NY T 403-2000 脱毒苹果母本树及苗木病毒检测技术规程.pdf

1 i 1中 华 人 民 共 和 国 农 业 行 业 标 准N Y / T 4 0 3 -2 0 0 0 脱毒苹果母本树及苗木病毒检测技术规程Ru l e s f o r v i r u s d e t e c t i o n o f v i r u s - f r e e mo t h e r t r e e a n d s e e d l i n g a p p l e s2 0 0 0 一 0 9 一 2 2发布2 0 0 0 一 1 2 一 0 1 实施中华人民共和国农业部发 布N Y/ T 4 0 3 -2 0 0 0前言 为了有效地实施对脱毒苹果苗木质量检验和管理， 规范脱毒苗木市场， 促进脱毒技术的推广， 实现脱毒苹果苗木病毒检测的规范化、 标准化， 特制定本规程。本规程在参照国内外苹果病毒检测技术最新研究进展的基础上， 结合当前国内生产实际， 力求达到快速、 准确、 可操作性强的检测要求。检测对象主要选择生产上发生分布范围广、 危害性大的病毒。检测方法主要采用指示植物检测和 A蛋白夹心酶联免疫吸附检测。 本规程内容包括脱毒苹果母本树及苗木病毒检测的适用范围、 检测对象、 抽样方法、 检测方法和质量要求。 本标准的附录 A是标准的附录。 本标准由中华人民共和国农业部提出。 本标准主要起草单位: 农业部植物脱毒 种苗质量监督检验测试中 心( 济南) 、 山 东省植物保护总站。 本标准主要起草人: 李明立、 刘敬东、 商明清、 华崇钊、 孙作文、 任宝珍。中华人民共和国农业行业标准 脱毒苹果母本树及苗木病毒检测技术规程NY / T 4 0 3 -2 0 0 0Ru l e s f o r v i r u s d e t e c t i o n o f v i r u s - f r e e mo t h e r t r e e a n d s e e d l i n g a p p l e s1范围 本标准规定了脱毒苹果母本树及苗木的病毒检测方法和操作规程。 本标准适用于 脱毒苹果母本树( 砧木原种、 接穗) 、 组培苗及脱毒苗 木的病毒检测。2 引用标准 下列标准所包含的条文， 通过在本标准中引用而构成为本标准的条文。本标准出版时， 所示版本均为有效。所有标准都会被修订， 使用本标准的各方应探讨使用下列标准最新版本的可能性。 G B 1 2 9 4 3 -1 9 9 1 苹果无病毒母本树和苗木检疫规程 N Y 3 2 9 -1 9 9 7 苹果无病毒苗木3 定义 本标准采用下列定义。3 . 1 苹果无病毒母本树 用苹果无病毒 原种材料繁育的用于 提供品种接穗或营养系砧木的 母株( 见N Y 3 2 9 -1 9 9 7 中3 - 1 ) .3 . 2 苹果无病毒苗木 用无病毒接穗和无病毒砧木繁育的苹果嫁接苗或无病毒材料通过组织培养方法繁育的苹果自根苗( 见 N Y 3 2 9 -1 9 9 7 中 3 . 3 ) ,4 检测对象 苹果褪绿叶 斑病毒( A p p l e c h l o r o t i c l e a f s p o t v i r u s , A C L S V ) ， 苹果茎痘病毒( A p p l e s t e m p i t t i n g v i r u s , A S P V ) ; 苹果茎沟病毒( A p p l e s t e m g r o o v i n g v i r u s , A S G V ) ,5 抽样5 . 1 脱毒母本树抽样 每株均需检测。 春季从待检母本树上选取嫩芽或幼嫩叶片或花期的新鲜花瓣( 休眠期取一年生枝条的皮层) 作为检测样品。5 . 2 组培苗的抽样5 . 2 . 1 脱毒核心材料: 每株均需检测。5 . 2 . 2 扩繁组培苗: 每次扩繁随机抽取 l 0 o -2 %的样品检测。中华人民共和国农业部 2 0 0 0 一 0 9 一 2 2 批准2 0 0 0 - 1 2 一 0 1实施N Y / T 4 0 3 -2 0 0 03 出圃苗木的抽样 采用分层取样或随机取样等方法抽取样品， 抽样数量见表1 。 将第一次抽取的样品混合后进行二次抽样， 随机抽取 1 0 %的混合样品检测。 表 1 苗木抽样数量标准表苗木总数量， 株抽样百分率I %抽样最低数量， 株镇 1 0 0 0 06 - 1 01 00 1 0 0 0 03 - 5注:不足抽样最低数量的全部作为混合样品。6 检测方法6 . 1 指示植物检测法 按G B 1 2 9 4 3 -1 9 9 1 中5 . 4 病毒检验方法执行。6 . 2 A蛋白夹心酶联免疫吸附 检测法。 检测方法见附录 A,7 质量要求 凡酶联免疫检测或指示植物检测呈阳性反应的为带毒株。 母本树: 病毒病株允许率为。 。 脱毒苗木: 病毒病株允许率蕊3 . 0 %.N Y/ T 4 0 3 -2 0 0 0 附录A ( 标准的附录)A蛋白夹心酶联免疫吸附检测法A 1 溶液配制 所用化学试剂为分析纯级规格， 用水为燕馏水。Al . 1 洗涤缓冲液( P B S T, p H7 . 4 ) 氯化钠( N a C I ) 8 . 0 0 g 磷酸二氢钾( K H , P O , ) 0 . 2 0 g 磷酸氢二钠( N a 2 H P 0 , 1 2 H 3 0 ) 2 . 9 3 g ( 或N a z H P O 1 . 1 5 g ) 氯化钾( K C l ) 0 . 2 0 g 吐温- 2 0 ( T w e e n - 2 0 ) 0 . 5 0 mL 溶于蒸馏水中， 定容至1 0 0 0 m L , 4 保存。A l - 2 抽提缓冲液 聚乙 烯毗咯烷酮( M Wz s o0 。 一 。 。 。 。 )2 0 . 0 0 g 牛血清白蛋白1 . 0 0 g 溶于 1 0 0 0 mL P B S T中， 4 保存。A 1 . 3 包被缓冲液( p H 9 . 6 ) 碳酸钠( Na 2 C O 3 ) 1 . 5 9 g 碳酸氢钠( N a H C O , ) 2 . 9 3 g 叠氮钠( N a N , ) 0 . 2 0 g 溶于蒸馏水中， 定容至1 0 0 0 m L , 4 保存。A l - 4 底物缓冲液 二乙醇胺9 7 m L 叠氮 钠( N a N , ) 0 . 2 0 g 溶于8 0 0 mL蒸馏水中， 用2 mo l / L盐酸调p H至9 . 8 ， 定容至 1 0 0 0 mL , 4 保存。A 1 . 5 底物溶液( 现用现配) 。 0 5 g 4 - 硝基苯 酚磷酸盐溶于5 0 m L 底物缓冲液中。A 2 样品制备 取待检样品。 . 5 一1 . 0 g ， 加人5 m L抽提缓冲液研磨， 4 0 0 0 r / m i n 离心5 m i n ， 取上清液备用。A 3 操作步骤包被A蛋白: 每孔加1 0 0 f . L用包 被缓冲液按工作浓度稀释的A蛋白， 3 7 保湿孵育2 h ,洗板: 用洗涤缓冲液洗板 4 次， 每次3 - 5 m i n .包被第一抗体: 每孔加 1 0 0 P L用P B S T按工作浓度稀释的 抗体， 3 7 保湿孵育2 h ,洗板: 同A3 - 2 ,包被样品: 每孔加1 0 0 ri L , 4 保湿过夜。 同时设阳 性、 阴性和空白 对照， 可根据需要设置重复。洗板: 用洗涤缓冲液洗板4 -8 次， 每次3 - 5 m i n ,包被第二抗体: 每孔加1 0 0 t4 L 用P B S T按工作浓度稀释的抗体， 3 7 保湿孵育2 h ,洗板: 同A3 . 2 ,井月八/勺J月qUJ工卜U，ICO勺八嘴勺JqJ勺J，J，J工JJAAAAAAAANY/ T 4 0 3 -2 0 0 0A 3 . 9 包被酶标A蛋白: 每孔加1 0 0 p L 用P B S T按工作浓 度稀释的碱性磷酸醋酶标记的A蛋白， 3 7 C保湿孵育2 h oA