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Nikon A1R 激光共聚焦扫描 显微镜操作指南 上海科技大学生命科学与技术学院 2016 年 7 月 A1R 操作说明书 1 目 录 1. 1. 激光共聚焦显微镜组件介绍激光共聚焦显微镜组件介绍 . 2 1.1 1.1 显微镜主机介绍显微镜主机介绍 2 1.2 1.2 显微镜调试的常用组件显微镜调试的常用组件 3 1.3 1.3 遥控器遥控器 4 1.4 1.4 软件控制软件控制 4 2. 2. 激光共聚焦显微镜的使用激光共聚焦显微镜的使用 . 6 2.12.1 开机顺序开机顺序 . 6 2.22.2 显微镜的操作显微镜的操作 . 7 3. 3. 拍摄共聚焦图像拍摄共聚焦图像 8 3.1 3.1 共聚焦光路调节共聚焦光路调节 8 3.2 xy3.2 xy 图像拍摄图像拍摄 9 3.3 xyz3.3 xyz 图像拍摄图像拍摄 . 12 3.4 xyt3.4 xyt 图像拍摄图像拍摄 . 13 3.5 3.5 大图拍摄大图拍摄 13 3.6 ROI3.6 ROI 荧光强度扫描荧光强度扫描 14 3.7 3.7 多点序列扫描多点序列扫描 15 4. 4. 图像保存和处理图像保存和处理 17 附录附录 . 23 A1R 操作说明书 2 1. 1. 激光共聚焦显微镜组件介绍激光共聚焦显微镜组件介绍 1.1 1.1 显微镜显微镜主机主机介绍介绍 （1）滤光片：包括 D-毛玻璃；NCB-色 温 平衡片；ND-减光片；“GIF”-绿色 滤 光片和用于 PFS 的红外滤光片； （2）视场光阑； （3）聚光器升降旋钮； （4）起偏器（DIC 用）； （5）聚光器对中旋钮； （6）孔径光阑； （7）聚光器模块（包括明视场，DIC）； （8）滤色块转盘（包括 DIC 检偏器）； A1R 操作说明书 3 （9）手动荧光光闸； （10）电动焦距调节旋钮； （11）ND 减光片； （12）遥控器； （13） 透射光电源； （14） 汞灯荧光光源； （15） PFS 控制器 （16） HUB 控制器 1.2 1.2 显微镜显微镜调试的调试的常用常用组件组件 前面板控制前面板控制 （1）状态显示屏； （2）PFS 开关按钮； （3）光路端口切换按钮； （4）中间变倍旋钮 侧面板控制侧面板控制 （1）调焦旋钮 （2）粗微调切换按钮 （3）物镜切换按钮； （4）滤光块，DIC 检偏切换按钮 （5）透射光光源开关（当遥控器透射光 源控制按钮打开时，此按钮无效） （6）透射光量度调节旋钮（当遥控器透 射光源控制按钮打开时，此旋按钮无效） （7）物镜复位 （8）物镜向下移动至最低处（约 500um） A1R 操作说明书 4 注意：在使用显微镜之前， 要把主机底座右后端的黑色 HUB 控制器 （显微镜示意 图 15 位置）右侧的电源开关打开。 1.3 1.3 遥控器遥控器 Ti Pad 长寿命汞灯遥控器 (1) 镜切换按钮 (2) 滤光块，DIC 检偏器切 换按钮 (3) DIC 检偏器快速切换按钮 (4) 光路端口切换按钮 (5) PFS ON/OFF (6) 聚光器转盘切换按钮 (7) 透射光源控制按钮 (8) 荧光光强控制 (9) 荧光光闸 1.4 1.4 软件软件控制控制 A1R 操作说明书 5 A1R 操作说明书 6 2. 2. 激光共聚焦显微镜的使用激光共聚焦显微镜的使用 2.12.1 开机顺序开机顺序 共聚焦部分共聚焦部分 （1）接通激光台的电源（特 别注意 488nm 和 561nm 激光 器的打开程序） （7）接通共聚焦控制器电源 显微镜部分显微镜部分 （2）接通汞灯（目视荧光观 察用灯）电源，打开约打开约 10min 10min 稳定，关闭需要超过稳定，关闭需要超过 15min15min 后才可以再次启动后才可以再次启动 （3）接通卤素灯（目视透射 光观察用灯）电源 （4）接通电动载物台电源 （5）Piezo 快扫台（不用不用共振共振 扫描扫描时时可略过此步可略过此步） （6）接通显微镜主体电源 计算机部分计算机部分 （8）开启计算机与显示器 （9）启动“NIS-Elements”软件（确保确保上述上述开机开机完成后才能打开完成后才能打开 软件软件） 19 Stand By A1R 操作说明书 7 2.22.2 显微镜的操作显微镜的操作 （1）明场观察 a) 打开电源开关，并打开显微镜透射光卤素灯电源开关； b) 把滤色块移到空位； c) 把起偏器，检偏器移出光路； d) 把聚光器切换到 A 状态； e) 检查出光端口。 （2） 微分干涉(DIC)观察 a) 按照明视场透射光观察方法调节好显微镜； b) 把起偏器，检偏器移入光路； c) 按照相对应物镜将聚光器转到相应 N1/N2 位置（请参 见另外所附对照表）； d) 检查出光端口； e) 旋转起偏器，选择最佳显示效果。 （3） 荧光观察 a) 打开荧光电源稍待片刻至光源指示灯不闪（打开约 10min 稳定，关闭需要超过 15min 后才可以再次启动） b) 确认透射光开关处于关闭状态； c) 检查出光端口； d) 选择合适的滤色块； e) 打开光闸，调节荧光亮度，进行观察； f) 不观察时，把光闸关掉，以避免荧光淬灭。 A1R 操作说明书 8 3. 3. 拍摄共聚焦图像拍摄共聚焦图像 3.13.1 共聚焦光路调节共聚焦光路调节 （1）打开软件 （2）NIS 的操作界面 （3）按需选择按需选择合适的 OC（Optical Configurations）成像条件 （4）建立新的光路 OC（Optical Configurations）配置 如果默认的快捷操作系统无法满足成像的需要，可重新进 行 Camera Settings 设定，建立新的 OC。 可根据样品情况选择所需染料或者荧光蛋白，并选择是否 需要拍摄明场透射光。亦可通过改变探测模式来改变接受光波 长范围：DU4：标准探测器，SD：光谱探测器，VF：虚拟 滤色片。 A1R 操作说明书 9 1探测器：当前所选探测模式 2通道交替：选择是同时打开所有用于扫描的激光，还是顺序地一次打开一 个激光器（用于防串色） 3Setting 按钮：打开 Optical path 窗口，用于选择探测器，二向色镜，探测 通道以及每个通道所对应的荧光染料，激光等 4状态：各个通道的设置情况 (染料名称，激光波长以及探测波长带宽). 5TD ：透射探测器状态处于使用中 (“ON“) 或是未使用 (“OFF“). 最后确认光路设置点击ok按钮。确认使用此光路配置，光 路设置窗口关闭 3.2 3.2 xyxy 图像图像拍摄拍摄 界面调出方式：软件灰色空白处，鼠标右击菜单中选择 Acquisition Controls - A1plus Compact GUI A1R 操作说明书 10 （1）拍摄流程： a) 选择共振Resonant或检流计式Galvano扫描方式。 （A1R 系统同时含有此 2 种扫描模式，） 如在光谱探测（Spectral Detector）模式和虚拟滤色片 (Virtual Filter)模式下，只有检流计式扫描模式可用，因此不能 改变扫描模式。 b) 选择要使用的激光/通道。 c) 在 Pinhole 的项目中选择要使用的激光波长。 点击 按钮，选择与物镜最匹配的针孔尺寸。 d) 点击 Scan按钮，边观察图像边调节激光功率和 检测器的灵敏度 HV。 HV：探测器灵敏度 Offset：信号的偏移（标准：0） Laser：激光功率（当鼠标移动到相应位置可直接使用滚轮进行 精细调节） e) 将像素数调整为所需要的分辨率。图像较暗时，请降 低扫描速度。 A1R 操作说明书 11 f) 根据需要进行 Average。 g) 点击 Capture按钮以获取图像。 h) 激活要保存的图像，从菜单栏中选择File - Save As 以进行保存。 （2）图像显示调节 点击 按钮调出 LUTs 窗口进行细致的图像显示调节。 （3）扫描区域调节 点击 Scan Area 窗口按钮，用鼠标拖动绿色边框，以缩小扫描 区域。在鼠标变为十字箭头的状态下移动边框， 鼠标右击以决定扫 描的位置。可在 Zoom 中 确认缩放倍率。在绿色边框的旋转用点 上拖动鼠标，可以 进行扫描区域的旋转。在 Rotation 中可以确认 所设定的旋转角度。旋转范围为 -90 度90 度。 缩放区域点右键 后，边框变绿，表示区域选定。 A1R 操作说明书 12 3.3 3.3 xyxyz z 图像图像拍摄拍摄 （1）点击软件左边工具栏 按钮，启动 Capture Z Series 对话框（如下图）。 （2）点击 Defined top bottom按钮。 （3）点击 Reset 按钮。 （4）点击 Scan 按 钮 ， 边 观 察 图 像 边 转 动 显 微 镜 的 调 焦 手 轮 （ 微 调 模 式 ）， 点 击 Top按钮，决定 Top。 （5）点击 Scan 按 钮 ， 边 观 察 图 像 边 转 动 显 微 镜 的 调 焦 手 轮 （ 微 调 模 式 ）， 点 击 Bottom按钮，决 定 Bottom。 （6）决定 Step （7）根据需要，选择Save to File，在保存的同时获取 A1R 操作说明书 13 图像。 （8）参照“3.2”Live 模式下设置拍摄参数。 （9）点击 Run now按钮，获取 Z 序列图像。 3.4 3.4 xyxyt t 图像图像拍摄拍摄 （1） 点击软件左边工具栏按 钮，启动 Capture Timelapse 对话框。 （2）决定时间间隔 （Interval）和持续时间 （Duration）。 （3）选择Save to File，在 保存的同时获取图像。 （4）参照“3.2”Live 模 式下设置拍摄参数。 （5）点击 Run now按钮，获取时间序列图 像。 3.5 3.5 大图拍摄大图拍摄 （1）从菜单栏中选择Acquire - Scan Large Image，启动 Scan Large Image 窗口。 （2）设定要扫描的范围。 A1R 操作说明书 14 （3）针对 Z Series 进行设定。 （4）设定图像的重叠补偿。 （5）选择有无阴影补偿。 （6）设定多通道拍摄参数 （7）在 Focus 中设定对焦方法。 （8）选择保存方法。 （9）选择保存路径和保存格式。 （10）点击按钮，获取 Large Image 图像。 3.6 3.6 ROIROI 荧光强度扫描荧光强度扫描 （1）点击，打开经时序列图像程序。 （2）鼠标右击软件上的灰色部分 ，从弹出的菜单中选 择 Analysis Controls - Time Measurement以调出控件界面。 （3）在图像上设定 ROI（Region Of Interest）。 a) 点击 Define按钮，启动 Define ROI 窗口。 b) 在图像上设定 ROI。 c) 点击Finish按钮以结束设定。 （4）进行经时变化分析。 a) 点击 Measure按钮，绘制图表。 b) 以中任意一种测量模式进行分 析。 Multi ROIs： 可以显示多个 ROI 的经时变化（每次 只可选择 1 个通道） Multi Dyes： 可以显示多个通道（ALL、Custom）的 A1R 操作说明书 15 经时变化（每次只可选择 1 个 ROI） c)点击，选择Export Data，点击 Export按钮，可以 保存为文本数据。 3.73.7 多点序列扫描多点序列扫描 （1）点击软件左边工具栏的按钮，启动 ND Acquisition 对话框。 （2）选择XY选项卡。 （3）操作电动载物台的摇杆，移动到要获取的点。（边观 察 Live 图像边移动会比较方便） （4）点击 Point Name，登录位置信息。如果选择 Include Z ，则 Z 位置也会被登录。可登录的有显微镜的 Z 位置或完美 调焦系统的偏移值（要跟踪的焦点的位置） （5）重复上述步骤(3)(4)，登录所需要的点。 （6）选择Time选项卡。 （7）决定时间间隔（Interval）和持续时间（Duration）。 （8）选择Save to File，在保存的同时获取图像。 （9）参照“3.2”Live 模式下设置拍摄参数。 （10）点击 Run now按钮，获取多点时间序列图 像。 A1R 操作说明书 16 XYZ Overview 面板提供高级载物台与 Z 轴控制功能 软件灰色空白处，鼠标右击菜单中选择Acquisition Controls - XYZ Overview A1R 操作说明书 17 4. 4. 图像保存和图像保存和处理处理 4 4.1 .1 图像保存图像保存 （1）NIS-Elements 软件图像图层： NIS-Elements 软件显示图像分为 3 个基本层次： a) 注释层：保存注释，测量信息； b) Binary 层：二元阈值分析； c) 图像层：根据相机不同获得不同位深的图像。 （2）NIS-Elements 文档类型： a) RGB 图像：彩色相机拍摄图像格式； b) 多通道图像（Multi-channel）：多通道拍摄单幅图像； c) Nd2 多维图像：包括时间，Z 轴，多点，多通道等的多 维图像。 （3）NIS-Elements 拍摄图像保存的格式： NIS-Elements 软件默认的图片格式有 2 种，jp2000 格式用于单 一图像的保存，nd2 格式 用于多维图像的保存。图像也可以保存成 tif，jpg，bmp，gif，png 等，多维图像可以保存 成 avi 等常见格 式。 注意：请在保存所需要图片格式前保存拍摄默认原始格式，原始 格式包含图片拍摄所有条件信息。查看拍摄信息，请在图像上单击 鼠标右键选择 image property。调用原图片拍摄条件，请在图像上右调用原图片拍摄条件，请在图像上右 击鼠标选择击鼠标选择 reuse camera sreuse camera settingsettings 工具。工具。 注意：如果要在 Windows 或者 Office 软件里查看拍摄得到的图 像，需要在 image 菜单下 convert 栏里将图像转换成 8 位 RGB 图 像，并另存为常见图像格式，例如 tif，jpg 等。 （4）图像查看 a) LUTs 注意：应用按钮后，图像原始荧光强度信息会被改变，如果 要对图像荧光强度进行测量，请勿按此按钮。该窗口也可以在预览 时使用。 A1R 操作说明书 18 b) 多通道平铺显示(Split Components) c) 缩放控制（Room Control） d) 一般控制（general control） 1 显示探测框，探测框应用与光强柱状图，自动曝光和自动白 平衡功能； 2 显 示 背 景 框 ， 背 景 框 用 于 参 考 区 域 的 背 景 扣 减（Image Background Subtract Background）； 3 显示网格，用来做粗略的距离的查看； 4 显示标尺，给图像加标尺，如果要用其他格式输出图像，请 使用 Burn Scale 功能； 5 测量框，选择测量范围； 6 感兴趣区域选择； 7 路径光强分析，使用 ViewAnalysis ControlIntensity Profile 功能可 以用来查看任意直线，折线路径上的各通道光强分布。 以上各个按钮处，均可以单击鼠标右键进行详细的设定和相应属 性的更改。 e) 状态栏（Status Bar）：显示当前图像定标信息，指针位 置，光强，图像形式和分辨率。 f) 通道的控制: 对于多通道图像，用鼠标左键选择已拍摄图像 的某个通道，将其拖出窗口即可得到单通道图像。如果要合并 2 个 单通道图像，只需要将一张图像的通道选中，同 样用鼠标左键将其 拖动到需要合并的图像窗口即可。通道的颜色可以用鼠标在对应通 道位置 右击，在 channel property 对话框中进行更改。 g) ND 控制 A1R 操作说明书 19 4.24.2 图像分析图像分析 （1）ROI Statistics 感兴趣区域统计: a. 打开需要分析的图像，选择感兴趣区域设定工具 （IV - 4. - f），电击图 标右边倒三角箭头，选择矩 形，椭圆或者自由曲线等模式，在图像上选取感兴趣 区 域范围（ROI 区域还可以用 ROI 菜单下的 ROI Editer 模式来进行修改和编辑）。 b. 在图像显示区域空白处点击鼠标右键弹出菜单， 选择 Analysis 里 ROI Statistics 项，弹出以下窗口，ROI 栏即可得到感兴趣区域面积，平均光强，总光强，信噪比 等信息。 （2）Thresholding 阈值分析: 阈值分析是通过软件生成一个 Binary 图层，来进行图像的分析。 A1R 操作说明书 20 1阈值分析模式选择：根据所需分析图像类型选择相 应的分析模式，RGB，HSI（对比度，饱和度，亮度分 析），MCH（单通道分析），Intensity（亮度分析）。 2阈值选取工具，选取相应大小范围阈值加入到所选 范围内，点可以对选取阈值范围更新计算 Binary。选 可以实时更新 Binary 图层信息。 3手动选择阈值范围，或者在左上或者右上角输入数 字来约束阈值范围； 4从左至右依次为清除碎片工具，平滑边缘工具，形 态学分割器，可以用来去除图像内细小碎片干扰，自动圆 滑区域边缘，自动分割有交叠的多个目标； 5对上面得到的目标进行筛选工具，根据大小，周 长，亮度等信息设定需要的 Binary 目标。 6查看阈值分析结果，在图像显示区域空白处点击鼠 标右键弹出菜单，选择 Analysis 里 ROI Statistics 项，如 上页图片，阈值分析得到的统计结果在表格中 Binary 栏 显示出来。 提示：提示： 在进行阈值设定后，根据需要可以在在进行阈值设定后，根据需要可以在 Binary Binary 菜单下选择菜单下选择 Fill in holes Fill in holes 工具工具 进行孔洞的填充或缩减，膨进行孔洞的填充或缩减，膨 胀，打开，封闭胀，打开，封闭, ,形态学分割等多种数学形态学图形修正形态学分割等多种数学形态学图形修正 工具进行工具进行 BinarBinary y 的微调，以使结果更准确。的微调，以使结果更准确。 （3）Binary Edit 二元蒙板层编辑：NIS-Elements 软件提供 Binary 编辑工具。按键盘的 Tab 键或者在 Binary 菜单选择 Binary Edit 项，软件自动切换到编辑界面，可以进行 Binary 区域的填充，切割，增加目标区域，修改目标区域等功能。 注意：注意：Binary Edit Binary Edit 可以进行前景和背景的编辑，编辑可以进行前景和背景的编辑，编辑 的时候请确认左上角图标是的时候请确认左上角图标是 FGFG（前景）（前景） 还是还是 BGBG（背（背 景）。景）。 （4）Object Count 目标计数：依照 Thresholding 的方法选择相 A1R 操作说明书 21 应的目标，按执行按钮，软件会自动计算当前条件下的目标数 量，并在下面列表中显示每个目标的面积，平均光强，周长等 等特征测量的信息。选择按钮可以以同样条件对整个 ND 文件的每一帧图片进行分析计数，然后在图标右端 下拉菜单选择输出格式为 txt 文本或者 excel 表格（需要系统 安装了 office）。如果要看所有目标的统计数据，请在 ROI Statistics 里的 Binary 栏查看结果。 （5）Annotations and Measurements 标注和手动测量： 使用 Annotations 栏，可以选择不同的标注方式进行图像 的注解和标记，从左到右依次为：箭头，直线，矩形，椭圆， 文字输入，折线，自由曲线。 在 Measure length 栏可以用来进行长度测量，从左到右依 次为两点之间距离测量，平行 线之间距离测量，折线路程长 度测量，对角线测量，自动寻找边缘测量距离等。 A1R 操作说明书 22 Area 栏进行感兴趣区域的面积测量，根据需要设定不同 的曲线，矩形，椭圆等 ROI 区域。 依次还可以对图像进行监督，半径，半轴长的测量，以及 手动计数和分类等功能操作。所有的测量结果均显示在下面的 列表中，通过列表左上角下拉菜单选择需要查看的测量结果类 型，可以分别查看统计数据并导出数据到本地。 6). Time Measurement 时间测量：在时间序列图像上选取感兴 趣区域（测量栏 ROI 处），选择 Measure 进行时间测量，可 以选择多个感兴趣区域进行测量，也可以对感兴趣区 域的多 个通道进行时间测量。测量结果可以以图表或者数据表格的形 式输出（在 Export 选 项进行选择）。 Multi ROIs：分析多个 ROI 区域的时间变化。 Multi Dyes：分析多个通道的时间变化。 A1R 操作说明书 23 附录附录一：一：显微镜显微镜光路调节和照明注意事项光路调节和照明注意事项 （一） 柯勒照明的调节方法 1. 选择 10X 物镜； 2. 调焦，使标本清晰成像； 3. 缩小视场光阑（显微镜视图 2 位置）； 4. 上下调节聚光器（显微镜视图 3 位置），使视场光阑边缘清晰； 5. 调节聚光器对中旋钮，使其居中； 6. 放大视场光阑，使其刚刚外切于视野。 （二） 长寿命汞灯电源的注意事项 1. 电源打开以后，大约 10 分钟左右光源达到稳定状态； 2. 电源关闭以后，至少要等 10 分钟才能重新打开。 （三） 物镜盖玻片矫正环的调节方法 1. 调焦，使图像相对最清楚； 2. 把矫正环向一个方向转动一 定角度，此时图像变模糊，调焦，使 图像相对最清楚； 3. 判断此时的图像质量是否有所改善。 如有改善，则按照该方向再旋转一定 角度；如质量下降，则反方向旋转； 1. 4. 重复 2）和 3）直到图像质量改善之后 又有所下降；反方向旋转，回到倒数第二 次的位置即可。 A1R 操作说明书 24 附录二附录二：TiTi- -E E 物镜，物镜，DIC DIC 插片，插片，DIC DIC 棱镜对照表棱镜对照表 T Ti i- -E:E: C Co om mb bi in na at ti io on ns s o of f o ob bj jecect tiv ive e a andnd DIDIC C prpris ism m Objective DIC Slider N1/N2 PlPla an n A Apopo 1010 10 N N1 1 PlPla an n A Apopo V VC C 2020 20 N N2 2 PlPla an n A Apopo 4040 40 N N2 2 PlPla an n A Apopo V VC C 6060 60 N N2 2 PlPla an n A Apopo V VC C 100100 100100 N N2 2 A1R 操作说明书 25 附录附录三：三：图标工具栏和左图标工具栏图标介绍：图标工具栏和左图标工具栏图标介绍： Open：打开文件 Z Stack Live：Z 轴序列预览 Save：保存当前文件 Integrate：叠加，多次拍摄图像累积 Save next：将当前文件保存为新文件 Average：平均，多次拍摄图像平均 Print：打印 Capture to RAM Buffer：拍摄存至缓 存 Undo：撤销前一步操作 Binary Toolbar：二元蒙板编辑工具 Redo：还原一步撤销的操作 Capture Multichannel：拍摄多通道 Live Fast：快速预览 Capture Multipoint：拍摄多点 RAM Buffer ON：打开内存拍摄 Copy：复制 Backgroud Correction ON：打开背景校正 Paste As New Image：粘贴复制图像 Optical Configurations：光路配置设定 Crop：剪切 New Optical Configuration：创建光路配 置 Run Macro：执行宏命令 Pointing Tool：指针按钮 Close All：关闭全部窗口 Magnifier Glass：图像放大工具 General Option：打开设置窗口 Annotations Measurement：注释和测量 Customize Toolbar：自定义工具栏 多维拍摄窗口 Define/Run Experiment：打开 Capture Time Lapse：拍摄时间序列 Capture Z Series：拍摄 Z 轴序列 A1R 操作说明书 26 附录四附录四：控制窗口介绍控制窗口介绍 NIS-Elements AR 软件所有控制窗口均可以在主菜单栏 View 菜单下找到，或者在图像 显示区 域点击鼠标右键弹出。 Acquisition： AVI Acquisition：AVI 拍摄 Auto Capture Folder：自动拍摄存储文 件 夹 Camera Settings*：相机设定 Capture FRET Image*：拍摄 FRET 图像 Filters and Shutters*：滤色块和光闸控 制 Lamp*：光源控制 ND Acquisition*：多维图像拍摄 Nosepiece*：物镜转盘控制 Microscope Control Pad*：显微镜控制 面 板 XYZ Navigation*：XYZ 导航 Z Series*：Z 轴序列 Visualization: Binary Layers：二元蒙板层编辑 Histogram：柱状图 LUTs: LUTs Opened Images：已打开图像 Preview： 预览窗口 Synchronizer：窗口同步器 XY Overview*：XY 预览 Analysis: Annotations and Measurements：注释和测量 A