基丙烯酸甲脂包埋，作 5 m 切片， Giemsa 染色。采用骨组织形态计量学方法测量软骨下骨骨小梁。股骨远端测量骨密度，股骨髁置于 4%多聚甲醛中固定， 15%EDTA-2Na 溶液脱钙，石蜡包埋，作 4 m 连续切片。行 HE 染色、 BMP-2 和 MMP-13 免疫组化染色。 1.3 免疫组织化学 (SABC 法 ) 4 m 连续切片，平铺于涂有多聚赖氨酸的载玻片上，烤片 4 h，脱蜡至水。 3%过氧化氢冲洗 10 min， PBS 冲洗 3次 5 min ，复合酶 37 修复 10 min。滴加抗兔 BMP-2 和MMP-13 多克隆一抗抗体 (购自武汉博士德 )， 37 湿盒孵育2h。滴加生物素化二抗 (购自武汉博士德 )，高敏过氧化物酶复合物， DAB 显色，苏木素复染，脱水透明，中性树胶封片。 1.4 观察指标 HE 染色观察采用 Mankin 法评分，免疫组化切片观察染色情况，骨密度测量并记录三组标本股骨远端 1/3 骨密度和内 (r1)外 (r2)侧髁软骨下骨 (软骨下 0.2 0.6 cm 间 )的骨密度。 Giemsa 染色切片用 Leica DMLB2 荧光 /光学显微镜及4 / 7 Leica DC300 数码 摄像系统进行观察与摄取图像 ;在 20 倍物镜下取软骨下骨板至骨骺上骨板间骨小梁为观察范围，每个切片随机选 3 个视野，测定骨组织形态计量学相关指标参数。 1.5 统计学分析 实验数据建立 Excel 数据库，采用 SPSS 12.5 统计软件进行单因素方差分析，两组间采用独立性 “t” 检验，以x-s 表示，以 P 2.3 免疫组化 BMP-2、 MMP-13 染色切片结果 MMP-13 免疫组化染色，关节软骨细胞阳性表达的胞浆和胞外基质被染成棕黄色。 Sham 组胞浆和基质着色区域少，着色浅 ;ACLT+NS 组胞质和胞外基质着色区域广泛，着色深，箭头所示为阳性细胞表达 ;ACLT+XLGB 组胞浆和胞外基质着色范围较少，局限于软骨表层，阳性细胞较少且着色较浅，箭头所示为阳性细胞表达 (图 2)。 BMP-2 免疫组化染色，关节软骨细胞阳性表达的胞浆和胞外基质染成棕黄色。 Sham 组，阳性细胞胞浆和基质着色区域较少，着色浅，箭头所示为阳性细胞表达 ;ACLT+NS 组，胞质和胞外基质着色范围较少，局限于软骨表层且着色较浅 ;ACLT+XLGB 组，胞浆和胞外基质着色区域广泛，着色深，箭头所示为阳性细胞表达 (图 3)。 2.4 骨密度测量结果 ACLT+XLGB 组较 ACLT+NS 组，股骨远端 dBMD(股骨远5 / 7 端 1/3 骨密度 )骨密度升高，差别显著 (P 2 陈虹，张秀珍 .淫羊藿甙对大鼠成骨细胞分泌细胞因子的影响 J.同济大学学报 ( 医学版 ),XX,2： 5-8. 3 李淑梅 ,宋利格 ,张秀珍 .淫羊藿甙对大鼠成骨细胞功能及 Osterix 表达的影响 J.同济大学学报 (医学版 ),XX， 6： 8-11. 4 吕明波 ,刘兴炎 ,葛宝丰 ,等 .淫羊藿苷对破骨细胞活性的影响 J.中国骨伤杂志， XX,8:529-531. 5 Qin L,Zhang G,Hung WY ， et al.Phytoestogen-rich herb formula “XLGB” prevents OVX-induced deterioration fo musculoskeletal tissues at the hip in old ratsJ.J Bone Miner Metab,XX,23：55-61. 6 翟吉良 ,翁习生 ,邱贵兴 .骨关节炎模型的建立及选择 J.中国矫形外科杂志 ,XX,11:843-845. 7 李任增 ,张柳 ,高晓增 .降钙素对兔骨关节炎关节软骨的保护作用 J.中国矫形外科杂志 ,XX,2:121-123. 8 刘志翔 ,张柳 ,张楠 .降钙素对兔骨关节炎软骨基质金属蛋白酶 1 的影响 J. 中国矫形外科杂志 ,XX,22:1741-1743. 9 张楠 ,张柳 ,郑桓 ,等 .降钙素在体内和体外实验中对兔关节炎关节软骨的保护作用 J.中国矫形外科杂6 / 7 志 ,XX,1:66-69. 10张大威 ,程岩 ,张金超 ,等 .淫羊藿苷对破骨细胞的分化及骨吸收功能的影响 J. 中国药理学报 ,XX,4:463-467. 11李志 .骨性关节炎与细胞因子相关性研究进展J.甘肃中医学院学报 ,XX,4:53-55. 12Wang XB,Paul A,Manner A， et al. Regulation of MMP-13 expression by RUNX2 and FGF2 in osteoarthritic cartilage J. Osteoarthritis and Cartilage,XX,12:963-973. 13王玉彬 ,陈安民 ,郭风 ,等 .基质金属蛋白酶家族在骨 关节炎软骨组织中表达的研究 J.中国矫形外科杂志 ,XX, 1:853-855. 14杨丰建 ,愈永林 ,乔健 ,等 .兔骨关节炎模型的建立以及关节炎软骨组织中 MMP-1/MMP-13 的表达 J.复旦学报 (医学版 ),XX,4:563-567 . 15Grunder T,Gaissmaiery C,Fritz J,et al.Bone morphogenetic protein (BMP)-2 enhances the express