生化实验分析.doc

果蔬成分生化分析 果蔬成分的分析主要分为四个方面：维生素C含量的测定、总糖和还原糖含量的测定、蛋白质含量的测定、过氧化物酶的分析。 总体从实验目的、实验原理、实验试剂、实验结果和分析的角度进行分析一实验目的：1、掌握微量测定维生素C的方法和技术。2、了解果蔬中维生素C含量。3、掌握总糖和还原糖含量的测定方法。4、掌握蛋白质测定的方法和技术。5、了解果蔬中蛋白质的含量。6、了解聚丙烯酰胺凝胶的制作过程及结构特点。二实验原理：1.还原型维生素C可被氧化型2，6-二氯酚靛酚（下面简称染料）所氧化，成为氧化型维生素C。氧化型染料在中性或碱性溶液中呈蓝色，在酸性溶液中呈红色。成为还原型后为无色。用氧化型染料来滴定还原型维生素C，当滴至全部还原型维生素C被氧化后，在稍滴一点呈微红色为终点。滴定用去染料量与样品中还原型维生素C量成正比。（此法虽简单迅速，但氧化型染料亦能使其他还原型物质氧化，所以有一定缺点。）2.蒽酮比色法是一个快速而简便的定糖方法。其原理：糖类在较高温度下可被硫酸脱水成糠醛或糠醛衍生物，再与蒽酮缩合成蓝色化合物，在620nm处有最大吸收。多糖为非还原糖，可用酸将没有还原性的多糖和寡糖彻底水解成具有还原性的单糖，再利用还原糖的性质进行测定，这样就可分别求出总糖和还原糖的含量。3. 考马斯亮蓝法测定蛋白质浓度，是利用蛋白质-染料结合的原理，定量的测定微量蛋白浓度的快速、灵敏的方法。考马斯亮蓝G-250存在着两种不同的颜色形式，红色和蓝色。考马斯亮蓝G-250在酸性游离状态下呈棕红色，最大光吸收在465nm，当它与蛋白质结合后变为蓝色，最大光吸收在595nm。在一定的蛋白质浓度范围内，蛋白质-染料复合物在波长为595nm处的光吸收与蛋白质含量成正比，通过测定595nm处光吸收的增加量可知与其结合蛋白质的量。蛋白质和考马斯亮蓝G-250结合，在2min左右的时间内达到平衡，完成反应十分迅速，其结合物在室温下1小时内保持稳定。蛋白质-染料复合物具有很高的消光系数，使得在测定蛋白质浓度时灵敏度很高，可测微克级蛋白质含量。4. 用聚丙烯酰胺凝胶电泳法分离鉴定蛋白质，主要依赖于电荷效应和分子筛效应。再与标准样品对照即可确定各区带的成分。5. 在有过氧化氢存在下，过氧化物酶能使愈创木酚氧化，生成茶褐色物质，该物质在470nm处有最大吸收，可用分光光度计测量470nm的吸光度变化测定过氧化物酶活性。 三实验试剂：1%草酸溶液、2%草酸溶液、维生素C标准液、氧化型0.1% 2，6-二氯酚靛酚溶液、各种果蔬、蒽酮试剂、标准葡萄糖溶液（0.1mg/mL）、6mol/L HCl溶液、20% NaOH溶液、标准蛋白质溶液、考马斯亮兰G-250染料试剂、0.05mol/L TrisHCl缓冲液（pH6.8）、0.1 mol/L磷酸缓冲液pH7.6、反应混合液。四实验结果及分析：1.果蔬中维生素C的定量测定操作：1、制备新鲜果蔬液：如洗净新鲜橘子，擦干表面水分，剥去外皮，称20.0g橘子放入50mL量筒中，加2%草酸液至40mL刻度处（即稀释1倍）。用玻璃棒搅拌，静置10分钟，过滤，滤液即是（若样品中含大量铁，可用8%醋酸溶液提取，可在一定程度上延缓Fe2+ 还原染料）。2、染料液装入滴定管中：应驱除滴定管中的气泡，调整好零点。3、滴定维生素C标准液：吸取1.0mL维生素C标准液放入锥形瓶中，加9mL1%草酸溶液，摇匀，用染料液滴定至微红色保持15秒不褪色即为终点。记下所用去染料液数量，可算出1mL染料相当于多少mg维生素C。4、滴定样品液：吸取10.0mL样品液放入锥形瓶中，同上操作进行滴定。可做两份，求平均值。实验结果：Vc标液用去2,6-二氧靛酚0.3mlVCW萝卜：20.06g，定容到40ml ，每10ml消耗2,6-二氧靛酚：0.85ml;结果得：每一百克样品中维生素C含量m = 100=5.99mgVCW 盘菜 ：21.26g，定容到40ml ，每10ml消耗2,6-二氧靛酚：1.0ml; 结果得：每一百克样品中维生素C含量m = 100=6.21mg结果分析：不同果蔬中的维生素的含量不相同，如盘菜和萝卜中的Vc含量有差异，造成这种差异的原因可能是：1. 没有将果蔬充分的碾碎，维生素没有完全释放出来，或者一部分残留在实验仪器上；2. 在过滤多的时候，没有过滤完全，存在残渣；3. 在移液时，常常把液体从一个容器移到另一个容器中，使实验的误差较大；4. 在滴定时，没有明确液体刚变红的概念，可能滴得太多；5. 滴定的时间花费太长，还原性的物质发生了氧化。2.总糖和还原糖含量的测定操作：1、葡萄糖标准曲线的绘制，以吸光度为纵坐标，各标准液浓度（mg/mL）为横坐标做图得标准曲线。2、样品中还原糖的提取和测定称取1g实验材料，加水约3mL，在研钵中磨成匀浆，转入三角烧瓶中，并用约30mL蒸馏水冲洗研钵23次，洗出液也转入三角烧瓶中。于50水浴中保温约0.5h（使还原糖浸出），取出，冷却后定容至100mL。过滤后冰箱保存。不同果蔬需进行不同程度稀释。葡萄：取滤液0.5mL100mL；梨：取滤液1mL100mL；盘菜、萝卜取滤液10mL100mL。取1mL最终稀释液置于试管中，浸于冰浴中冷却，再加入4mL蒽酮试剂，沸水浴中煮沸10min，取出冷却后比色，其他条件与做标准曲线相同。测得的吸光度值由标准曲线查算出样品液的糖含量。3、样品中总糖的提取、水解和测定称取1g实验材料，加水约3mL，在研钵中磨成匀浆，转入三角烧瓶中，并用约12mL蒸馏水冲洗研钵23次，洗出液也转入三角烧瓶中。再向三角烧瓶中加入6mol/L盐酸10mL，搅拌均匀后在沸水浴中水解0.5h，冷却后用20%NaOH溶液中和至pH呈中性。然后用蒸馏水定容至100mL，过滤后冰箱保存。不同果蔬需进行不同程度稀释。葡萄：取滤液0.5mL200mL；梨：取滤液5mL100mL；盘菜、萝卜：取滤液10mL100mL。取1mL总糖的最终稀释液同上法进行还原糖测定。实验结果：标准曲线的绘制：012345标准葡萄糖溶液/mL00.10.20.30.40.5蒸馏水1.00.90.80.70.60.5置冰水浴中5min蒽酮试剂4.04.04.04.04.04.0煮沸10，冷却后室温放置10，在620nm处比色A620nm00.0430.1820.2570.4090.456 葡萄糖标准曲线 还原糖： 由标准曲线的溶液的浓度为： C1V1m 计算结果：萝卜 0.246 0.027mg/ml W= 100%=2.7%盘菜 0.337 0.037mg/mlW=3.7%总糖：萝卜 0.427 0.047mg/mlW=4.7%盘菜 0.3540.039mg/mlW=3.9%结果分析：在绘制葡萄糖标准曲线时，应使图上的点尽量聚集在直线附近，各标准液浓度与该溶液的吸光度呈线性关系，测定计算时可先根据标准液浓度查出该溶液的浓度，产生误差的可能的原因有：1.标准曲线绘制不够准确；2.实验过程中蒽酮试剂加进去后未摇匀；3.蒽酮加入的时间存在着间隔。3.果蔬中蛋白质含量的测定考马斯亮兰法操作：1、 标准曲线绘制加入考马斯亮蓝G-250蛋白试剂后，摇匀，放置2min后，在595nm波长下比色测定，记录A595。以各管相应标准蛋白质含量（mg）为横坐标、A595为纵坐标，绘制标准曲线。2、样品制备称取1g待测植物鲜样置于冰浴上的研钵内，加入1mLH2O或0.05mol/L TrisHCl缓冲液（pH6.8）研成匀浆，转入离心管，再用2mL水或缓冲液将附着在研钵壁上的研磨样品洗下并全部转入离心管，3500rpm离心1520min，其上清液即为蛋白质的提取液，供分析用。3、样品测定试管中加自制蛋白质样品1.0mL ，再加入5.0mL考马斯亮蓝G-250试剂，摇匀，放置5min后，在595nm波长下比色，记录A595。根据所测A595从标准曲线上查得蛋白质含量。实验结果： 管号 试剂01234 5 盘菜萝卜100g/mL牛血清白蛋白溶液mL00.20.40.60.81.000蒸馏水mL1.00.80.60.40.2000考马斯亮蓝液mL5.05.05.05.05.05.05.05.0A595nm0.0000.1780.3430.4800.6130.7250.1600.946蛋白质标准曲线由标准曲线可得：盘菜中蛋白质含量为180ug; 萝卜中蛋白质的含量为136ug。结果分析实验中产生误差的原因可能是：1. 加入试剂后没有在指定的时间内进行比色反应，蛋白质失活较严重；2. 比色杯没有冲洗干净，存在一些残留在上面。4. 过氧化物同工酶的分离（聚丙烯酰胺凝胶电泳） 操作1.贮液配制 按上表配制贮液，但应注意（1）配好的贮液用棕色瓶盛装置冰箱内保存，可放12个月。（2）过硫酸铵应当天配制。2. 电泳槽的安装垂直板电泳槽的式样很多，目前流行的是用有机玻璃做的两个“半槽”组成的方形电泳槽，中间夹着凝胶模子，是由成套的两块玻璃板装入一个用硅酮橡胶做成的模套而构成，由硅酮橡胶套决定两玻璃板之间距离约为1.5mm，形成一个“胶室”，胶就在这两板之间的胶室内聚合成平板胶。当凝胶模子与两半槽固定在一起后，凝胶槽子两侧形成前后两个槽，供装电极缓冲液和冷凝管用。将两块玻璃板用去污剂洗净，再用蒸馏水冲洗，直立干燥（勿用手指接触玻璃板面，可用手夹住玻璃板的两旁操作），然后正确放入硅胶条中，夹在电泳槽里，按对角线顺序旋紧螺丝，注意用力均衡以免夹碎玻璃板。安装好电泳槽用pH8.9缓冲液配制的1.5琼脂溶液封底，待琼脂凝固后即可灌制凝胶。3. 制胶将贮液由冰箱取出，待与室温平衡后再配制工作液。（1）配制分离胶A 3mLC 6mL0.14%过硫酸铵 12mL水 3mLTEMED 15L将分离胶沿长玻璃板加入胶室内，小心不要产生气泡，加至距短玻璃板顶端3cm处，立即小心地覆盖23mm的水层，静置待聚合（约40min），当胶与水层的界面重新出现时表明胶已聚合。# g; 1 X c2 R# Q（2）配制浓缩胶B 1.5mLD 3mLE 1.5mLF 6mLTEMED 18L0 P R2 z6 D2 s: Y$ G6 R! c3 k0 b. G7 e5 T1 P. J Q j9 q注：TEMED在灌胶前加，或者加完之后放在黑暗的环境中。3 BQ4 c) F: y( W8 J先倒掉分离胶上的水层，用吸水纸将水层吸干，但不要弄坏分离胶。立即加入浓缩胶，插入梳子（即样品槽模板），待胶凝后，小心取出梳子。将稀释10倍的电极缓冲液倒入两槽中，上槽（短板侧）缓冲液要求没过样品槽，下槽（长板侧）缓冲液要求没过电极，备用。 m8 S) X1 Y* ? c9 w- K0 r* A8 H9 J( _4样品的制备称取果蔬2g，剪碎，放入研钵中，加适量石英砂及5mL的样品提取液研磨成匀浆，置于离心管中，研钵用少量提取液清洗，洗液并入离心管，以14 000r/min的转速离心15min，取上清液定溶至10mL，贮存于低温冰箱备用。5点样先向上槽液中加入0.1%溴酚蓝34滴，搅匀。6 |+ X/ M7 Z. J: I+ J5 r; 用微量注射器（50L）吸取1020L样液，在浓缩胶上层点样。点样时须小心，防止样品液扩散。7 G. k! F/ O- R6 h5 S% J* E6电泳# I/ o3 K- Q; F1 r2 ON接好电源线（上槽即加样槽为负极）。打开电源开关，调节电流到20mA左右，样品进入到分离胶后加大到30mA，维持恒流。待指示染料下行到距胶板末端1cm处，即可停止电泳。把调节旋扭调至零，关闭电源，电泳约3h。7剥胶. j1 R1 n% u: ?6 b7 3 d5 W取出电泳胶板，去掉胶套，用微量注射器沿玻璃内面注入一定量的水后即可掀开玻璃，去掉浓缩胶（注意先进行测量），将分离胶放入培养皿。8染色、记录结果将配制好的染色液倒入培养皿，室温下110min后显示蓝色条带，后变红褐色。用去离子水漂洗，并拍照记录。实验结果： 实验结果图：萝卜：Rf=1.67.6=0.21盘菜：Rf1=4.67.6=0.61 Rf2=1.67.6=0.21结果分析：有实验结果可知，盘菜有2条条带，萝卜只有1条，由Rf1Rf 可得盘菜的过氧化物酶电泳的速度快，可知盘菜中的过氧化物酶的分子量小，萝卜中的分子量较大。盘菜中有两条色带，可知盘菜中至少有两种过氧化物酶，但是萝卜中只看到一天清晰的可能的原因是，萝卜中只有一条过氧化物酶或者其他的过氧化物酶的含量较少。5. 过氧化物酶活性的测定（比色法）操作： 1. 取上述的样品提取液2.5mL，定容至50mL刻度，备用。2. 取光径1cm比色杯2只，于1只中加入反应混合液3mL和磷酸缓冲液1mL，作为对照，另1只中加入反应混合液3mL和上述酶液1mL（如酶活性过高可稀释之），立即开启秒表记录时间，于分光光度计上测量波长470nm下吸光度值，每隔1min读数一次。实验结果：T12 3 4 5 对照0.0000.0000.00000000.000盘菜0.5740.5710.5710.5720.574萝卜0.2900.4420.5590.6190.656计算结果：盘菜第1分钟第2分钟第3分钟第4分钟过氧化物酶活力150510过氧化物酶比活力7.502.55萝卜第1分钟第2分钟第3分钟第4分钟过氧化物酶活力760585300185过氧化物酶比活力380292.515092.5结果分析：有实验数据可知：萝卜的过氧化物酶活力比盘菜强，盘菜第2分钟时酶的活性为0，可能的原因是盘菜制备的时间较长，使得盘菜中的过氧化物酶的活性不够，但是第3、4分钟时酶的活性得到了恢复，可能的原因是外界的温度使酶的活性发生了变化。萝卜中过氧化物酶的活性随着时间的增长而减弱，是符合酶的变化规律的，所以盘菜的实验误差较大。 实验小结 上述五个实验的分析与讨论，以及需要的注意点：实验一：