第四章药物定量分析与方法验证

第二节 定量分析样品的前处理方法 一、概述 1.结构特征与分析方法之间的关系 含卤素有机药物 R-X （F，Cl, Br, I ） 卤素与芳环相连 Ar-X 结合牢固， 需有机破坏 卤素与脂肪链相连 R-X 结合较不牢固，不需有机破坏 含金属有机药物 含金属有机药物 R-O-Me，有机酸或酚的金属盐/配位化合物； 结合不牢固，可直接测定 有机金属药物 R-Me ，结合牢固，适当处理后测定,三氯叔丁醇,泛影酸,碘番酸,酒石酸锑钾,富马酸亚铁,含金属有机药物,卡巴胂,不经有机破坏的分析方法 2. 药物分析中常用的分析方法 经有机破坏的分析方法,二、不经有机破坏的分析方法 （一）直接测定法 例如：富马酸亚铁的含量测定,终点： 邻二氮菲(+Fe3+),溶于热稀硫酸,Fe2+,铈量法,Ce4+,Fe3+,指示剂:邻二氮菲,(+Fe2+),红色,淡蓝色,（二）经水解后测定法 碱水解后测定法 适用于X与脂肪链相连的卤代烷烃 例如：三氯叔丁醇的含量测定 CCl3-C(CH3)2-OH + 4NaOH (CH3)2CO +3NaCl + HCOONa +2H2O NaCl + AgNO3 AgCl + NaNO3,（三）经还原分解后测定法 适用于Ar-I的药物 例如：泛影酸的含量测定,指示剂：曙红钠 终点：黄红,三、经有机破坏的分析方法 金属原子、卤素等与C结合牢固者，必须有机破坏 湿法破坏 药物分析中常用的有机破坏的方法有 H2SO4-HNO3法 (一)湿法破坏 H2SO4-HClO4法 H2SO4-硫酸盐法 H2SO4-H2O2,HNO3-KMnO4法等,干法破坏,低价态金属离子,（二）干法破坏 适用于含卤素、S、P等有机药物分析的前处理，也用于某些药物中Se盐的检查 1. 高温炽灼法 加无水Na2CO3、硝酸镁、氢氧化钙或ZnO以助灰化,2.氧瓶燃烧法,空心,A.燃烧瓶 B.铂丝网 C.D.盛固体样品滤纸及其折叠法 E.F.G.称取固体样品方法,A,G,F,E,D,C,B,氧瓶燃烧装置及称样方法,1） 仪器装置 500ml, 1000ml, 2000ml, 磨口、硬质 玻璃锥形瓶 2）称样 固体样；液体样要求 3） 燃烧分解操作法 4） 吸收液的选择 用于X、S、Se等的鉴别、检查、 含量测定时多数是H2O或H2O-NaOH；少数为 H2O-NaOH-H2O2.,取本品约20mg，精密称定，照氧瓶燃烧法进行有机破坏，用NaOH 溶液 2ml与H2O 10ml为吸收液，待吸收完全后，加溴醋酸溶液10 ml，密塞，振摇放置数分钟，加甲酸约1ml，用水洗涤瓶口，并通入空气流约35min，以除去剩余的溴蒸气，加KI 2g，密塞，摇匀，用Na2S2O3液 (0.02mol/L)滴定，至近终点时，加淀粉指示液，继续滴定至蓝色消失，并将滴定的结果用空白试验校正。,应用示例：碘苯酯的测定,碘苯酯的测定-反应方程式,第三节 药品分析方法验证 目的：证明采用的方法适合于相应检测要求。 起草药品质量标准 生产工艺变更 制剂组分改变 原分析方法修订,均需对分析方法进行验证,验证内容：准确度、精密度、专属性、检测限、定量限、线性、范围和耐用性,一、准确度 是指用该方法测定结果与真实值接近的程度，用回收率表示 （一）含量测定方法的准确度 1. 原料药：可用已知纯度对照品或供试品进行测定；或与已知准确度的另一方法测定的结果进行比较,2. 制剂：考察其他组分和辅料对回收率的影响 用含已知量被测物的制剂各组分混合物（包括制剂辅料）进行测定，回收率计算同原料药 向制剂中加入已知量的被测物进行测定,与已知准确度的另一方法测定的结果进行比较 （二）具体做法：测定高、中、低三个浓度，n=3, 共9个数据来评价回收率；用UV和HPLC法时，一般回收率可达98%102%；容量法可达99.7%100.3%。,二、精密度 是指在规定的测试条件下，同一个均匀样 品，经多次测定所得结果之间的接近程度。 （一）精密度表示方法 1. 偏差(deviation , d) d = 测得值-平均值=Xi-X 相对偏差（RD）d / X 100,最大相对偏差（允许差） 容量分析法0.3，仪器分析法3,2. 标准偏差（standard deviation, SD或S） S =(Xi X)2/(n-1)1/2 3. 相对标准偏差(relative standard deviation, RSD) RSD=标准偏差/平均值100%=S/X 100%,（二）验证内容,1. 重复性 在相同条件下,由一个分析人员测定所得结果的精密度. 2. 中间精密度 在同一个实验室，不同时间由不同分析 人员用不同设备测定结果的精密度。,重现性 在不同实验室由不同分析人员测定结果的精 密度。 （三）数据要求 均应报告标准偏差、相对标准偏差和可信限,三、专属性 指在其他成分(如杂质、降解产物、辅料等)可能存在下，采用的方法能准确测定出被测物的特性 鉴别、杂质检查、含量测定方法，均应考察其专属性 （一）鉴别反应 应能与其它共存的物质或相似化合物区分，不含被测组分的样品均应呈现负反应,（二）含量测定和杂质测定 色谱法和其他分离法，应附代表性的图谱，以说明专属性。 图中应注明各组分的位置，色谱法中分离度应符合要求。 在能获得杂质的情况下，可加到试样中，考察对结果的干扰。 在杂质和降解物不能获得的情况下，可用以验证方法和药典方法进行对照；也可用对试样加速破坏的方法，比较两种方法。,Chromatogram of BCEOC-labeled neurotransmitters standard (100 pmol in 10 L),四、检测限（LOD) 是指试样中被测物能被检测出的最低浓度或量，是限度检验指标。它无需测定，只要指出高于或低于该规定的浓度或量即可。 1.目视法 用含已知浓度被测物的试样进行分析，目视确定能被可靠地检测出的被测物的最低浓度或量，常用于显色鉴别法，TLC 2.当用GC和HPLC法时，一般以S/N2或3时的相应浓度来确定检测限。,五、定量限（LOQ) 是指样品中被测物能被定量测定的最低量，其测定结果应具一定准确度和精密度。 杂质和降解产物进行定量测定时，要求LOQ。常用信噪比法确定定量限，一般以S/N=10时相应的浓度进行测定。,LOQ,S/N=,Neurotransmitters standard at 2.441 nM,六、线性 是指在设计的范围内，测试结果与试样中被测物浓度或量直接呈正比关系的程度。 回归方程的相关系数（r）越接近1，表明线性越好,可用一贮备液经精密稀释，或分别精密称样，制备一系列（至少5份）供试液进行测定，以响应值对浓度作图，建立回归方程，求出r 如UV：制备一个标准系列，浓度点n =5 A=0.3-0.7 建立回归方程C = aA + b r 0.9999,七、范围 是指达到一定精密度、准确度和线性、测试方法适用的高低限度或量的区间。,如原料药和制剂含量测定：应为测试浓度的80%120%。 制剂含量均匀度检查：应为测试浓度的70% 130%。 溶出度或释放度中的溶出量测定：应为限度的20%。,八、耐用性 是指在测定条件有小的变动时，测定结果不受影响的承受程度。 典型的变动因素有：被测溶液的稳定性、样品提取次数、时间等。 HPLC变动因素有：流动相组成与pH，色谱柱，柱温，流速等。 GC变动因素有：色谱柱，固定相，担体、柱温、进样口和检测器温度等。,分析方法效能指标的具体应用： 1. 用于鉴别试验：只要求专属性、耐用性 2. 用于原料药中杂质测定和制剂中降解产物测定的方法： 用于定量：除检测限不要求外，其余指标均要求。 限度检查：只要求检测限、专属性、耐用性 3. 原料、制剂的含量测定及溶出度测定：不要求检测限和 定量限，其余均要求。,第四节 生物样品分析方法的基本要求 一、常用样品的种类、采集和贮藏 二、生物样品分析前处理技术,一、常用样品的种类、采集和贮藏,（一）血液 测定药物浓度指测定血浆或血清中的药物浓度 采集制备血浆或血清 贮藏：短期4、长期-20 （二）唾液 采集：自然分泌 贮藏： 4以下,（三）尿液 用于药物剂量回收研究，尿清除率、生物利用度等的研究 采集：自然排尿，时间尿，一定时间内排泄的尿液全部储存起来，记录体积,二、生物样品分析前处理技术,为什么要对生物样品进行前处理？ 蛋白质的去除方法？ 常用的分离、纯化方法？ 被测组分的浓集方法？,为什么要进行前处理？,存在形式多样：游离型药物、与蛋白质结合型药物、代谢物、葡萄糖醛酸苷、硫酸酯缀合物等 成分复杂：蛋白质、糖、脂肪、尿素 Na+、K+、X-等,（一）去除蛋白质 释放结合型药物、减少提取过程中乳化、保护仪器、提高灵敏度 加入与水混溶的有机溶剂 中性盐(常用硫酸铵、硫酸钠) 强酸（三氯醋酸、高氯酸、苦味酸） 加入含锌盐、铜盐的沉淀剂 酶解法 （二）缀合物的水解 酸水解/酶水解,（三）有机破坏 测定生物样品中的金属离子，常用HNO3-HClO4作为消解剂，一般得到高价态金属离子 （四）分离、纯化和浓集 使被测物在所用分析技术的检测范围内，常用萃取法,有机相水相,药物,杂质,2（1） ： 1,多在酸碱性条件下萃取,液-液萃取法（LLE）,（乙醚、氯仿）,有机相水相,2（1） ： 1,药物,杂质,多在酸碱性条件下萃取,液-固萃取法（LSE） 相当于缩小的柱色谱法 浓集 末次萃取液尽量少 挥去萃取溶剂,（五）化学衍生化（略） 可使药物：具有能被分离的性质 提高灵敏度 增强稳定性 提高对光学异构体分离的能力,练习与思考,A型题,1相对标准偏差表示的应是 A准确度 B回收率 C精密度 D纯净度 E限度,2表示两变量指标A与C之间线性相关程度常用 A相关规律 B比例常数 C相关常数 D相关系数 E精密度,14 A空白试验 B对照试验 C回收试验 D鉴别试验 E检测试验 1以同量的溶剂替代供试品同法进行测定试验 2在供试液中加入已知量的标准