毕赤酵母重组菌GS115ChGlu发酵培养基设计及发酵条件优化.doc

毕赤酵母重组菌GS115ChGlu发酵培养基设计及发酵条件优化 冯爱娟，吴酬飞，王江海，邓毛程， （广东轻工职业技术学院食品与生物工程系，广州；广东高校特色调味品工程技术开发中心，广州； 中山大学海洋学院，广州） 摘要：以毕赤酵母重组菌（）为研究对象，进行了亚麻子发酵脱毒工艺的研究，并对重组菌的发酵培养条件进行优化。结果表明，毕赤酵母重组菌发酵扩大培养的培养基最佳碳源为玉米淀粉，最佳氮源为.0黄豆粕。优化后的基础发酵培养基发酵条件为温度、转速、发酵时间、初始、接菌量、装液量。在此最佳发酵条件下，菌体产量为个。 关键词：毕赤酵母（）；发酵条件；优化 ：A：0439114（15）051155-04 DOI：10.14088/j.ki.issn0439-8114.xx.05.032 ： 基金项目：广东高校特色调味品工程技术开发中心建设项目（）；广东轻工职业技术学院校级项目（） 作者简介：冯爱娟（），女，湖北荆门人，讲师，主要从事微生物发酵方面的研究，（电话）（电子信箱）； 通信作者，邓毛程，教授，博士，主要从事生物发酵、海洋微生物及表面活性剂方面的研究，（电话）（电子信箱）。 亚麻子含多功能活性物质，其营养价值极高且具有多种临床应用价值。因此，亚麻子成为功能食品领域的研究热点，冷榨亚麻子油含有丰富的亚麻酸，是补充亚麻酸的最有效方法，因此亚麻子是一种潜在的优良油脂原材料。但亚麻子中所含的生氰糖苷存在很大毒性，大大降低了亚麻子在粮油加工业的使用范围和利用价值。目前，亚麻子的脱毒方法主要是通过物理和化学的处理方法，但这些方法存在脱毒率较低、成本较高、难以实现产业化、溶剂残留安全风险等问题，并且会影响亚麻子中的营养成分，降低了营养价值。 微生物法脱毒因其作用条件温和、脱毒成本低、安全等优点越来越受到生物研究领域的关注，但微生物自身代谢和繁殖产生的酶活力低，脱毒效果较差，脱除率最高为，。为此，中山大学海洋学院成功构建了分泌融合表达氰化物水合酶和葡萄糖苷酶的基因工程菌毕赤酵母重组菌（），该工程菌株具有强氰根吸收能力和高效生氰糖苷降解能力，可使生氰糖苷中的高效解离成，又能将游离的作为惟一碳氮源。本研究利用已经构建好的毕赤酵母重组菌菌种进行发酵培养基的设计，并对其发酵条件进行优化，以期发酵产量达到工业化生产水平的要求。 材料与方法 材料 供试菌株：毕赤酵母重组菌菌种，由中山大学海洋学院王江海实验室构建并保存。 培养基成分：碳源包括葡萄糖、乳糖、玉米淀粉、甘油；氮源包括蛋白胨、酵母浸膏、黄豆粕、棉子粉。 种子培养基：胰蛋白胨、酵母提取物、（无氨基酵母氮源）、甘油、生物素，加入缓冲溶液，灭菌即得到液体培养基。 方法 毕赤酵母重组菌种子液的培养取活化后的酵母菌环，接种于液体种子培养基中，然后进行膜过滤；放入摇床，在，的转速下培养备用。 碳源的确定分别以葡萄糖、乳糖、玉米淀粉、甘油为碳源，保持其他培养基成分不变进行培养选择出最佳碳源。然后将最佳碳源按照、种不同比例进行培养基配制确定最佳使用比例。在培养过程中（）每隔取样测定值（为保证数据的准确，进行离心，下同），绘制曲线。在曲线出现最高峰时，测定毕赤酵母重组菌的产量进行比较，选择出最适碳源及最佳比例。 氮源的确定固定碳源为玉米淀粉，分别以蛋白胨、酵母浸膏、黄豆粕、棉子粉为氮源，保持其他培养基成分不变进行培养，选择出最佳氮源。然后将最佳氮源按照.0、.0、.0种不同比例进行培养基配制确定最佳比例。确定方法同“”。 发酵条件的优化 ）初始。采用确定好的基础培养基，在温度、转速、发酵时间、接菌量、装液量的条件下，分别测试不同初始（、）对发酵产菌量的影响，确定最佳初始。 ）发酵时间。采用确定好的基础培养基，在温度、转速、初始、接菌量、装液量的条件下测试不同发酵时间（、）对发酵产菌量的影响，确定最佳发酵时间。 ）发酵温度。采用确定好的基础培养基，在转速、发酵时间、初始、接菌量、装液量的条件下，测试不同发酵温度（、）对发酵产菌量的影响，确定最佳发酵温度。 ）转速。采用确定好的基础培养基，在温度28发酵、初始、接菌量、装液量的条件下，测试不同转速（、）对发酵产菌量的影响，确定最佳转速。 ）接菌量。采用确定好的基础培养基，在温度、转速、发酵时间、初始、装液量的条件下测试不同接菌量（.0、.0、.0）对发酵产菌量的影响，确定最佳接菌量。 ）装液量。采用确定好的基础培养基，在温度、转速、发酵时间、初始、接菌量的条件下，测试不同装液量（、）对发酵产菌量的影响，确定最佳装液量。 结果与分析 不同碳源对毕赤酵母重组菌发酵产菌量的影响 由图可知，培养时，培养基添加碳源玉米淀粉的值达到峰值，添加碳源甘油其值在培养时达到峰值，添加乳糖和葡萄糖作为碳源时，二者值变化不明显。基于酵母菌培养时间长的特点，为了利于大规模生产，选择发酵时间不超过的培养基，因此确定玉米淀粉为重组菌的最佳碳源。 由图可知，以玉米淀粉作为培养基最佳碳源，当玉米淀粉的比例为，培养时间为时，培养基值达到峰值，而添加和的玉米淀粉其值分别在和达到最大值，之后值都呈下降趋势。因此，确定玉米淀粉为重组菌的最佳碳源，且比例为。 不同氮源对毕赤酵母重组菌发酵产菌量的影响 由图可知，培养时，培养基添加氮源黄豆粕的值达到峰值，且之后值的变化比较小；添加棉子粉在培养时OD达到峰值；添加酵母浸膏和蛋白胨作为氮源时，值在培养分别能达到和，但是耗时比较长，所以确定黄豆粕为重组菌的最佳氮源。黄豆粕作为氮源不仅有较高的产菌量，同时还能维持高效产菌一段时间，且廉价，因此黄豆粕还可以考虑作为长效氮源而利用到大规模生产中。 由图可知，以黄豆粕作为培养最佳氮源，黄豆粕的比例为.0，培养时间为时，培养基值达到峰值，之后值的变化比较小，这与前期试验结果一致。而添加.0和.0黄豆粕其值均在培养达到最大值，之后其值呈下降趋势，因此确定黄豆粕为重组菌的最佳氮源，且比例为.0。 发酵条件的优化 最佳发酵初始确定由图可见，培养基初始为、时，毕赤酵母重组菌发酵产菌量差别不大；初始为、时，发酵产菌量差别也不大；当培养基初始为时，毕赤酵母重组菌发酵产菌量达到最高峰，为个，因此确定重组菌的最佳发酵初始为。 最佳发酵时间确定由图可见，当培养到时，培养液中毕赤酵母重组菌产菌量达到最高值，为个，之后随着发酵时间的延长，发酵产菌量趋于稳定。因此，确定重组菌的最佳发酵时间为。 最佳发酵温度确定从图可以看出，当发酵温度在时，培养液中毕赤酵母重组菌产菌量达到最高值，为个，随着发酵温度继续升高，产菌量呈下降趋势。因此，确定重组菌的最佳发酵温度为。 最佳转速确定从图可以看出，当培养过程中转速为时，培养液中毕赤酵母重组菌产菌量达到最高值，为个，转速太大或太小都不利于该菌体的生长繁殖。因此，选择转速为进行菌体培养。 最佳接菌量确定由图可见，当接菌量为时，毕赤酵母重组菌发酵产菌量达到最高峰，为个，之后发酵产菌量随接菌量的增加而降低，确定的接菌量为最佳接菌量。 最佳装液量确定从图可以看出，当装液量为时，培养基发酵产菌量达到峰值，为个，随后产菌量随装液量的增加而降低。因此，确定重组菌的最佳装液量为。 小结 毕赤酵母重组菌进行发酵扩大培养的培养基成分为的玉米淀粉作为碳源、的黄豆粕作为氮源，其优化了的基础发酵培养基的发酵条件为温度、转速、发酵时间、初始、接菌量、装液量。在此最佳发酵条件下，测得培养基值达到，比其他报道，的数据增长了左右，菌体产量为个，为亚麻子作为食用油脂优质的原材料创造了条件。本研究中的碳源和氮源都是相对廉价的原材料，特别是黄豆粕还可以考虑作为长效氮源使用