妊娠期暴露毒死蜱对子鼠成年后脑组织氧化损伤的研究.doc

妊娠期暴露毒死蜱对子鼠成年后脑组织氧化损伤的研究 张敏徐肖倩刘建东刘现洲陈文婕塔娜戴红 内蒙古医科大学，内蒙古呼和浩特010059 摘要目的探讨大鼠妊娠早期暴露有机磷农药毒死蜱对子代鼠成年后大脑氧化损伤与机制。方法在母鼠妊娠后第6天至子鼠出生后第21天给予灌胃染毒，染毒剂量1/50LD50、1/100LD50、1/180LD50浓度的CPF和玉米油组。待子鼠长到第8周后处死，处死取脑做匀浆测大脑匀浆中丙二醛（MDA）含量、超氧化物歧化酶（SOD）活力、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-PXD）活力。结果随着染毒剂量的增加，SOD的活力、GSH-PX的活力下降；而MDA的含量增加，并呈现出一定的剂量反应关系。各暴露染毒剂量组的上述指标还与玉米油对照组之间的差异有统计学意义（P0.05）。结论妊娠期毒死蜱暴露对8周龄子鼠大脑组织具有神经毒性，其机制可能与毒死蜱暴露至大脑氧化损伤有关。 关键词毒死蜱；脂质过氧化；丙二醛；超氧化物歧化酶；谷胱甘肽过氧化物酶 R473.6A1674-0742（xx）03（c）-0003-03 作者简介张敏（1987-），女，内蒙古包头人，硕士研究生在读，研究方向：环境卫生。 通讯作者戴红（1958-），女，辽宁大连人，博士，教授，研究方向：环境卫生和职业卫生，bennidaialiyun.。 毒死蜱是美国陶氏化学公司于1965年开发研制出来的一种高效、低毒、广谱、低残留和低抗药性的有机磷杀虫杀螨剂1。毒死蜱在使用中容易在瓜果蔬菜表面残留，以及其在生物体内富集，导致毒死蜱暴露者人和动物产生多种毒性反应2。由于毒死蜱具有亲脂性，进入体内的毒死蜱可以通过血脑屏障进入大脑。而且毒死蜱还可以通过胎盘屏障进入胎儿的体内3。故毒死蜱的广泛大量的使用引起了人们对其慢性毒性作用以及对生态环境影响的担忧和重视，虽然国内外已就毒死蜱的全身及慢性中毒作用开展了研究探讨，但是毒死蜱对生物体妊娠期暴露染毒致子代成年后神经系统的损伤和脂质过氧化机制研究报道所见不多，因此xx年612月间就此开展动物体内妊娠期毒死蜱暴露染毒致子代成年后神经系统损伤以及有关机制研究。 1材料与方法 1.1材料 1.1.1实验动物健康3周龄wistar大鼠：雌鼠40只，体重6080g；雄鼠20只，体重7090g。动物购于内蒙古实验动物中心，符合国家二级标准，合格证号8806R011。自由饮水及进食。 1.1.2主要试剂97毒死蜱农药；MDA、SOD、GSH-PX试剂盒。 1.2方法 1.2.1动物模型的建立选择3周龄Wistar大鼠，40只雌鼠与20只雄鼠，自由饮水及进食，养至成年。成年后雌雄以21的比例合笼交配，确认雌鼠妊娠后将其随机分为4组：对照组（玉米油溶剂组）和CPF浓度分别为1/50LD50、1/100LD50、1/180LD50（LD50为135mg）的3个暴露组，于GD6（gestationdays，GD，妊娠后6d）PND21（postnataldays，PND，出生后21d）经灌胃给予雌鼠染毒。子鼠出生后21d断乳，并继续自由饲养至8周龄处死。 因经口暴露染毒能更好的控制剂量，故采用灌胃染毒。而胎鼠和新生鼠则通过母鼠间接染毒即CPF通过胎盘和乳汁对仔鼠染毒。同时，GD6到PND21是子鼠大脑器官形成到神经发育成熟时期。本实验选择通过母鼠染毒子鼠神经发育敏感阶段间接暴露毒死蜱的。以评价受试物毒死蜱在整个神经发育阶段染毒对子代出生后发育影响的毒性作用。 1.2.210%大脑组织匀浆的制备子鼠饲养8周龄末乙醚麻醉，心脏采血处死；即刻分离摘取大脑，并将其纵向分成两半，左侧大脑称重后甲醛固定待检；右侧大脑称重后放入离心管中，加入其重量9倍体积的预冷0.9%的生理盐水，用组织匀浆机充分研磨制备10%大脑组织匀浆，继而3000r/min、10min离心，上清备用。 1.2.3脑组织神经毒性及其氧化损伤指标的检测利用南京建成生物工程研究所试剂盒检测8周龄子鼠10%大脑组织匀浆中谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-PX）、超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA），具体操作按照说明书实施。 1.3统计方法 应用SPSS13.0统计软件进统计分析。体重、脑重、脏器系数、MDA含量、SOD活力、GSHPX活力等为计量资料采用方差分析各组差异；非正态资料和方差不齐的资料用秩和检验分析。2结果 2.1毒死蜱对子代鼠脏器系数的影响 脏器系数的计算公式：脏器系数（%）=（脏器重量/体重）100% 经SPSS软件的方差分析，各剂量组间8周龄大鼠体重和大脑重的差异无统计学意义（F=0.23，P=0.880.05；F=0.67，P=0.580.05），但伴随染毒剂量的增加大鼠体重和大脑重均呈现下降趋势；同时各剂量组间大脑脏器系数随染毒剂量的增加也有下降的趋势（F=0.67，P=0.580.05），见表1。 2.2妊娠期毒死蜱暴露对8周龄子鼠大脑SOD活力的影响 GD6PND21毒死蜱暴露后，各暴露染毒剂量组8周龄子鼠的SOD活力的差异有统计学意义（F=44.77，P0.05），经SNK法进一步两两比较发现各染毒剂量组的SOD活力均低于玉米油溶剂对照组，差异有统计学意义（P0.05）。而1/100LD50组与1/50LD50组间SOD活力的差异无统计学意义（P=0.610.05），但仍然能看出随着CPF剂量下降，脑中SOD活力有下降的趋势，见表2。 2.3妊娠期暴露CPF对8周龄子鼠成年后GSH-PX活力的影响 上述各剂量组的数据资料基本服从正太分布，差异无统计学意义（P0.05），因方差不齐，后经自然对数转换发差齐且P0.1，各暴露染毒剂量组间GSH-PX活力的差异经SPSS分析差异有统计学意义（F=23.45，P0.05）。进一步SNK法比较显示：1/180LD50剂量组与玉米油对照组间的差异无统计学意义（P=0.360.05）；而1/100LD50与1/50LD50组间的差异无统计学意义（P=0.7440.05）。但是1/100LD50组、1/50LD50组中分别与1/180LD50组、玉米油对照组比较，GSH-PX活力差异有统计学意义（P0.05），且随着染毒剂量的增加有下降趋势。见表3。 2.4妊娠期暴露毒死蜱对8周龄子鼠大脑中MDA含量的影响 经过方差分析可见，各暴露染毒剂量组8周龄子鼠大脑中MDA含量的差异有统计学意义（F=53.49，P0.05）。经SNK法进一步两两比较发现，任意两组间总体均数差异有统计学意义（P0.05）。各剂量组MDA的含量随着染毒剂量的增加而增加，并呈现剂量-反应关系。见表4。 3讨论 脏器系数又称脏体比，是实验动物某脏器的重量与其体重之比值。通常各脏器与体重的比值比较恒定。动物染毒后，受损脏器重量可以发生改变，故脏器系数也随之而改变。该次实验根据设计选择大鼠大脑组织，结果显示各剂量组体重、大脑重及脏器系数的差异无统计学意义；但这些指标却伴随着染毒剂量的增加均有下降趋势，该下降趋势提示大脑可能是毒死蜱毒作用的潜在靶器官。 SOD是一种广泛存在生物体内，能够清除生物体内的超氧阴离子自由基，维持机体中自由基产生和清除动态平衡的一种金属酶，具有保护生物体，防止衰老和治疗疾病等作用4。是细胞内抗脂质过氧化反应的酶的保护系统的重要成分5。该研究实验显示：毒死蜱各染毒暴露剂量组的子鼠脑SOD活力均低于溶剂对照组（玉米油组）。提示毒死蜱可能造成大脑的氧化损伤。且损伤程度（SOD活力的下降）可能与毒死蜱染毒剂量呈负相关。而结果中1/100LD50组与1/50LD50组的差异无统计学意义，可能源于已近成熟的8周子鼠身体是代偿机制的补偿作用所致。 GSH-PX是生物机体内重要的抗氧化酶之一，它可以消除机体内的过氧化氢及脂质过氧化物，阻断活性氧自由基对机体的进一步损伤，是生物体内重要的活性氧自由基清除剂6。该实验检测结果显示：1/180LD50剂量组和玉米油组GSH-PX活力高于1/50LD50、1/100LD50剂量组，说明低剂量暴露组子鼠大脑中可致大脑损伤的自由基较少，从而GSH-PX消耗相应就少；但是中剂量暴露组与高剂量暴露组之间、低剂量暴露组和玉米油对照组之间的差异无统计学意义，其原因可能是子代鼠在生长发育过程中通过母体暴露毒死蜱的剂量往往不利控制，加之子鼠个体的差异和生理的代偿机制的差异的影响。 MDA是氧自由基引起脂质过氧化的终产物，是反映氧自由基损害程度的重要指标7。组织中MDA含量的多少表示脂质过氧化的强度。该实验结果显示：MDA的含量随着染毒剂量的增加而升高，且呈现出剂量-反应关系。说明各染毒暴露剂量组的子鼠大脑受到不同程度的氧化损伤，而染毒的剂量越高，产生的脂质过氧化的终产物越多。 生物体内的氧化代谢会产生少量的自由基，但是在一些损伤因素作用下可以诱导体内大量自由基的堆积，细胞中抗氧化保护机制不足时，使活性氧产生堆积并对细胞产生毒性，从而产生氧化和抗氧化的不平衡状态，这种状态称为氧化应激。所以大脑在受到损伤后，抗氧化应激的酶类SOD和GSH-PX就会产生消耗。该实验的数据也显示出来随着剂量的增加这两个酶活力的变化趋势，表明抗氧化系统启动，脑组织受到氧化损伤。而氧化损伤的终产物MDA更是由剂量反应关系反应了脑组织的损伤程度。实验提示大家在1/50LD50、1/100LD50、1/180LD50剂量的毒死蜱还是会通过母体造成孩子成年后的脑组织的氧化损伤，要引起人们的重视。 参考文献 1李亚楠，刘晶晶，陈少华，等.毒死蜱的应用现状及降解研究进展J.广州农业科学，xx（6）：92-97. 2罗鹏飞，张永青，苏健，等.毒死蜱的毒性及其对人类的危害J.江苏预防医学，xx（7）：36-38. 3ParranDK.MagninG，LiW，etal.ChlorpyrifosaltersfunctiongalintegrityandstructureofaninvitroBBBmodel：co-culturesofbpvineendothelialcellsandneonatalratastrocytesJ.Neurotoxicology，xx，26（1）：77-78. 4李勇.超氧化物歧化酶（SOD）的应用研究进展J.生物化工材料工程研究，xx，12，24（6）：9-11. 5雷小英，李素平.毒死蜱对大鼠脂质过氧化的影响J.工业卫生与职业病，xx