研究肺炎链球菌候选蛋白疫苗clpp的保守性和抗原性

1 / 11 研究肺炎链球菌候选蛋白疫苗 ClpP的保守性和抗原性 摘要： 目的 : 评价酪蛋白裂解酶 P(ClpP)作为候选疫苗的保守性和抗原性，分析在不同血清型肺炎链球菌（ SPN）中的表达情况 . 方法 : 以 TIGR4 型 SPN 的 ClpP 基因序列设计引物，分别以 12 株不同血清型 SPN 的基因组 DNA 为模板，对ClpP 基因进行聚合酶链反应 (PCR)扩增、胶回收产物与 PMD18 克隆载体连接后进行测序，运用生物信息学方法对其核苷酸及推测的氨基酸序列及抗原性进行分析，并利用Western Blot 方法检测 12 株不同血清型 SPN 的 ClpP 蛋白的表达情况 . 结果 : 12 株不同血清型 SPN 的 ClpP 基因序列和GenBank 数据库对已公布的 TIGR4 型 SPN 的 ClpP 基因一致性 99.0%，推测的氨基酸序列一致性 99.5%. Western Blot结果显示 anti ClpP 多克隆抗体与 12 型 SPN 的菌体蛋白能够起交叉反应 . 结论 : ClpP 蛋白在不同型 SPN 之间同源性高，在不同型 SPN 菌株中均有表达 . ClpP 是一个具有前景的SPN 候选蛋白疫苗因子 . 关键词： 肺炎链球菌； ClpP 基因；序列分析；抗原性 0 引言 肺炎链球菌（ streptococcus pneumoniae， SPN）是引起获得性肺炎、中耳炎、鼻窦炎的主要病原菌 . 随着多重耐药2 / 11 菌株的不断发现，疫苗在预防和控制 SPN 感染中的作用越来越重要 1 . SPN 根据荚膜可分为 90 多个血清型，开发对所有血清型 SPN 都具抵抗作用的高保守性蛋白疫苗是目前SPN 疫苗的发展方向 . 研究发现的 SPN 蛋白质候选疫苗酪蛋白裂解酶 P(caseinolytic protease P, ClpP）是 ATP 依赖的丝氨酸蛋白水解酶 2，其在 SPN 的生存、致病和入血过程中起着重要的作用 3-4，针对其靶 点的疫苗或抗生素也越来越显示出其潜在的价值 . 本研究探讨 ClpP 在不同 SPN菌株中的保守性与抗原性，以及在不同血清型 SPN 中表达情况，旨在为自主开发 SPN 蛋白疫苗奠定基础 . 1 材料和方法 1.1 材料 1.1.1 菌种与质粒 12 株不同血清型 SPN： CMCC(B)31 109(serotype 1)， CMCC(B)31 203(serotype 3)， CMCC(B)31 446(serotype 4)， CMCC(B)31 011(serotype 5)， CMCC(B)31 207(serotype 6B)， CMCC(B)31 507(serotype 7F)， CMCC(B)31 216 (serotype 9V) ， CMCC(B)31 614 (serotype 14) ，CMCC(B)31 687(serotype 18C)， CMCC(B)31 693(serotype 19F)， CMCC(B)31 759(serotype 23F)（北京中国医学细菌保藏管理中心）， NCTC7466 (serotype 2，国际通用名为 D39)（欧洲国家标准菌种库）；大肠杆菌 DH5a和原核表达系统 (含pET32a(+)/ClpP重组质粒 )E.coli BL21(DE3)(重庆医科大学3 / 11 临床检验诊断学重点实验室 )，金黄色葡萄球菌标准菌株 (重庆医科大学微生物学教研室 )，质粒 PMD18 T 载体试剂盒(日本 TaKaRa 公司 ). 1.1.2 试剂 DNA 提取试剂盒，凝胶回收试剂盒及日常型质粒 DNA 快速制备试剂盒 (上海华舜公司 )；限制性内切酶EcoRI， SacI，高保真 LA Taq 聚合酶， dNTPs， Buffer， MgCl2(大连宝生物技术公司 )；丙烯酰胺，双丙烯酰胺，异丙基D 硫代半乳糖苷 (IPTG)，完全弗氏佐剂 (CFA)和不完 全弗氏佐剂 (IFA)(美国 Sigma 公司 )； DNA marker(上海生工公司 )； Goat anti mouse IgG HRP(H+L)和 3 二氨基苯联胺 DAB3( 北京中杉公司 )；咪唑， Nacl 和 Tris 碱 (美国BBI 公司 )； His Bind Column(Ni NTA)镍柱 (美国 Novagen公司 ). 1.1.3 仪器热循环仪（ TMBio Rad PCR，美国 gene cycle公司）； 电泳仪（ Power/PAC200，美国 Bio Rad 公司） . 1.1.4 动物 BALB/c 小鼠，雌性， 810 wk 龄，体质量 1820 g（重庆医科大学实验动物中心） . 1.2 方法 1.2.1聚合酶链反应 (PCR)扩增目的基因将 12株 SPN在 C+Y培养基中增菌至对数生长中后期，按试剂操作说明书分别提取基因组 DNA，扩增 ClpP 的开放读码框架 (591 bp). 上游引4 / 11 物： 5 CGAATTCATGATTCCTGTAGTTAT 3 ，含 EcoRI 位点；下游引物： 5 CGAGCTCTTAGTTCAATGAATTGTTG 3，含 SacI 位点，引物由上海生工生物技术公司合成 . 使用 La Taq 高保真 DNA 聚合酶，以不同 型 SPN 基因组 DNA 为模板进行扩增 . PCR 体系 : ddH2O 13.7 L， 5 buffer(含 Mg2+) 6.0 L， dNTP(10 mmol/L) 2.4 L， P1(5 pmol/L) 3 L， P2(5 pmol/L) 3 L， SPN DNA 1.5 L， LA Taq 0.4 L. 在 PCR仪上按下列条件进行扩增： 95预热 5 min 后反应 30 个周期： 94 1 min， 53 1 min， 72 1 min. 末轮后 72延伸 5 min. 取 5 L 反应产物置 10 g/L 琼脂糖凝胶电 泳鉴定后， DNA 胶回收试剂盒回收 PCR 产物 . 1.2.2TA克隆载体的构建与鉴定将回收纯化的 12个 PCR产物克隆至 PMD 18T 载体，转入 DH5感受态细胞，在 Amp+LB平板上培养得到多个阳性克隆，单个阳性克隆细菌经增菌后进行质粒抽提后双酶切鉴定，并将质粒送往重庆医科大学感染实验室做双向测序 . 1.2.3 序列比对与氨基酸序列预测利用 DNAssist 软件，将12 个重组克隆质粒双向测序的结果及预测的氨基酸序列与GenBank 数据库对已公布的 TIGR4 SPN 全基因组序列进行相似性分析 . 1.2.4 抗原表 位预测用抗原表位预测工具 ANTIGENIC PREDICTED ANTIGENIC PEPTIDES 分析不同血清型 SPN ClpP5 / 11 蛋白的抗原表位及其氨基酸组成 . 1.2.5PET ClpP 重组载体的诱导表达及纯化原核表达系统 pET32a(+)/ClpP E.coli BL21(DE3)在终浓度 1 mmol/L IPTG， 37， 250 r/min 条件下诱导目的重组蛋白 ClpP 的表达 . 收集的菌体超声波碎菌后，采用 Ni NTA 柱纯化目的蛋白，以 SDS PAGE 和 BioRad 凝胶图像分析系统检查目的重组蛋白表 达与提纯效果 . 将透析除盐的纯化蛋白溶液经Bradford 法定量后备用 . 1.2.6anti ClpP 抗血清的制备稀释后重组 clpP 蛋白溶液与等体积的 CFA 或 IFA 充分混匀成乳状，在小鼠腹腔下接种制备好的抗原蛋白 . 初次免疫时小鼠接受含 200 L(含重组蛋白 10 g)的 CFA 与重组蛋白混合物；小鼠再次与末次免疫时接受 200 L(含重组蛋白 10 g)的 IFA 与重组蛋白混合物 . 小鼠经 3 次免疫后，分离小鼠血清，并用 ELISA法测其 anti ClpP 抗体效价 . 1.2.7Western Blot 检 测将 12 株 SPN 在 C+Y 培养基中增菌至对数生长中后期（ A620 nm 0.50.6 左右），各取 2 mL 菌液离心取沉淀 . 沉淀用 PBS 洗 3 次，用 1上样 buffer 处理后，于 100水浴 5 min. 全菌裂解物经 SDS PAGE 电泳分离后转膜 . 以 anti ClpP 多克隆抗体为一抗（ 1 400)，羊抗鼠 HRP IgG 为二抗（ 1 5000）， DAB 为显色底物，6 / 11 Western Blot 检测菌体中 ClpP 蛋白的表达，以金黄色葡萄球菌作为对照 . 2 结果 2.1目的基因 PCR产物 12株细菌的 PCR产物经琼脂糖凝胶电泳后，可见清晰的扩增条带，产量高，所有 PCR 产物的分子大小一致，都位于 600 bp 左右 (图 1). 2.2TA克隆载体的构建与鉴定将 12个重组克隆质粒双酶切后，经 10 g/L 的琼脂糖凝胶电泳，于期望位置上出现目的条带 (图 2)，证明 ClpP 开放读码框架正确克隆入 PMD 18T载体，同时菌落 PCR 结果也证明基因克隆正确 . 2.3测序结果与序列比对不同株的 ClpP基因编码区大小与TIGR4 菌株中 ClpP 基因一样，均为 591 bp，起始密码子为ATG，终止密码子为 TAA，编码 196 个氨基酸，基因序列一致性超过 99%. 由于遗传密码子的简并性，预测的氨基酸序列一致性则为 99.5%以上 . 经生物学信息软件分析结果显示，serotype 4， 5， 6B 三菌株 ClpP 氨基酸序列与 TIGR4 菌株ClpP 氨基酸序列仅存在着一个氨基酸的差异， serotype 1 SPN与 TIGR4菌株 ClpP氨基酸序列仅存在着两个氨基酸的差异，其余血清型与 TIGR4 菌株 ClpP 氨基酸序列完全一致 . 2.4 抗原表位分析结果 12 株 SPN ClpP 蛋白的抗原表位数目相同（分别含 7 个抗原表位）并且氨基酸组成及分布完全一致 . 7 / 11 2.5融合蛋白及其 anti ClpP抗体效价转化菌经 IPTG诱导后，较未诱导菌有一条明显增粗的蛋白条带， Mr 约为 42 103 左右，与期望值相符合（ ClpP 蛋白约为 Mr 21 103，再加上 Mr 21 103 左右的硫氧还蛋白） . 蛋白溶液经镍离子柱亲和层析后透析， SDS PAGE证明纯化产物为单一蛋白，纯度达 90%. 该蛋白免疫小鼠后用 ELISA 法测得的血清效价为 1 68 000（图 3） . 2.6ClpP 蛋白的表达 SPN 全菌裂解物经电泳分离后，与制备的 anti ClpP 血清反应， 12 型 SPN 全菌裂解物 Mr 均在21 103 的位置出 现特异性反应条带，而阴性对照未见反应条带出现 (图 4). 提示不同血清型 SPN中均有 ClpP蛋白抗原的表达 . 3 讨论 蛋白疫苗是 SPN 的第三代疫苗 . 目前认为理想的 SPN 蛋白质疫苗的标准应包括 :能在细胞壁表达或者以分泌方式表达、在人体内抗原性高、能诱导杀菌的抗体和具有高度的保守性 . 随着基因组学与蛋白组学的发展， SPN 毒力相关蛋白候选疫苗不断地被筛选出来 . 但是一些蛋白由于等位基因的变异 5-7，针对于该蛋白的抗体升高不能识别其等位基因变异的表达产物，从而不能诱导针对不同血清型菌株广泛的免疫保护 . 因此，候选疫苗是否具有诱导高水平、能与不8 / 11 同种类的型或亚型菌株起交叉反应的抗体的能力，是很多致力于 SPN 疫苗的专家不断寻找高保守蛋白疫苗的原因 8-9 . 我们要评价 ClpP 候选蛋白疫苗的价值就应考虑其在不同血清型 SPN 的保守性，并考虑 ClpP 是否在 SPN 菌体中表达 . 本研究选用分离自不同标本并且在中国比较常见的 10 12株不同血清型 SPN 进行研究，结果发现，在 12 株菌中 ClpP基因相当保守，其抗原表位氨基酸组成以及分布完全一致，无抗原位点的突变，而且 12 株 SPN 菌体蛋白中都有 ClpP 蛋白的表达 . 我们的 结果初步表明： ClpP 在不同血清型 SPN 中高度保守，在不同型菌体中都有表达 . 细胞壁表达的高保守性蛋白是首选的疫苗靶点 . 目前研究较多的几个 SPN 蛋白质疫苗如 PspA 11， PspC 6和PLY 12等， PspA 和 PspC 虽在细胞壁表达，但由于等位基因变异，保守性相对较差； PLY 虽具有较高的保守性，但在细胞内表达，其抗体难以透过细胞壁与之结合，疫苗保护效果难以得到保证 . 而 ClpP 在 SPN 热休克后从细胞内向细胞壁易位 3，同时具有高度的保守性，因此它是 SPN 很好的疫苗靶点，将其单独使用或与其他的蛋 白疫苗组合使用，可能会使 SPN 蛋白疫苗的研究取得突破性进展，从而为我们自主开发广保护范围的 SPN 疫苗提供理论基础 . 另外我们也采用了 BLAST 方法分析了 SPN ClpP 与邻近种属细菌 ClpP 基因序列的相似性，发现 SPN ClpP 与许多其它9 / 11 种属细菌的 ClpP 基因序列具有高度的同源性，比如 SPN 的ClpP 与唾液酸链球菌 ClpP 的预测氨基酸序列相似程度为87%88%，与无乳链球菌 ClpP 的预测氨基酸序列相似程度为91%92%. ClpP 可能在这些菌属中存在相同的抗原表位，并可能诱发交叉反应，这应该引起注意 . 总之，在大规模人类免疫接种前对这类高保守蛋白进行彻底的安全性调查，将是非常必要的 . 【参考文献】 1 Bogaert D, Hermans PW, Adrian PV, et al. Pneumococcal vaccines: An update on current strategies J . Vaccine, XX,22:2209-2220. 2 Yu AY, Houry WA. ClpP: A distinctive family of cylindrical energy dependent serine proteases J . FEBS Lett, XX,581:3749-3757. 3 Kwon HY, Ogunniyi AD, Choi MH, et al. The ClpP protease of Streptococcus pneumoniae modulates virulence gene expression and protects against fatal pneumococcal challenge J . Infect Immun, XX,72:5646-5653. 4 Butler SM, Festa RA, Pearce MJ, et al. Selfcompartmentalized bacterial proteases and 10 / 11 pathogenesis J . Mol Microbiol, XX,60:553-562. 5 Moscoso M, Obregon V, Lopez R, et al. Allelic variation of polymorphic locus lytB, encoding a cholinebinding protein, from streptococci of the mitis group J . Appl Environ Microbiol, XX,71:8706-8713. 6 Iannelli F, Oggioni MR, Pozzi G. 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