产木聚糖酶的食用真菌菌株选育及条件优化.doc

产木聚糖酶的食用真菌菌株选育及条件优化 （伊春林业科学院，黑龙江伊春153000） 摘要：采用木聚糖类似物诱导法，对64种食用真菌进行诱导培养，得到产木聚糖酶较高的食用菌株黑木耳LK8。利用正交试验法对黑木耳LK8的液体培养条件进行优化，结果显示：在液体培养基pH=7.5、底物木聚糖浓度为1g/100mL、培养20天的条件下产酶效果最佳，产酶水平为605.6IU/mL，较优化前提高近7倍。同时，试验结果证明培养液pH值是影响诱导效果的主要因素，利用盐沉和冷冻干燥法制备木聚糖酶粗酶制剂，得率为43%。 关键词：木聚糖酶；食用真菌；诱导代谢；条件优化 ：S567.3：A 木聚糖酶是一类能够破坏植物纤维组织，降解半纤维素的一组酶的总称，属于水解酶、胞外酶类，具有可诱导性。目前已被广泛应用于工业生产、动物饲料喂养、食品行业加工、能源开发、环境综合治理、造纸行业以及功能性低聚糖制备等领域1-2。木聚糖酶产生菌主要自然菌株，可通过诱变、蛋白质工程、基因工程等分子技术改变产酶基因，从而提高菌体木聚糖酶的分泌量。目前国内外的研究主要集中在利用工程化菌株生产木聚糖酶3-6，而利用大型食用真菌液体发酵生产木聚糖酶却鲜有报道。因此，本研究用7种木聚糖结构类似物配制液体诱导培养基，对64株不同种的大型食用真菌进行诱导培养，以期筛选出产木聚糖酶能力较强的菌株，并确定最佳产木聚糖酶条件。同时，制备粗酶制剂，为木聚糖酶生产提供基础数据，并为其理化性质研究做准备。 1试验材料 1.1试验菌种 64种大型食用真菌包括9株木耳(黑木耳LK5、黑木耳LK7、黑木耳LK916、黑木耳LK9、黑木耳LK10、黑木耳LK12、黑木耳LK15、黑木耳LK8、黑木耳丰收)、16株香菇(香菇L26、香菇L109、香菇9608、香菇2205、香菇2206、香菇939、福建396、香菇1363、香菇856、香菇236、香菇396、香菇208、香菇908、香菇美236、香菇美238、平菇洛加)、11株灵芝(灵芝s1、灵芝s2、灵芝s3、灵芝s4、灵芝s5、灵芝s6、灵芝s7、灵芝s8、灵芝s9、韩灵芝、红灵芝)及28株其他品种大型真菌(硫磺菌、金耳、白灵菇、灰离、长根菇、杏鲍菇、血耳、大宗菇、猪苓、羊肚菇、柴脸菇、榆黄蘑、大球盖菇、褶伞密环菌、灰树花、块根蘑、元蘑、白灵菇、玉田平菇、猴头、茶树菇、滑子菇、真姬菇、向阳2号、白金镇、黄金针、华白平菇、茯苓)。 1.2供试培养基及主要化学试剂 液体培养基(蛋白胨2.0g，酵母膏2.0g，MgSO47H2O0.5g,K2HPO41.0g,KH2PO40.46g)、木聚糖类似物(木聚糖、葡聚糖、羧甲基纤维素钠(CMC-Na)、葡萄糖、木糖、微晶纤维素、可溶性淀粉)，3,5二硝基水杨酸(DNS)试剂、柠檬酸磷酸二氢钠缓冲液(pH5)。 2试验方法 2.1食用真菌液体培养 将培养基与7种木聚糖类似物（添加量为5g/L）分别组合成为诱导培养基，分别将64种食用菌接种到培养基内，设置pH值为7.0，25、150r/min的条件下进行液体摇瓶培养25天，测定培养后的酶活并比较产酶能力。 2.2食用真菌产木聚糖酶的测定 采用透明圈快速检测法7。筛选具有木聚糖酶的食用真菌菌株，DNS法8测量食用菌培养液的产木聚糖酶活力(1mL酶液在50，pH值5.0条件下，每分钟水中木聚糖生成1mol木糖还原物质的量定为1个酶活单位，以IU/mL表示)。 2.3木聚糖类似物诱导法培养条件的优化 利用正交试验法对黑木耳LK8的液体诱导培养条件进行优化，设计3因素3水平试验，选用Lg(33)正交表，拟定的正交试验因素与水平(表1)。 2.4粗酶制剂的保存 把经过盐析、浓缩后得到的木聚糖粗酶用真空冷冻干燥机进行冷冻干燥处理，得到粗酶制剂，为下一步木聚糖酶理化性质研究做准备。 3结果与分析 3.1产木聚糖酶菌株的筛选 通过透明圈快速检测法初步检测出48株食用真菌具有产木聚糖酶的能力，进一步通过DNS法检测出，在不同诱导类似物诱导培养下，产木聚糖酶活力较高的5个食用真菌菌株分别是：香菇2205、灵芝、杏鲍菇、玉田平菇、黑木耳LK8（表2）。综合各特征比较，黑木耳LK8透明圈直径最大，DNS（OD600nm）数值高于其他菌株，在诱导培养条件下表现出较好的产木聚糖酶能力。因此最终选取伊春林业科学院保藏菌种黑木耳LK8进行液体培养条件优化试验。 3.2诱导培养条件的优化 由正交试验结果分析（表3）可知：诱导培养黑木耳LK8产木聚糖酶最高的条件组合为a1b3c3，即最佳培养时间、pH值和底物木聚糖浓度（g/100mL）分别为20天、7.5和1g/100mL；优化后测定产酶水平为：605.6IU/mL。 由极差数据分析(表4）可知：黑木耳LK8受各因素影响的顺序是，诱导培养液pH底物浓度诱导时间，其中pH值是主要因素。 3.3木聚糖酶提取结果 通过对黑木耳LK8的诱导培养条件的优化，酶活力得到了很大的提高，较之前的Themrascusaurantaicus优化菌株9有较高的酶活及产率(表5)，利用盐沉和冷冻干燥法，每1000mL粗酶液可得到3.581粗酶粉，单位酶活为72050.8IU/g，总酶活为258013.9IU，得率为43%。 4讨论与结论 4.1诱导菌株的筛选及培养条件的优化是诱导食用菌代谢生产木聚糖酶的关键技术，本试验对64株大型食用真菌采用平板透明圈法和液体发酵诱导培养相结合的方法，筛选获得1株产木聚糖酶较高的菌株，为黑木耳LK8。通过正交试验对菌株黑木耳LK8的诱导培养条件进行了优化，确定了最佳产酶条件为：培养时间20天、pH值7.5、底物木聚糖浓度1g/100mL。条件优化后菌株LK8产酶水平从原来的86.2IU/mL提高到605.6IU/mL，提高了近7倍；同时得出影响诱导效果的主要因素是培养液pH值；利用盐沉和冷冻干燥法制备木聚糖酶粗酶制剂，每1000mL粗酶液得3.581g粗酶粉，单位酶活为72050.8IU/g，总酶活为258013.9IU,得率为43%。利用此诱导培养方法合成的木聚糖酶偏碱性，具有更广阔的研究潜力和应用前景。 4.2研究发现，诱导培养过程中食用菌菌丝体对培养基酸碱度要求差别很大，后续将就食用菌代谢生产的木聚糖的理化性质进行进一步研究，确定其理化性质及应用范围，为木聚糖酶的应用积累数据。 4.3试验过程中菌丝生长前期产多糖比率较高，随培养时间延长多糖比率有所下降，产酶能力则是随菌丝代谢时间延长而增加，平衡产酶和产多糖时间点，是后续的主要研究内容。 4.4诱导培养基质中的木聚糖类似物可诱导该酶的合成、增加该酶代谢量，此试验正是基于利用食用菌生长代谢特性与木聚糖酶的合成特点而设计的。我国食用菌产量大，液体培养技术成熟，所以，探究大型食用真菌的深层研究价值，利用其生产木聚糖酶及相关酶系将成为未来科研的一个主要方向。 参考文献 1郭清吉.木聚糖酶产生菌的筛选、酶学性质及宏基因组文库的构建与筛选D.青岛科技大学,xx(6). 2王宜磊,邓振旭.透明圈法快速筛选半纤维素分解菌J.生物技术,2000,10(1):37-39. 3MalabadiRB,RaghvendraS,KumarSV.Productionofcellulose-freexylanasefromanovelyeastusedforbiobleachinginpaperindustry.ResearchJournalofMicrobiology,xx.2(1):24-33. 4GigiC,AdinaC,GabrielaE.Optimizationofbiosynthesis conditionsandcatalyticbehaviorevaluationofcellulose-freexylanaseproducedbyanewStreptomycessp.Strain.AUDJC-FoodTechnology,xx.36(1):34-44. 5于俊杰,赫荣琳,武改红,等.复合木质纤维素酶菌株筛选及其培养条件优化J.生物技术通报,xx(4):101-109. 6李里特,丁长河,江正强,等.一株产木聚糖酶链霉菌的鉴定及发酵产酶J.微生物学通报,xx,30(6):59-64. 7王宜磊,邓振旭.透明圈法快速筛选半纤维素分解菌J.生物技术,2000,10(1):37-39. 8沈诚,李戎,胡婷莉,等.木聚糖