细菌标本片的制备及染色方法.ppt

技能训练5 细菌标本片的制备及染色方法,能利用不同的材料进行细菌标本片的制备 掌握常规的染色方法，并认识细菌的不同染色特性,实训目标,酒精灯、接种环、载玻片、吸水纸、生理盐水、美蓝染色液、革兰氏染色液、瑞氏染色液、染色缸、染色架、洗瓶、显微镜、香柏油、乙醇乙醚、擦镜纸、细菌培养物（大肠杆菌、葡萄球菌等）、细菌病料、无菌镊子和剪刀、特种铅笔等,仪器材料,方法步骤,（一）细菌标本片的制作 （二）常用的细菌染色方法 （三）常用染色液的配制,（一）细菌标本片的制作,1涂片标本的制作 （1）涂片 （2）干燥涂片 （3）固定涂片 2血液推片和组织抹片的制作 （1）血液推片的制作 （2）组织抹片的制作,1涂片标本的制作,（1）涂片 取清洁载玻片一块，用吸管吸取生理盐水1滴置于玻片中央，再将接种环在火焰上灭菌，待冷后从固体培养基上挑取少许菌落，置于玻片上的生理盐水中混均匀，并在玻片上涂成直径约为1cm的涂面，要求薄而均匀。,（2）干燥涂片 在室温下自然干燥，必要时将涂面向上，置火焰上来回微烤使其干燥。,（3）固定涂片 干燥后，将涂面向上，在火焰上快速来回通过23次，其温度以手背接触玻片底面感觉微烫手为宜。,2血液推片和组织抹片的制作,（1）血液推片的制作 取一张边缘整齐的载玻片，用其一端蘸取少许血液，在另一张干净无油脂的载玻片上，以45角度均匀地推成一薄血涂片，以红细胞不重叠为宜。,（2）组织抹片的制作 待检尸体经无菌手术切开胸腹腔后，用经火焰灭菌的镊子夹起组织，用灭菌剪刀剪下小块组织，将组织切面在载玻片上等距离轻压几下，使其留有组织切面的压迹。,（二）常用的细菌染色方法,1美蓝染色法 2革兰氏染色法 3瑞氏染色法,1美蓝染色法,在已固定好的抹片上，滴加适量美蓝染色液覆盖涂面，染色23min，水洗，吸水纸轻压吸干或晾干和镜检，结果菌体呈蓝色。,2革兰氏染色法,（1）在固定好的抹片上，滴加草酸铵结晶紫染色液，作用13min，水洗。 （2）加革兰氏碘液，作用12min，水洗。 （3）加95酒精脱色约30s至1min，水洗。 （4）加稀释石炭酸复红，复染30s左右，水洗，吸干后镜检。 结果：革兰氏阳性菌呈蓝紫色，革兰氏阴性菌呈红色。,3瑞氏染色法,细菌抹片自然干燥后，滴加瑞氏染色液于涂片上以固定标本，13min后，再滴加与染色液等量的磷酸缓冲液或中性蒸馏水于玻片上，轻轻摇晃使与染色液混和均匀，5min左右水洗，干后镜检，结果菌体呈蓝色，组织细胞等物呈其他颜色。,（三）常用染色液的配制,1碱性美蓝染色液 2革兰氏染色液 3瑞氏染色液,1碱性美蓝染色液,甲液：美蓝0.3g、95%酒精30mL； 乙液：0.01%苛性钾溶液100mL 先配甲液，将美蓝放入研钵中，徐徐加入酒精研磨均匀后，把甲、乙两液混合，过夜后用滤纸过滤即成。新鲜配制的美蓝液染色不好，陈旧的染色好。,2革兰氏染色液,（1）草酸铵结晶紫溶液 甲液：结晶紫2g、95%酒精20ml； 乙液：草酸铵0.8g、蒸馏水80ml 将结晶紫放入研钵中，加酒精研磨均匀制成甲液，然后将完全溶解的乙液与甲液混合即成。 （2）卢戈氏碘液 碘1g、碘化钾2g、蒸馏水300ml。将碘化钾放入研钵中，加入少量蒸馏水，使其溶解，再放入已磨散的碘片，徐徐加水，同时充分磨匀，待碘片完全溶解后，把余下的蒸馏水倒入，再装入瓶中。 （3）石炭酸复红稀释液 取碱性复红酒精饱和溶液（碱性复红10g溶于95%酒精100ml中）1ml和5%石炭酸水溶液9ml混合，即为石炭酸复红原液。再取原液10ml和90ml蒸馏水混合，即成石炭复红稀释液。,3瑞氏染色液,取瑞氏染料0.1g，纯中性甘油1ml，在研钵中混合研磨，再加入甲醇60ml，使其溶