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多样性的进化和跳增Polo样激酶-1抑制剂 Polo样激酶（Plk1），是丝氨酸/苏氨酸酶中的一种，它是抗癌药物的发展历程中很具吸引力的样品，因为它涉及到细胞周期进程的规定及胞质分裂。这个激酶为开发Plk1抑制剂提供了两种途径：n端催化域（NCD）和polo-box域（PBD）。对于这两个域，一些天然产物被确定为Plk1抑制剂，一些则被模拟ATP和磷酸化肽段开发成P1k1抑制剂，天然产物分别为NCD和PBD所约束。本文不仅评论Plk1抑制剂的这两个途径的发展，还讨论了以多样性进化及药物开发的跳增过程中使用Plk1抑制剂为例，以及它们是如何影响药物设计和药效团模型的。1. 介绍 化学的空间是巨大的，据估计可能存在的药物如分子的数量就超过1060,这与目前已知的107形成了鲜明的对比。对于药物的发现，部署这么一个多样性的化学库是非常重要的。虽然天然产物，与特定分子的化合物和生物体产生不同的结构特点，可能只占化学空间里的很小一部分，通过自然选择，他们拥有一个独特的、巨大的化学多样性。个体天然产物及其结构成员有多个最佳的生物活性，因此最有可能绑定多个目标，然后影响它们的功能。因此，天然产物是目前最富有的新颖的化合物来源，在药物发现中发挥了重要作用，尤其是抗生素和癌症治疗领域的发展。 很多市场上的药物是原始的天然产物或者是源于天然产物经过一定的化学修饰，即天然产物已为获批药物和多年的多种疾病的候选药物提供的众多的支架。在这里，我们指的是小/中等化学修饰的多样性演变。可能是本案最知名的例子是衍生和结构简化类似物吗啡制剂，这是从鸦片中分离的一种强效镇痛剂，用来开发更多的镇痛化合物。另一个例子是阿托伐他汀，他汀类药物，是销售总额达到125000000000美元的医药史上最畅销的药物。这种化合物由美伐他汀得到启发和发展，从桔青霉分离的胆固醇降低剂。更多的他汀类药物通过多样性进化得到发展。在这种情况下，基于共同的分子对生物大分子，其药效团模型就可以被开发。然而，在少数情况下，成熟的配位体结构与其原来的模版并不相同，很难开发基于它们之间的相似性药效。在极端的情况下，虽然他们结合到相同的结合位点，但和一些配位体的尺寸完全不同。这是不可能概括这些配位体的共同特征的，或者说它违背了药效团的概念。我们称之为多样性的跳变。在药物发现的真实世界里，通过从类药物空间多样性的演变和跳增，药物学家追求的是将结构不同的配体，然后经过选择进一步发展成最好的。本文将重点对多样性的进化和多样性从天然产物如ATP和使用Plk1为例，讨论它们如何影响药物设计、药效团模型。2. Plk1抑制剂的进展2.1 蛋白激酶和基于ATP抑制剂多样性跳增的设计 蛋白激酶，拥有超过500个成员的的最大的蛋白家族之一，通过添加丝氨酸和苏氨酸的磷酸基团或酪氨酸残基来修饰其他蛋白质。磷酸化是许多疾病的一个必要步骤，包括癌症，炎症，糖尿病。因此，药物学家已经对蛋白激酶产生了极大的兴趣，已经作为治疗目标的药物靶点的第二大组。自2001年起许多激酶抑制剂已经被批准用于治疗癌症和炎症。 所有的激酶在ATP反跳的时候都有一个催化结合域的结合。ATP是一种核苷酸磷酸在细胞里作为辅酶。设计激酶抑制剂的策略是模仿ATP来适合催化和抑制目标。然而，ATP和成熟的抑制剂的结构是截然不同的。ATP是在生理条件下与许多负电荷的极性分子。然而大多数成熟的蛋白激酶抑制剂是中性的；它们中的一些甚至可以在PH值为7.4的环境带正点。在这种情况下，它是一种多样性跳增将ATP合成为激酶抑制剂。激酶催化裂，由不同的结合子的域，是一个N-末端的叶和叶之间形成较大的C-末端。ATP结合位点，类似一个狭小的疏通管道，显示了除了活化环和P环外的有限的运动。它关注的是由于不同的激酶的ATP结合裂的两序列和形状相似性程度高，很难发展所需的ATP竞争性抑制剂的选择性。然而，一些高选择性的ATP竞争性激酶抑制剂已经被开发了。激酶的铰链区，大部分的ATP竞争性激酶抑制剂形成两个，甚至三个氢键与蛋白质，包括一个氢键受体位于一个或两个氢键供体两侧。选择性是由看门人的侧链的尺寸/体积定义的部分。2.2 Plk1作为癌症治疗的目标Plk1基因是高度保守的亚家族的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶家族成员，命名为Polo样激酶，其中包括五名成员,Plk1-5位于哺乳动物细胞中，参与细胞的生长，以及在不同物种中的有丝分裂检查点调控。这五个成员，Plk1是最广泛的研究和表征，Plk1在M期的多个阶段起关键作用，并且作为细胞增殖的一个结果。与正常组织相比，Plk1在广泛的人类癌症中过度表达，包括乳腺癌，结肠癌，前列腺癌，胰腺癌，非小细胞肺癌，甲状腺乳头状癌，卵巢癌，等。Plk1也已被确定为一个阴性患者的预后标志物肿瘤。结合并抑制Plk1可导致有丝分裂停止，中断细胞分裂，凋亡敏感的肿瘤细胞群。因此，Plk1是一个非常有吸引力的目标在制定具体的抑制剂来选择性地治疗癌症的同时避免对正常组织的毒性。在过去的几年中，许多PLK1抑制剂拥有优秀的临床评价。关于PLK1抑制剂的一些评论已经发布，包括一些著名的PLK1抑制剂的临床前和临床数据。然而这篇综述，以讨论多样性演化和使用PLK1抑制剂作为例子。同样作为Plks家族的其他三名成员，Plk1由两个结构域组成：N-末端的催化结构域（NCD），这是负责ATP的结合和酶的活化，和C-末端的催化，但功能必不可少。Polo-box结构域（PBD），其功能是作为一个磷酸肽结合基序，被认为在靶向酶的催化活性的特定的亚细胞结构中发挥了至关重要的作用。两个领域内Plk1可望作为抗癌药物的发展目标。因此，可以根据其作用方式区分不同的PLK1抑制剂：ATP竞争性抑制剂（PLK1NCD抑制剂）和基板的竞争性抑制剂（Plk1的PBD抑制剂）。然而，PLK1抑制剂的作用机制尚未完全建立。表1列出了目前在临床前和临床研究PLK1抑制剂。2.3 Plk1抑制剂与NCD的结合Plk1的ATP结合裂深腔表现为激酶抑制剂发展的经典目标。然而，由于ATP结合裂缝在结构上高度保守，只有少数的小分子抑制剂能结合PLK1的NCD。一些著名的例子如图3所示。其中，BI2536和PHA680626不是Plk1的选择性：它们可以与Plk1、Plk2和Plk3相互作用；它们中的一些如BI 6727, GSK 461364, GW843682X, NMS-P937 Ro5203280和TAK-960等与Plk1则更具体化。到目前为止，许多携带不同抑制剂的Plk1 NCD和PBD的X射线结构晶体已经可以分解并存放在蛋白质数据库，它为观察配体如何与目标相互作用提供了良好的途径。然而，一些未经发布的人类的Plk1与ATP无法结合X射线结构晶体，但是斑马鱼的Plk1与ADP是可以结合的。给出hplk1与zplk1的高级序列，显示zplk1可能有相同的组织和功能如hplk1。因此讨论得出斑马鱼的Plk1可以替代人类的Plk1。zPlk1-ADP的复杂性表明ADP的活性部位的铰链区可以通过双氢键与Glu 117和半胱氨酸相互作用。一个氢键之间形成3-OH的核糖环和Leu45，赖氨酸68和甘氨酸49之间的两个氢键磷酸基团可观察到其形成。磷酸腺嘌呤在疏水口袋包括苯丙氨酸169，胱氨酸53，丙氨酸66和亮氨酸66都有残留。渥曼青霉素的真菌，绳状青霉类固醇代谢物，邬氏黄丝曲霉，是PLK1和PI3激酶的一种共价抑制剂。它与zPlk1的复杂都是有效的。该化合物具有与ATP完全不同的化学结构，我们可以说是这两种化合物间的一种多样性跳增。渥曼青霉素结合不同的ATP主要是通过共价键连接来催化赖氨酸68，除了氢键与相同的残留结合。一个氢键与活性位点的铰链区结合可以维持渥曼青霉素和胱氨酸119的五元环的羰基。渥曼青霉素的疏水性稠环占据疏水口，ATP的腺嘌呤也占据着。多种数据显示，ATP和渥曼青霉素与Plk1的NCD结合在相同位置有着不同的机制。BI2536、BI6727，由勃林格殷格翰公司开发，是对Plk1具有纳摩尔效力的两酮衍生物，他们都是ATP竞争性抑制剂，目前用于临床研究对癌症的治疗。BI2536与铰链区结合，通过两个特定的氢键与半胱氨酸133和CHOC链接形成一个杂环，与谷氨酸 131的相互作用。蝶啶酮和环戊基环在腺嘌呤与核糖部分的ATP通道，而哌啶环浸泡在溶剂。蝶啶酮具有-与苯丙氨酸183相互作用。环戊基环和乙基分别在两个疏水通道。氢键的桥接可以通过BI2536和赖氨酸82羰基之间观察。苯基环则夹在亮氨酸59和精氨酸136的侧链之间。甲氧基，这是所谓的PLK1选择性在亮氨酸132的铰链区创造的通道口。酰胺的连接具有亮氨酸59和精氨酸 57的双氢键。BI6727具有类似BI2536的结合模式，因为它们有一个非常相似的支架。该复合物可溶解部分被选为用于提高某化合物的药代动力学性质但不改变其生化性质和细胞分布。虽然在铰链区，三氢键的结合可以从强效PLK1NCD抑制剂和蛋白质之间观察。其他不同支架材料的Plk1 NCD抑制剂与BI2536的具有不同的相互作用。ASP194和谷氨酸140氢键结合形成的MLN0905是不能在BI2536与Plk1配合物的晶体结构下观察的。如果我们将这些与Plk1 NCD抑制剂结合，可以惊奇的发现，除了在铰链区的三氢键和堆积作用外，不同的残基具有不同的相互作用。然而，它们中没有被ATP的磷酸基团所占据的。化合物17是经过化合物16的稠环双环分离形成的，从而提高相对激酶宽板以及相对与Plk2和Plk3异构体的选择性。使用替代环系统是多样性演化的一种有效方法。RO5203280，最近报道的选择性PLK1抑制剂，应该经BI2536通过改变酮核心到嘧啶核心的转变来修饰。这是一个轻微的修改，但两者的选择性和亲和力都得到改进。TAK-960是一种在RO5203280中间苯环具有额外的氟原子的化合物。目前正在进行恶性实体肿瘤在成熟期第一阶段的评估。SBE13，基于结构的方法进行识别和优化，是一种消极PLK1II型抑制剂。 LFM-A13，另一种由分子建模鉴定的化合物，是一个小的ATP竞争PLK1抑制剂。20和21，特别是21，在BI2536中有着不同的支架，等。这里并没有两种化合物对PLK1的结合模式的X射线晶体结构。这也许是多样性跳增的一个例子。化合物12-20是有效的PLK1 NCD抑制剂，其中，除了15和20，它们都含有一个哌嗪环或类似的哌啶环。15和20有一个基本的胺基。这是在没有可用的晶体结构情况下的假设，这些基本的群体将在相同的结合方式的蛋白下相互作用。然而，据透露，12，13的六元环，和19是向不同方向和深度的溶剂，而16分别与谷氨酸140和二甲基氨基丙基组15形成一个氢键哌嗪环。2.4 Plk1抑制剂与PBD的结合Plk1的PBD被证明对特定亚细胞的定位和有丝分裂都是必要的。因此，它的抑制作用已经被提议作为小分子对Plk1抑制的一种替代方法。Plk类是包括PBD类在内的唯一的蛋白激酶，因此结合PBD与天然Plk1产物竞争可以提高Plk1的特异性抑制作用。因此，Plk1 PBD一直被认为是抗癌治疗的一个潜在的替代目标。Plk1 PBD由大约80个残基的两个polo-box主链组成，Plk1 PBD抑制剂可以阻断蛋白质与蛋白质的相互作用。PBIP1，作为PBD与蛋白相互作用的分离物，是Plk1和特定染色体丝粒定位的关键点。Plk1 PBD以磷酸化依赖的方式结合到PBIP1中的78区。不同的磷酸化，包括T78的PBIP1的一个着丝粒蛋白可以绑定Plk1的PBD，在形成直接的和桥接的氢键网络，可在赖氨酸540，色氨酸414，精氨酸516，ASP416的PB1和PB2图案之间以及亮氨酸491形成的间隙。带负电荷的PLHSpT的PT与磷酸基团的磷酸化是很重要的。包含PS/Pt-P/X一致序列的磷酸肽的相应底物已经得到开发。从PLHSpT的组氨酸的咪唑环经烷基化产生，一个意想不到的化合物23形成(CH2)8C6H5，以0.017uM的IC50值抑制PBD。另一个类似的化合物24从PLHSpT Pro残基延伸得到O(CH2)4C6H5，抑制Plk1 PBD的IC50值为0.014uM。这两种化合物都是非常灵活的，但有着两个效力增强的数量级。X射线晶体学研究表明，23和24的两条长疏水链都可以适合一条能够阻隔unliganded蛋白的X射线结构的疏水管道。这一长结合通道的新发现是意料之外的，但它的投入使用将大大提高新Plk1 PBD抑制剂的结合亲和力，可以提供特定的PBDPLK1抑制剂设计的一种新范式。最近，许多环状磷酸作为Plk1 PBD抑制剂。这些环状磷酸肽，例如PL-5，修改自 PLHSpT硫醚桥环。PLHSpT在母体化合物循环约束了对Plk1 PBD的抑制和选择性。通过环化限制抑制剂的构象是一种多样性演变。巧妙的部署可以降低熵的障碍物，显着增加结合的亲和力。到目前为止，只有五种小的类似药物的化合物作为Plk1的PBD抑制剂。百里醌，提取自目前在I期临床研究的黑种草的天然产物，以IC50值为0.014uM描述Plk1 PBD的抑制力。百里醌是分子量为164.21的一个小的中性化合物，比PLHSpT小得多，但它具有比PLHSpT更高的与PBD的亲和力。由于该化合物是迈克尔受体且其结构与磷酸化完全不同，提供了通过共价修饰与Plk1 PBD结合的方式。然而，X射线晶体结构可以显示它与Plk1 PBD结合的荧光识别位点。PLHSpT的结合证明，Plk1 PBD的抑制剂结合位点是磷酸基团的识别位点疏水性的一半和带正电的一半组成的。百里醌和poloxin的一种水解产物，在对于天然结构的磷酸基团结合的识别位点没有明显中断的PBD相互结合，但它们显然不模拟电荷的磷酸组。两个化合物都缺乏一个磷酸基团的负电荷，且并不以氢键与组氨酸538和赖氨酸540结合，但与色氨酸414之间有一个桥键。然而，经过量子力学的重新计算表明，阳离子-与质子化赖氨酸540和两种抑制剂相互作用能形成稳定的配合物。除此之外，两种抑制剂能够穿透慢慢移动它们形成的水晶体的氢键网络，最终将它们锁定在一个保守的水分子内。其他抑制剂如28，29，和30可能对Plk1 PBD有类似的约束机制，因为他们有相似的结构。2.5 PLK1抑制剂的结合机制尚不清楚除了以上讨论的Plk1的NCD和PBD抑制剂，有一些报道称PLK1抑制剂的结合机制尚不清楚。其中，ON01910以9-10nM的IC50值抑制Plk1的非ATP竞争行为。该化合物目前用于癌症治疗的III期临床试验。HMN-214是 HMN-176的一种前药。它影响Plk1基因的亚细胞定位，但其确切机制尚不清楚。I2是通过虚拟筛选鉴定的PLK1抑制剂。该化合物出相对ON01910对不同的肿瘤细胞有等效的抑制作用。作者认为，这种化合物可能有双重作用，因为它对ATP和hPlk1 PBD都有较高的结合亲和力。我们不可能讨论这些化合物的多样性演变和跳增，因为我们不知道它们是如何与Plk1结合的。3. 论述PLK1在增殖细胞与多种癌症中高度表达；下调PLK1能抑制癌细胞和移植瘤的细胞增殖。因此，PLK1，它提供了两个管道，NCD和特定的PBD，这昭示了开发抗癌药物的好的开端。到目前为止，针对NCD的药物开发已经获得成功，有几个结构不同的抑制剂正在临床试验中。这些化合物是ATP的模拟，在与ATP的结合中分离自Plk1 PBD，除了一些磷酸，只有五种小的类似药物的化合物支持Plk1 PBD抑制剂。其中，百里醌在被报道为Plk1 PBD抑制剂之前就被送到临床I期试验了。天然产物在发展Plk1的NCD和PBD抑制剂的过程中发挥了重要作用。ATP竞争性抑制剂是基于ATP的结合机制设计；但直到现在，没有小的磷酸化类似药物被合成，磷酸肽多样性演变的三种天然产物已经得到支持。由于抑制剂与Plk1管道结合的多样性和相似性，他们提供了在药物发现过程中的自然产物的多样性演变和跳增的优秀示范。ATP，细胞内的一种辅酶，在pH值等于7.4的环境中是一种高度带负电荷的分子。ATP，合成ATP竞争性Plk1抑制剂，与渥曼青霉素的天然产物具有完全不同的化学结构。主要原因是没有成熟Plk1 NCD抑制剂在空腔中，ATP的磷酸基团占据除渥曼青霉素外的空腔，其中共价结合到蛋白质腔。从ATP到渥曼青霉素，和从ATP到合成的ATP竞争PLK1抑制剂，都可以确认为多样性跳增。然而，ATP合成ATP竞争PLK1抑制剂的结构仍有一些共同之处，主要表现在它们可以与谷氨酸131残基和Cys133激酶的铰链区形成两个或三个氢键。其实，最有效的PLK1NCD抑制剂在铰链区形成三个氢键。然而，它通常是不包括在药效建模程序内的氢键。这确实是对于这样的程序的一个解决方式。BI2536和BI6727有相同的支架；它们的区别在于支架上的两个不同的取代基。取代基的改变主要是基于提高对目标性能和药代动力学的亲和力的目的。对于BI2536和BI6727，这是一个多样性演变。本文从探讨PLK1NCD抑制剂的结构，可以很直观的发现，除了与铰链区的基团形成三个氢键，这些结构的共同点是每个化合物具有碱性氮组，以及在大部分时间里这个群体处于不饱和的六元环状态。它不仅可以通过人的眼睛，还可以通过对这些基群以相同的方式与蛋白质作用的建模程序，产生错误的判断。然而，X-射线晶体结构显示，除了线性基本组和一个环胺，所有的不饱和的六元环在暴露溶剂的不同方向和深度，表明共同的结构有时也可以指多样性。Plk1 PBD是药物设计中不存在其他激酶的一个独特的通道。Plk1抑制剂在通道的结合表明了在这些抑制剂中有一个巨大的多样性跳增。许多磷酸化的蛋白称为PBIP1可以绑定到Plk1的PBD。PLHSpT延伸的组氨酸和脯氨酸残基使用柔性的长疏水链可以显著提高亲和力。这种通过到达疏水管道发生的多样性进化被阻挡在unliganded蛋白内。百里醌和其他四种已经确定的Plk1 PBD抑制剂从规模和结构上与PLHSpT明显不同，但百里醌和PLHSpT的磷酸基团Plk1 PBD的活性位点结合在同一位置。不寻常的阳离子-与醌和带正电荷的赖氨酸540之间的相互作用对于Plk1 PBD的结合是很重要的。这是不寻常的荧光模拟机制，它提供的醌的磷酸化肽与Plk1 PBD结合的竞争活力的新视角。然而，它为计算药物设计尤其是药效团模型裂纹提供了一个难题。4. 结论从发生在Pl