肿瘤疫苗的作用机制及研究进展

1 / 17 肿瘤疫苗的作用机制及研究进展 作者：欧阳清，魏玉英，金伯泉，杨琨 【关键词】 肿瘤；肿瘤免疫；肿瘤疫苗 0 引言一直以来，对于肿瘤的治疗多采用手术，放疗和化疗三大常规方法 . 一百多年前， Caley 用细菌疫苗免疫机体时，观察到肿瘤缩小 . 此后人们认识到肿瘤可以诱发免疫反应，而机体免疫系统对肿瘤也具有监视作用 . 肿瘤疫苗的产生正是基于这种认识，运用增强肿瘤特异性抗原的免疫原性的基本方法，诱发机体的抗肿瘤免疫应答，以达到缩小和消除肿瘤的目的 . 1 肿瘤特异性免疫机制及肿瘤的免疫逃逸机制肿瘤在机体内能引发体液 免疫应答和细胞免疫应答，而以后者为主 . 肿瘤抗原在细胞内加工成肽段后与细胞表面的主要组织相容性复合体 (major histocompatibility complex, MHC )类分子结合并呈递给 CD8+细胞毒性 T 淋巴细胞，或先从肿瘤细胞上脱落，再由抗原提呈细胞摄取、加工成肽段后与表面 MHC 类分子结合并呈递给 CD4+辅助性 T 淋巴细胞，进而诱发机体的抗肿瘤细胞免疫应答 . 值得注意的是 CD4+ T淋巴细胞和 CD8+ T 淋巴细胞的激活都需要 MHC 抗原肽复合物和免疫共刺激分子的协同刺激作用 1，而共 刺激分子的缺失正是肿瘤引发的机体外周免疫耐受的可能机制之一 . 2 / 17 肿瘤由于其极大的异质性和遗传不稳定性，在机体环境长时间的免疫选择压力下，会启动一系列的免疫逃避机制，对抗机体的抗肿瘤免疫反应 . 这些机制分别针对 T 细胞对肿瘤的识别阶段和效应阶段，包括肿瘤抗原的丢失、 MHC 类分子表达下调、抗原加工缺陷、表达干扰细胞毒作用的蛋白酶及表达 FasL 等 2 . 2 肿瘤疫苗的设计策略 2.1 总体思路针对肿瘤抗原在机体内免疫原性下降，造成特异性细胞免疫激活不足，外周免疫耐受的状况，肿瘤疫苗设计策略的总体思路是应用各种技 术，增强免疫系统对肿瘤抗原的识别能力，改善免疫微环境 ，引发有力的特异性抗肿瘤细胞免疫，阻止肿瘤进展，最终消除肿瘤 . 2.2 肿瘤细胞疫苗肿瘤细胞疫苗是将整个肿瘤细胞作为抗原导入患者体内，诱导特异性的抗肿瘤免疫应答 . 由于肿瘤细胞带有肿瘤的全部抗原，无需考虑分离肿瘤特异性抗原（ tumor specific antigen, TSA），而且由于自体肿瘤细胞具有和正常组织相同的人类白细胞抗原，不会引发机体的免疫排斥反应，因此被认为是理想的肿瘤疫苗方案 . 但是自体肿瘤组织来源十分有限，并且考虑到 TSA 的表达具有一 定的组织特异性，因此这种方法的应用受到了限制 3 . 后来，人们开始使用人工培养的同种异体肿瘤细胞系进行肿瘤疫苗的研究 . 不同肿瘤细胞的混合能够提供一系列的 TSA，有3 / 17 利于增加肿瘤疫苗的免疫原性，减小其发生抗原丢失的几率 2 . 但是，单独使用自体或异体的肿瘤细胞难以产生足够强度的免疫应答，免疫佐剂的使用极大地改善了这种情况 . 随着基因工程的进展，人们开始对肿瘤细胞进行基因修饰，将编码免疫共刺激分子如 CD80， CD86 的基因，导入肿瘤细胞中，为 T 细胞活化提供第二信号，有效地打破了肿瘤的外周免疫耐受 . 近年来， 也有人将编码一些细胞因子如 IL 2， IL 12，粒 巨噬细胞集落刺激因子（ granulocytcmacrohage colony stimulatihy factor,GM CSF）等的基因导入肿瘤细胞，期望通过细胞因子蛋白的表达，改善肿瘤组织局部免疫微环境，增强 T 细胞的抗肿瘤免疫效应 4 . 然而，近些年来临床实验表明，即使在实验中能够诱发满意免疫反应的肿瘤细胞疫苗，在转化成临床有效的治疗性肿瘤疫苗时都遇到了困难 . Fifis 等 5的研究发现，大鼠结肠癌细胞系经体外培养后免疫同源小鼠，引发了免疫反应 和肿瘤保护效应 . 然而，当他们对荷瘤小鼠进行同样处理时，却大大促进了肿瘤的生长，提示肿瘤细胞能够通过一系列机制抑制机体的抗肿瘤免疫反应，包括分泌免疫抑制因子 IL10，肿瘤生长因子 阻止有效的免疫反应；分泌血管内皮细胞生长因子， GM CSF 等因子活化具有免疫抑制作用的骨髓源性细胞；激活特异的调节性 CD4+CD25+T 细胞以下调细胞毒性 T 淋巴细胞的效应等 . 4 / 17 2.3 肿瘤抗原疫苗肿瘤能够引起机体特异性免疫反应的现象引发了对肿瘤抗原的研究 . 肿瘤抗原包括多个层次：完整的蛋白质分子、抗原肽及纯化的 DNA. 关 于肿瘤 DNA 疫苗，下文将另行讨论 . 目前将肿瘤抗原分为 TSA 和肿瘤相关抗原（ tumor associated,TAA） . TSA 是指只存在于肿瘤细胞，而 TAA 并非肿瘤细胞特有的抗原，只是在发生肿瘤时此类抗原的表达明显上调 . Tabi 等 2认为，肿瘤抗原必须在全部或大多数患有相同肿瘤患者的大部分肿瘤细胞中呈普遍的高表达状态 . 他将肿瘤抗原分为 5 类： 突变抗原； 肿瘤细胞过度表达抗原； 癌睾抗原 ; 组织特异性分化抗原； 病毒抗原 . 单独应用肿瘤抗原蛋白存在免疫原性差的问题，这是由于肿瘤细胞可通过 抗原、 HLA 缺失等机制发生逃逸 . 刘宏利等 6结合了肽疫苗和 DNA 疫苗各自的特点，以 P815 肿瘤细胞的 CTL 表位（ P815A35 43）为模型，合成该表位加多聚赖氨酸的颗粒性多肽，并制备含有编码此表位和 GM CSF基因的表达质粒，制成了新型的颗粒性肽 DNA 复合疫苗，这种疫苗利于 APC 的摄取加工，可诱导有效的 CTL 应答，从而预防小鼠致命性 P815 肿瘤细胞攻击，并可部分根除肿瘤 . 超抗原能够激活全部携带 T 细胞抗原识别受体 V 片段的T细胞 ,激活的 T细胞克隆数约是普通抗原的 1000倍 ,产生强5 / 17 大的杀伤靶细胞的作 用 . 马文学等 7用已构建的重组跨膜型超抗原的表达载体 pET 28a TM SEA 转化 E.coli BL21(DE3)pLysS 宿主菌 ,并诱导其表达跨膜型超抗原融合蛋白，实验结果显示，跨膜型超抗原融合蛋白能够锚定在肿瘤细胞膜上，显著抑制荷瘤小鼠肿瘤的生长，并延长其生存期 ,为肿瘤抗原疫苗的研究提供了新思路 . 热休克蛋白（ heat shock protein, HSPs）作为细胞内的分子伴侣，通过其多肽结合结构域与一系列肿瘤相关抗原形成复合物，同时 HSPs 通过 HSP 受体 CD91 和 LOX 1 介导被APC 摄取 8-9，于是，将肿瘤抗原与 HSPs 在基因或蛋白水平进行连接，可使机体提高特异性和非特异性抗肿瘤免疫的水平 . 自体肿瘤 HSPgp96 抗原肽疫苗已进入临床 期，但是由于这种疫苗具有很强的个体特异性，因此只对同源肿瘤起作用，而且由于自体肿瘤 HSP 抗原肽复合物需要从肿瘤患者体内提取，来源受到了很大限制 . 目前研究方向是体外合成 HSP 抗原肽疫苗，如将 HSP 与肽或全蛋白进行连接；将 HSP 的 DNA 与抗原 DNA 连接后表达融合蛋白 10；或将HSP 基因直接注入肿瘤细胞提高其免疫原性 11 . 独特型 (idiotype， Id)单抗原显著优点在于它能引发针对相应自身抗原的体液免疫应答，抗 Id 的抗体 (Ab2)能够模拟TAA，并作为 TAA 的内影像诱发抗肿瘤免疫 . Chang 等 12研究了小鼠抗独特型 mAb MK2 23 模拟人类高分子量黑色6 / 17 素瘤相关抗原（ HMW MAA）的结构基础，发现 MK2 23 重链的互补决定区（ CDR） 3（ H3）、轻链的 CDR1（ L1）在三维结构上紧密相连，该区域的部分氨基酸序列与 HMW MAA 核心蛋白的相似折叠区具有同源性，同时发现组成 MK2 23 H3环的 15 氨基酸残肽在体内和体外均可与 HMW MAA 引发相似的免疫反应 . 抗 Id 抗体已进入临床研究阶段，在淋巴瘤、结肠癌、乳腺癌、黑色素瘤的治疗中表现出了较好效果 . CD55是表达在结直肠癌细胞表面的糖蛋白，可保护肿瘤细胞免受补体的攻击， Ullenhag 等 13用模拟 CD55 的人类抗 Id mAb 105AD7 对 67 例结直肠癌患者进行了免疫，大多数患者在酶联免疫斑点试验和免疫细胞增殖反应中表现出了抗肿瘤免疫反应 . 2.4 肿瘤 DNA 疫苗肿瘤 DNA 疫苗的原理就是将编码肿瘤特异性抗原的裸 DNA 分子直接注入机体或者经载体携带后注入机体，肿瘤 DNA 被体内肿瘤细 胞或正常细胞识别并摄入，在细胞内表达肿瘤特异性抗原，引发机体持久的细胞和体液免疫 . 肿瘤 DNA 疫苗由质粒 DNA 骨架、抗原 DNA 和真核细胞基因调控序列组成 . 肿瘤特异性 DNA 分子在体内被肌肉、皮肤、黏膜等易感处的细胞摄取后，表达出抗原蛋白，经加工处理后与 MHC分子结合呈递于细胞表面，激活 CD8+T 细胞，刺激 CTL 的形7 / 17 成和分化，产生细胞免疫作用；还有一部分抗原蛋白分泌至细胞外，被抗原提呈细胞吞噬加工后与 MHC 分子共同表达于细胞表面，呈递给 CD4+T 细胞，激活体液免疫应答 14-15 . DNA 疫苗不仅 激活了肿瘤特异性体液免疫应答，产生了大量抗体，还激活了被认为是人体抗肿瘤免疫关键细胞的 CD8+T 细胞 16，这无疑是肿瘤 DNA 疫苗的一大优势 . 而且由于 DNA 疫苗分子进入人体后才开始其抗原蛋白的合成表达，因此 DNA 疫苗能够模拟病毒感染的自然过程，合成蛋白被降解加工，作为内源性分子由 MHC 分子提呈给 CD8+T细胞，激活强有力的细胞免疫应答，较之肿瘤抗原肽进入人体经 APC 加工提呈给 CD4+T 细胞，再激活体液免疫要有效得多 . 同时，携带肿瘤抗原基因的质粒 DNA 可长期在宿主细胞内控制表达肿瘤抗原蛋白，因此具有 长期持续的效果，有望使机体获得持久的抗肿瘤免疫功能 . Niethammer 等 17 用 携 带 编 码 癌 胚 抗 原（ carcinoembryonic antigen, CEA）基因的沙门氏菌感染小鼠，联合抗体 IL 2 融合蛋白，观察到 MHC 的表达，大量 CD8+T 细胞被激活， 100%的小鼠皮下肿瘤完全消除，75%的小鼠肺转移得到抑制 . CD2， CD25， CD28 以及 CD48，CD80水平的明显上调表明 CTL和负责抗原提呈的 DCs在接受DNA 疫苗的免疫刺激后得到了有效的激活 . 然而在临床研究中， DNA 肿瘤疫苗没有达到 令人满意的效果 . Conry 等 188 / 17 用表达 CEA 和 HBV 表面抗原的质粒 DNA 免疫 17 例结肠癌转移患者，未见明显的临床变化，患者产生针对 CEA 的淋巴细胞增殖但未检测到 CEA 特异性抗体 . 然后 ,人们对 DNA 疫苗做了一系列改进，主要从递送系统和免疫佐剂两方面加强质粒 DNA 的免疫原性 . 基因枪运载质粒 DNA 的效率远远高于普通注射器和生物注射器，在 Trimble 等 19对此进行的比较中，基因枪运载质粒 DNA 的方法诱导出了最多的 CD8+T 细胞和最佳的抗肿瘤免疫反应 . 由于这种途径能直接转染组织局部的 Langerhans 细胞 20，因此诱导免疫所需要的质粒 DNA 用量可大大减少，同时，免疫佐剂也被用于质粒 DNA. 研究证明，将编码细胞因子、细菌毒素、蛋白佐剂的 DNA 与携带抗原基因的质粒 DNA 有机融合后，能加强质粒 DNA 的免疫原性 21 . 然而， Lima 等 22的研究发现 ,用 CEA 和GM CSF 融合 DNA 疫苗免疫小鼠后，高剂量组 CEA 引发的特异性体液和细胞免疫得到大大激活，但同时也产生了大量抗GM CSF 的自身抗体，而用单独的 CEA DNA 疫苗免疫小鼠，肿瘤生长被完全抑制 . 这提示肿瘤抗原基因和细胞因子基因的融合 疫苗在增强疫苗免疫效能的同时打破了机体对于细胞因子的免疫耐受 ,从而降低细胞因子的免疫佐剂功能 ,甚至可能对致敏宿主造成长期的损害 22 . 9 / 17 除了质粒 DNA 外 ,病毒载体的 DNA 疫苗也进入了临床研究阶段 . 病毒载体的 DNA疫苗有更强的激活固有免疫反应的能力，通过 TLR 依赖和非依赖途径募集和活化抗原特异性 T 细胞，同时病毒载体激活的炎症信号能够影响 IFN 1 依赖的CD8+T 细胞的局部扩增和免疫记忆的形成 . 最常用的病毒载体是重组腺病毒和重组痘病毒载体 23，重组腺相关病毒、 病毒、口腔泡状病毒、单纯疱疹病 毒还处于早期研究阶段 . ATP 依赖的抗原呈递相关转运蛋白（ TAP1）在抗原直接提呈给 CD8+T 细胞和外源性抗原在树突状细胞（ DCs）中交叉提呈的过程中发挥着重要作用 . 由于 TAP1 在肿瘤细胞中表达极度低下，肿瘤细胞表面抗原的表达缺失造成其极易发生免疫逃逸 . Lou 等 24给恶性黑色素瘤小鼠注射编码人 TAP1的重组不复制腺病毒，诱导出了有效的抗肿瘤 CTL 反应，肿瘤浸润性的 DCs 细胞增加，记忆性 T 细胞亚类增多，动物存活期延长 . 而在此病的研究中，携带表达 MAGE 1 和 MAGE3 迷你基因的重组 ALVAC 在 30 例黑色素瘤患者中仅有 1例出现免疫反应， 2 例病情稳定 25 . 这可能与患者血清中存在的抗病毒载体的抗体有关 . 2.5 树突状细胞（ dendritic cell, DCs）肿瘤疫苗 DCs 是体内最强大的专职抗原提呈细胞，它能够识别、捕获、加工、提呈抗原引发初始免疫反应 . 将 TAA 直接导入 DCs，使其发挥提呈抗原并激活 T 细胞的功能，成为肿瘤免疫治疗的有效10 / 17 途径 . 方法有用肿瘤细胞裂解产物、肿瘤抗原蛋白、肿瘤抗原多肽、合成肿瘤抗原肽冲击 DCs 细胞，或用肿瘤来源的 RNA冲击 DCs，也可以将肿瘤细胞与 DCs 细胞进行融合 ，或用肿瘤抗原病毒载体转染 DCs. 近年来，热休克蛋白 抗原肽复合物激活 DCs 诱导抗肿瘤免疫受到了广泛关注 . HSP70抗原肽复合物负载的 DCs 比单独用抗原肽或 HSP 负载的 DCs 能更有效地激活细胞、抑制肿瘤生长，而且 HSP 辅助提呈肿瘤抗原时使用更小量的抗原肽 26 . Moran 等 27将委内瑞拉马脑炎病毒复制子转染 DCs 细胞，用其免疫过表达 neu 原癌基因蛋白的荷瘤小鼠，结果转基因高水平表达， DCs 细胞成熟并分泌前炎症因子，诱导活化 NEU 特异性 CD8+T 细胞，产生抗 NEU 的 IgG 抗体 . 有趣的是，耗竭小鼠 CD4+T 细胞而非 CD8+T 后， T 细胞完全失去了抑制肿瘤生长的能力，提示 CD4+T 细胞在肿瘤生长抑制中发挥了重要作用 . 肿瘤组织来源的 RNA 转染 DCs 被证明具有强大的抗原性、更多的作用靶点和更高的安全性，经过一系列动物实验，目前已进入临床研究 . Su 等 28将PSA mRNA 转染 DCs，免疫治疗转移性前列腺癌，检测了患者外周血 PSA 水平和癌细胞数量，证明疫苗可引起有效的抗原特异性免疫反应，未见明显毒副作用 . 3 问题与展望随着对肿瘤免疫机制研究的深入，肿瘤疫苗11 / 17 成为临床预防和治疗肿瘤有 效方法的趋势日益明显 . 尽管肿瘤疫苗的有效性在动物实验中取得了振奋人心的效果，但其在临床研究中的治疗结果尚未令人满意 . 如何寻找和筛选有效的肿瘤抗原，激活机体的细胞和体液免疫应答；如何打破机体对肿瘤的外周耐受从而更有效的行使其免疫监视功能；如何改善免疫微环境，减少肿瘤对机体免疫反应的抑制；以及后续肿瘤疫苗进入机体的有效途径，免疫方法等均需要进一步的研究 . 使用佐剂、细胞因子及其它有效的方法，如利用 DCs 强大的抗原提呈能力，大大增加了肿瘤疫苗的免疫原性；抗肿瘤 T 细胞的活化需要双信号，共刺激分子B7 通过激活 T 细 胞表面的 CD28 分子活化免疫反应，通过激活细胞溶解性 T 淋巴细胞相关抗原 4（ CTLA 4）分子则抑制免疫反应，有人已设想通过阻断 T 细胞表面的 CTLA 4以利于肿瘤杀伤性 T 细胞克隆的激活；近年来 CD4+CD25+自身调节 T 细胞（ Treg）在肿瘤免疫中的抑制作用受到了关注，如何拮抗 Treg 细胞对抗肿瘤免疫的抑制，优化局部免疫微环境，从而活化免疫细胞识别、排斥肿瘤的作用也是研究的方向 . 有研究证明，不同的疫苗接种途径及程序会对肿瘤疫苗的治疗效果产生有意义的影响，据此寻找最佳的免疫程序，发挥肿瘤疫苗的优势也值得研究 . 此外，实验和临床研究发现，肿瘤疫苗对早期肿瘤、手术切除肿瘤或经放化疗已明显缩小的肿瘤具有更好的治疗效果，提示将肿瘤疫苗与手12 / 17 术、化疗、放疗及移植等手段结合起来应用，以达到满意的治疗效果 . 随着基础研究和临床试验进一步的开展，我们对肿瘤疫苗的认识也将更加深入，有理由相信，新的安全、有效、抗原性更强、适应范围更广的肿瘤疫苗终将为广大肿瘤患者带来福音 . 【参考文献】 1 林文棠，朱平 . 临床免疫学 M . 西安 :第四军医大学出版社， 2002： 100-102. 2 Tabi Z, Man S. Challenges for cancer vaccine development J . 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