铜对wnt6 基因表达及鹅羽绒生产性能影响的试验方法.doc

铜对wnt6基因表达及鹅羽绒生产性能影响的试验方法赵明(吉林农业大学动物科学技术学院长春吉林130118)摘要本文以吉林白鹅为研究对象，饲喂不同添加量铜日粮，结合Wnt6基因表达测定试探讨铜对鹅羽绒的促生长作用，重点介绍试验设计和试验方法，并提出试验难点和试验预期。关键词铜羽绒生产Wnt6基因表达试验方法前言铜是人类历史上最早使用的金属，铜大量存在于各种岩石和矿物中，自然界中铜以CuO、Cu+、Cu2+二种氧化态形式互相转化。在生物体中，铜是最基本的微量营养元素之一，大量研究表明1，2，铜至少存在于30多种酶中，铜通过多种酶参与机体的代谢、氧化磷酸化、自由基解毒、黑色素合成等过程，并能维持组织细胞的稳定性。在动物生长发育，免疫功能等方面有重要作用3，4。自20世纪80年代以来，铜一直作为一种有效的促生长剂在畜禽养殖中被广泛利用，高剂量铜己被认为是一种高效、廉价、使用方便的促生长剂。然而，不少的饲料添加剂厂家、畜禽养殖生产者为了追求效益，在饲料中盲目添加高铜，造成了畜禽铜中毒、亚临床中毒的发生。2004年1月，欧盟法规限制了饲料中铜的添加量标准，鹅最大耐受量100mg/kg5,6。鹅羽绒品质和产量是一类非常重要的经济性状，在性状的形成过程中遗传因素发挥着主要作用，但目前关于鹅羽绒性状形成的遗传调控机理和分子生物学基础研究尚不多见。近几年，在哺乳动物、人类和鸡方面的研究表明Wnt/-catenin信号传导途径是调控毛囊形态发生和生长的核心通路，它所涉及的有关因子的基因变异及其表达调控对绒毛的生长发育具有重要的影响。然而，有些调控通路及其相关基因的分子生物学作用和调节机制仍然不清楚，而且有些信号分子在哺乳动物与禽类之间存在着较大差异7，8。因此，笔者依据自己的硕士论文，从铜的促羽绒生长和19种Wnt基因9选取Wnt6做基因表达试验，试探讨不同日粮铜添加量对鹅羽绒的促生长作用，以供有关专业同学参考，下面介绍实验方法。1.材料与方法1.1试验动物从100只2025周龄吉林白鹅中随机选取24只，分为4组，每组6只，分别编号，称体重，采用翻肛鉴别性别。1.2技术路线注示：CK（对照组）：试验日粮0mg/kg铜添加量。T1（试验一组）：试验日20mg/kg铜添加量。T2（试验二组）：试验日50mg/kg铜添加量。T3（试验三组）：试验日80mg/kg铜添加量。附：不同Cu添加量日粮配置方法先根据整个试验期计算好基础日粮的总体饲喂量，根据下图配方配好基础日粮，再根据各试验组不同的Cu添加量计算出每组试验日粮的CuSO4.5H2O需要量，研磨成极细的粉末后采用逐级预混的方法配置，最后用混料机混合10分钟以上，以保证Cu充分混匀，防止部分饲料中Cu含量超标，引起铜中毒。如果是夏天可以采用喷雾法配置，这样保证铜混合充分均匀，但要及时对试验日粮进行干燥处理，防止其受潮霉变。1.3基础日粮配方1.4饲养试验饲喂：第一次上料给水，8：00，只鹅给料量100150g；第二次上料给水，12：00，只鹅给料量100150g；第三次上料给水：16：00，只鹅给料量150200g。要求：（1）每天早晨上料前要清除前一天剩余饲料，并称重。（2）每天早晨要清洗饮水器，然后一天三次加注净水。（3）打扫卫生、消毒：每天早晨饲喂前清除舍内粪便，清除的粪便堆积到指定地点，鹅舍每周消毒12次。（4）记录：试验期间（包括试验准备期、预试期、试验期、试验后处理）。1.5试验方法1.5.1拔毛部位划分背部，包括颈部以后，翅膀与骼骨联线以上的部位；胸部，在背部以下，后面以龙骨剑突为界；腹部，龙骨剑突以后，骸骨与坐骨联线以下的部位10。1.5.2拔毛和采血1.5.2.1预试期(15天)结束后第一次拔毛，测量羽毛相关数据。试验期(45天)结束后第二次拔毛，测量羽毛相关数据。1.5.2.2羽绒生长性状的测量方法测量绒朵长：用千分卜尺量取绒朵根部至尖部长度。测量绒朵羽小枝的细度：将绒朵制成游离纤维玻片标本，用显微纤维投影仪测每根羽枝的直径，个个体每个部位测定50根羽小丝。测量千朵重：在每个部位随机抽取1000个绒朵用力分之电子天平称重。测定自然含水量：自然含水量(%)=原毛重量(g)-绝对干燥羽毛重量(g)/原毛重量(g)100测定耗氧指数：耗氧指数(氧的毫克数/100克试样)=8100(A-B)N。测定含脂率：含脂率(%)=(抽提后+包重)-(抽提前十包重)/试样重。附：鹅活体拔毛的方法：先给要拔绒的鹅用10ml注射器灌喂20ml高度白酒，观察3-5分钟后，等鹅反应迟缓后再进行拔绒，可以使鹅比较老实便于拔绒，酒精也可以使毛孔扩张方便拔绒，防止拔断绒毛，保存绒朵完整。1.5.2.3采血：分离血清，检测不同铜含量对血液乳酸脱氢酶(LDH)、谷丙转氨酶(GPT)、谷草转氨酶(GOT)、铜锌超氧化物歧化酶(CuZn-SOD)、铜蓝蛋(CP)、谷胧甘肤过氧化物酶(GSH-PX)、丙二醛(MDA)活性的影响11。采集皮肤、提取毛囊RNA：分析不同剂量的铜对wnt6基因mRNA相对表达水平。1.5.3实验室线图采样提取RNAOD值及浓度调浓度值（按最小浓度）翻转成CDNA设计引物普通PCR摸索条件上机（荧光定量PCR）数据（分析）附：基因表达相关试验采用试剂盒方法，对照试剂盒说明书按步骤进行即可。1.5.4资料处理对小同部位及各周龄绒朵长、羽小枝细度、千朵重进行差异显著性比较。全部数据的统计分析由SPSS11.0软件的One一二yANOVA程序完成。2.试验的难点和预期2.1难点(1)添加多种维生素复合添加剂可以减少试验鹅分组、饲喂不同日粮和第一次拔绒后的应激反应。(2)在低温条件下要防止拔绒时伤到皮肤，使鹅冻伤，要保留羽毛。(3)提取RNA时要防止变性。2.2预期(1)在防止畜禽产品重金属Cu残留超过100mg/kg的标准基础上，讨论试验组鹅羽绒促生长最佳添加量是试验设计的哪个梯度，更具体的铜添加量有待进一步研究。(2)通过基因表达试验测试wnt6是否是wnt基因组控制鹅羽绒生长的主控基因。Wnt6调节鹅近轴外胚层体节的发育和细胞的组织，是分化完成的关键，鸟类胚发育过程中，Wnt6诱导神经脊的形成，如Wnt信号受到抑制则扰乱神经脊的形成。在鹅的Wnt信号家族中，共存在多少种Wnt分子，其中哪几种Wnt分子参与了羽绒发育调控过程，相应Wnt分子的激活和抑制因子如何，该途径下游还与哪些调控因子有关等，有待于进一步研究。参考文献1BonhamM，O，connorJM，HanniganBM，eta1.TheimmunesystemasaphysiologicalindicatorofmarginalcopperstatusJ.BritishJournalofNutrition.2002，87(3):393-403.2柴春彦，石发庆，刘国艳.摇摆病奶牛体内铜状态及其与NO水平的关系J.黑龙江畜牧兽医.2001，7，1-3.3StabelJR，SpearsJW.EffectofcopperonimmuneFunctionanddiseaseresistanceJ.AdvancesExperimentalMedicineandBiology.1989，258(2):243-252.4PercivalSS.CopperandimmunityJ.AmericanJournalOfClinicalNutrition.1998，67(9):1064-1068.5丁伯良.动物中毒病理学M.北京:中国农业出版社，2001，189-190.6邓科敏.实验性鹅铜中毒机理研究D.西南大学，2008.7徐日福，吴伟，高光.鹅羽绒发生发育的分子调控机理研究进展.经济动物学报，第10卷，第2期.8徐日福，吴伟，徐慧.鹅羽绒生长发育调控机理研究进展.中国家禽，2006年，第28卷，第20期.9向阳，