灯盏花乙素苷元的微生物限度检查方法验证.doc

灯盏花乙素苷元的微生物限度检查方法验证 赵加强1周荣光1,2杨兆祥1王金3袁正东2 1昆明制药集团股份有限公司，云南昆明650100；2昆明医科大学，云南昆明650500；3昆明理工大学生命科学与技术学院，云南昆明650224 【摘要】目的：建立灯盏花乙素苷元的微生物限度检查方法。方法：按照中国药典xx版要求，采用常规法对代表性的细菌、霉菌、酵母菌进行回收率测定，并对控制菌检查法进行方法学验证。结果：采用常规法，5种试验菌的回收率均大于70%。结论：可采用常规法对灯盏花乙素苷元进行微生物限度检查。 关键词灯盏花乙素苷元；微生物限度检查；方法学验证 【】R92711【文献标志码】A【】1007-8517(xx)01-0032-02 灯盏花乙素苷元又名野黄芩素，是灯盏花乙素在人体内的代谢产物，具有抗血栓、抑制血小板聚集、增加脑血管血流量等药理活性，其生物活性是灯盏花乙素的5倍以上1。灯盏花乙素苷元天然存在于灯盏花等植物中，但含量极低，不到万分之一。我们以灯盏花素（主要成分为灯盏花乙素）为原料，采用人工半合成方法实现了灯盏花乙素苷元的批量生产2。本文旨在按照中国药典的要求3，建立灯盏花乙素苷元的微生物限度检查方法。 1仪器与材料 11仪器HTY-2000A集菌仪（杭州高得医疗器械有限公司）；开放式集菌器（北京牛牛基因技术有限公司）；303-6B隔水式恒温培养箱（南通科学仪器厂）；霉菌培养箱（上海跃进医疗器械有限公）。 12供试样品灯盏花乙素苷元（批号：xx08025、xx0826、xx0827，昆明制药集团股份有限公司药物研究院）。 13培养基改良马丁液体培养基（批号：120327）、改良马丁琼脂培养基（批号：120319）、玫瑰红钠琼脂培养基（批号：120207）、营养肉汤培养基（批号：1xx2）、营养琼脂培养基（批号：111225）、胆盐乳糖培养基（批号：120415）、4-甲基伞形酮葡糖苷酸(MUG)培养基（批号120622）均由北京三药科技开发公司提供。 14菌种枯草芽孢杆菌BacillussubtilisCMCC(B)63501、金黄色葡萄球菌StaphylocousaureusCMCC(B)26003、大肠埃希菌EscherichiacoliCMCC(F)44102、白色念珠菌CandidaalbicansCMCC(F)98001、黑曲霉AspergillusnigerCMCC(F)98003均由中国药品生物制品检定所提供。 2实验方法 21菌液制备分别接种枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌的新鲜培养物至营养肉汤培养基中，于3235培养24h，用09%的无菌氯化钠溶液以10倍稀释法稀释至10-510-7，制成每1ml含菌数为50100cfu的菌悬液备用。 接种白色念珠菌的新鲜培养物至改良马丁培养基中，于2426培养48h，用0.9%的无菌氯化钠溶液以10倍稀释法稀释至10-410-6，制成每1ml含菌数为50100cfu的菌悬液备用。 取黑曲霉菌的新鲜培养物至改良马丁琼脂斜面培养基中，于2426培养7d，用5ml09%的无菌氯化钠溶液将孢子洗脱，取洗脱液以10倍稀释法稀释至10-410-6，制成每1ml含菌数为50100cfu的菌悬液备用。 22供试液制备取供试样品10g于灭菌容器中，加入pH70无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液100ml，混匀，得110的供试液备用。 23菌落计数方法及验证 231菌落计数方法采用常规法对细菌、霉菌及酵母菌进行菌落计数，通过回收率测定进行方法学验证3。 232回收率测定试验组：取110供试液1ml、含50100cfu试验菌的菌液1ml加入平皿中，5种试验菌每种菌平行制备2个平皿。在加有枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌菌液的平皿中，立即倾注营养琼脂培养基，待凝固后，于3235培养48h，观察记录菌落数；在加有黑曲霉菌、白色念珠菌菌液的平皿中，立即倾注玫瑰红钠琼脂培养基，待凝固后，于2426培养72h，观察记录菌落数。 菌液组：取含50100cfu试验菌的菌液1ml加入平皿中，5种试验菌每种菌平行制备2个平皿。在加有枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌菌液的平皿中，立即倾注营养琼脂培养基，待凝固后，于3235培养48h，观察记录菌落数；在加有黑曲霉菌、白色念珠菌菌液的平皿中，立即倾注玫瑰红钠琼脂培养基，待凝固后，于2426培养72h，观察记录菌落数。 供试品对照组：取110供试液1ml加入平皿中，共制备10个平皿。在5个平皿中，立即倾注营养琼脂培养基，待凝固后，于3235培养48h，观察记录菌落数；在另外5个平皿中，立即倾注玫瑰红钠琼脂培养基，待凝固后，于2426培养72h，观察记录菌落数。 回收率计算方法：试验组的菌回收率（%）=（试验组菌落数平均值-供试品对照组菌落数平均值）/菌液组菌落数平均值100%。 24控制菌（大肠埃希菌）检查方法及验证 241控制菌检查方法采用常规法对控制菌大肠埃希菌进行检查。 242控制菌检查方法的验证试验组：取110供试液10ml，含50100cfu大肠埃希菌的菌液1ml，加入100ml胆盐乳糖培养基中，于3235培养24h。 阳性对照组：取含50100cfu大肠埃希菌的菌液1ml，加入100ml胆盐乳糖培养基中，于3235培养24h。 阴性菌对照组：取110供试液10ml，含50100cfu金黄色葡萄球菌的菌液1ml，加入100ml胆盐乳糖培养基中，于3235培养24h。 供试品对照组：取110供试液10ml，加入100ml胆盐乳糖培养基中，于3235培养24h。 检查方法：分别取上述试验组、阳性对照组、阴性菌对照组和供试品对照组的培养物02ml接种至装有5mlMUG培养基的试管内，3235培养24h，在366nm紫外线下观察，若管内培养物出现荧光，为MUG荧光阳性；否则，为MUG荧光阴性。观察后滴加靛基质试液，若液面呈玫瑰红色，为靛基质阳性；若液面颜色无变化，为靛基质阴性。 3结果 由表1可见，采用常规法验证，枯草芽孢杆菌、大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、白色念珠菌、黑曲霉菌回收率均大于70%，说明灯盏花乙素苷元对上述5种菌株无明显抑制作用。由表2可知，灯盏花乙素苷元的控制菌检查可按常规法进行。 4讨论 灯盏花乙素苷元为人工半合成，不同生产工艺下得到的灯盏花乙素苷元产品，其所含杂质或溶剂残留成分往往不尽相同，其抑菌行为或抑菌作用的强弱程度也往往不同。因此，当灯盏花乙素苷元生产工艺或方法发生变动时，应对产品的微生物限度检查方法进行重新验证。微生物限度检查是药品质量检查的重要内容。在人工合成药物的研制过程中，一些研究机构或研究人员往往只注重产品本身的化学成分质量研究，而忽视或根本不进行产品的微生物限度检查或方法学研究，这是不科学、不合理的。按照中国药典的要求，应对用于非规定灭菌制剂的合成原料药进行微生物限度检查及方法学验证，检查项目包括细菌数、霉菌数、酵母菌数及控制菌检查。 灯盏花乙素苷元对枯草芽孢杆菌、大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、白色念珠菌和黑曲霉菌5种菌株无明显抑制作用，可采用常规法对其进行微生物限度检查。 参考文献 1车庆明，潘丽怡，陈颖，等灯盏花乙素苷