沉默miR156表达的mimicry156载体的构建及转化烟草的研究.doc

沉默miR156表达的mimicry156载体的构建及转化烟草的研究 冯圣军，章玉婷，缪家顺，詹妮，朱祝军，于超，王华森 （浙江农林大学农业与食品科学学院浙江农林大学生物种业研究中心，杭州） 摘要：在植物营养生长阶段幼年期向成年期的转变过程中发挥重要的调控作用，其通过降解基因和翻译抑制调控靶基因的表达。通过定向改造拟南芥内源性（）构建了抑制表达的载体，并转化获得转基因烟草植株，转基因植株对内源性具有抑制作用。该方法为研究在植物营养生长阶段的调控作用提供了方便有效的途径。 关键词：；表达载体；转化 ：A：0439114（15）010210-05 DOI：10.14088/j.ki.issn0439-8114.xx.01.055 Silencing ， （， ，） ：andwas（，）dwill ：； ： 基金项目：国家自然科学基金项目（）；浙江省自然科学基金资助项目（）；年浙江省“三农六方”农业科技协作计划 项目（）；浙江省公益性行业科研资助项目（） 作者简介：冯圣军（），男，江苏南京人，在读博士研究生，研究方向为植物遗传发育、蔬菜生理与分子生物学，（电话） （电子信箱）；通信作者，王华森，男，副教授，主要从事植物遗传发育、蔬菜生理与分子生物学研究，（电子信箱） 。 是真核生物中非编码的小，在基因转录后的调控过程中发挥重要作用，一般位于编码蛋白质的基因之间，在高等植物编码蛋白质基因的转录产物中存在茎环（）结构，经过一系列复杂的加工后，（）家族基因将茎环结构中大约个核苷酸大小的成熟单链切割出来，其可以选择性地装载到诱导的沉默复合体（，）上，与靶标进行互补配对，造成靶标的降解或翻译抑制，因而能在转录后水平专一性调控靶基因的表达。通常与其靶基因之间的表达呈负相关，即在组织水平上某个含量的增加往往伴随着其靶基因转录水平的下降，与转录抑制因子相比，能在转录后水平更迅速地调节靶蛋白质含量，显著缩短调控反应的延滞期，精确维持靶蛋白质的稳定状态，从而有效地调控植物的生长发育、生物及非生物的胁迫响应。 在植物营养生长阶段幼年期向成年期转变过程中发挥重要的调控作用，其在拟南芥（），玉米（），苔藓（）、番茄（），夏堇（）、软枝草（）、水稻（）等植物中都被证明是营养期转化的关键调控因子。通过降解基因并通过翻译抑制调控靶基因表达，的表达丰度随着植物发育进程逐渐降低的同时，解除了对基因的抑制从而顺利调控植物幼年向成年的过渡。 等在植物中的重要调节作用已成为近年来研究的热点。正向遗传学研究法通过诱变剂处理，大量筛选突变体研究其表型和生理代谢。但是这种方法随机性较大，不易获得目的功能缺失的突变体，给研究带来了较大的障碍。靶基因模拟（，）技术的出现提供了一种新颖的研究方法。 植物中磷的生理平衡受复杂的调控系统支配，从而有效地控制植物的生长。研究发现、和形成反馈循环系统调节植物中磷的动态平衡。在缺磷胁迫下诱导降解与其具有一段互补区域的，能够编码一种泛素结合酶，而这种酶影响植物中磷的含量和再利用过程。除了能够与互补结合外，研究发现基因家族的同样含有的结合域，（）属于家族的一员，但与互补配对的不仅没有降解反而具有抑制活动的效果。与调节的靶位点相比，在结合域的中心位点有个核苷酸的插入，相当于调节靶基因结合区域的突起部分，从而阻止了复合体对的切割，同时占据，从而抑制其对靶基因的降解作用。研究发现，作用原理同样可用于抑制其他的活动，本研究通过定向改造拟南芥内源性构建抑制表达的载体，旨在为进一步研究在植物营养阶段的调控作用打下基础。 材料与方法 材料与试剂 材料拟南芥（）哥伦比亚生态型（），烟草（）（）均为浙江农林大学蔬菜品质改良重点实验室保存。 细菌菌株与质粒载体根癌农杆菌（）菌种，由改造的具有启动子的表达载体，均为本实验室保存。大肠杆菌（）菌种，克隆载体？誖均购自全式金生物技术有限公司（北京）。 酶及生化试剂卡那霉素（）、庆大霉素（）、羧苄青霉素（）和草甘膦（）均购自公司。高保真聚合酶P购自于美国（）公司。限制性内切酶、连接酶及反转录试剂盒、定量试剂盒均为公司（大连）产品。质粒提取试剂盒、琼脂糖凝胶电泳回收试剂盒购自生工生物工程股份有限公司（上海）。总提取试剂盒购自公司，引物合成、测序由华大基因有限公司完成。 方法 拟南芥基因克隆以缺磷培养的拟南芥（）为材料，依据rizol试剂盒说明书进行总的提取，并进行反转录得到。根据的全长序列，利用引物设计软件在编码区两端分别设计扩增引物（）和（）。引物的端加入酶切位点，引物端加入酶切位点，以拟南芥为模板，扩增基因。反应条件为，个循环；延伸。将获得的产物经的琼脂糖凝胶电泳后，切下目的条带，用胶回收试剂盒回收备用。 定向改造基因定向改造基因，通过重叠获得目的片段。将上与结合的区域，通过设计特定引物（ ）和（ ），改造为与其靶基因结合区域，通过融合的方法，以上述克隆到的基因为模板，分别以、和、作为引物分段扩增，得到个克隆片段。然后用这个片段为模板，以和为引物，通过融合扩增，产物即为改造好的片段。扩增反应条件为，个循环；。融合反应条件为，个循环；。将获得的产物经的琼脂糖凝胶电泳后，切下目的条带，用胶回收试剂盒回收。 载体的构建将上述回收得到的目的片段进行定向连接，连接到克隆载体？誖上，连接产物转化到感受态大肠杆菌，菌液经和测序验证。提取阳性克隆质粒经和双酶切后，回收目的片段连入表达载体中，通过菌液与和双酶切验证后，采用冻融法转入农杆菌中，保存菌株。 烟草的遗传转化与鉴定利用农杆菌介导的叶盘转化法转化烟草，通过筛选转基因抗性植株，并提取代烟草转基因株系进行基因组鉴定。 结果与分析 定向改造为 通过隔绝来调控对靶基因的降解活动，这种作用机制为的功能研究提供了异于传统遗传学且方便有效的途径。作为典型的内源性，在缺磷胁迫下与共同维持植物体内磷代谢平衡。根据这种机制本试验将定向改造为抑制表达的沉默载体。以缺磷培养的拟南芥为模板，通过扩增出基因全长。通过设计特异性引物、，将与的结合区域改造为与其靶基因互补的区域（图），利用重叠延伸的方法，以的编码序列为模板进行分段扩增（引物分别为、和、）。将种产物回收并作为模板，以1和为引物进行融合扩增，产物即为，图为重叠的具体流程示意图。 植物表达载体的构建 片段与？誖载体连接并转化到大肠杆菌后，如图菌液电泳结果所示，已筛选到了阳性转化子。测序结果进一步表明，阳性克隆的序列与设计的序列保持一致。用限制性内切酶和将质粒和进行双酶切，经回收后将目的基因片段插入表达载体、启动子的下游，构成载体，将构建好的载体分别用和双酶切（图）并进行测序验证，结果证明载体已构建成功。图结果表明，含片段的植物表达载体已成功转化到农杆菌中。 烟草转植株的鉴定 将构建好的表达载体转化农杆菌，通过农杆菌介导的叶盘转化法转化烟草，获得转基因植株，图为烟草的遗传转化过程。 为了检测转基因是否成功，以野生型和表现出除草剂（）抗性的转基因烟草植株的基因组为模板，通过基因和序列设计的特异性引物（）、（）和（）、（）分别进行扩增，鉴定转基因植株。从图中可以看出，转基因植株基因组中扩增出基因和片段，而野生型植株中没有扩增出相应片段，初步判定目的基因已整合到烟草的染色体上。 转基因烟草表型分析 将上述检测获得的株代阳性植株中的号和号株系代种子和野生型烟草种子播种于无菌土中，经破休眠后移入温室中，此时开始计算植株年龄，待小苗长出子叶后喷施，筛选自交分离含的植株，真叶长出后转基因植株与野生型植株表型逐渐表现出不同（图）。植株表现出快速成熟的表型（图）：开花明显提前（图），叶片数量低于野生型植株（图）。相同时间内超表达植株叶片发生速率明显低于野生型烟草（图）。 讨论 及其靶基因控制的营养生长阶段转变，被证明与植物一些重要的经济性状调控相关，如参与控制植物叶形、叶片大小、叶片发生速率、叶片扩展率、茎直径、不定根的发生、侧分支的形成、开花时间、花絮结构等。拟南芥超表达可使幼年莲座叶数目显著增多，从而有效增加生物量，为生物能源开发提供了参考；对园艺作物番茄与观赏花卉夏堇的研究发现，对作物株型的修整和果实形状大小的改变发挥重要的作用，；能源植物软枝草过表达显著提高了叶片数量，为燃料的生产提供资源，同时针对性地表达可提高可溶性糖的含量。研究发现，在植物多种营养物质合成路径中发挥重要的作用，等研究证实活动的增加提高了拟南芥花青素的含量，揭示了花青素、黄酮等次生代谢产物受到的调节。新近研究发现，光合作用的主要产物糖，能够作为一个可移动的信号分子抑制新生叶原基中的表达，从而促进营养生长阶段转变的发生。因此，研究在植物中的调控机制具有重要意义。 传统的遗传方法研究具有很大的局限性，的出现提供了一种全新的调节特定内源性表达量的方法。本试验通过方法克隆了拟南芥基因，同时定向改造为具有结合位点的抑制表达的。为了进一步研究其对的调节功能，构建了启动子植物表达载体，并将其转化到烟草中。转基因植株基因组和检测表明，已经整合到烟草染色体中，转基因后代与野生型对照相比，其叶片发生率降低，开花提