硕士学位论文-儿童急性白血病ALK基因及NPM-ALK融合基因的研究.pdf

At h e s i ss u b m i t t e dt o Z h e n g z h o uU n i v e r s i t y f o rt h ed e g r e eo fM a s t e r T h eR e s e a r c ho fA L K ( a n a p l a s t i cl y m p h o m ak i n a s e ，A L K ) g e n ea n dN P M - A L K ( n u c l e o p h o s m i n a n a p l a s t i cl y m p h o m a k i n a s e ，N P M - A L K ) f u s i o ng e n ei nc h i l d r e nw i t ha c u t e l e u k e m i a B y B a i L i S u p e r v is o r ：P r o f Y u f e n gL i u P a e d i a t r i c s F i r s tC l i n i c a lM e d i c a lC o l l e g e M a y , 2 0 1 1 原创性声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独立进行研 究所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本论文不包含任何其他个人 或集体已经发表或撰写过的科研成果。对本文的研究作出重要贡献的个人和集 体，均已在文中以明确方式标明。本声明的法律责任由本人承担。 学位论文作者： 同期：0 眇f 年厂月冶日 学位论文使用授权声明 本人在导师指导下完成的论文及相关的职务作品，知识产权归属郑州大学。 根据郑州大学有关保留、使用学位论文的规定，同意学校保留或向国家有关部 门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅；本人授权郑州 大学可以将本学位论文的全部或部分编入有关数据库进行检索，可以采用影印、 缩印或者其他复制手段保存论文和汇编本学位论文。本人离校后发表、使用学 位论文或与该学位论文直接相关的学术论文或成果时，第一署名单位仍然为郑 州大学。保密论文在解密后应遵守此规定。 学位论文作者： 翻 R 期：汩f f 年厂月够日 中文摘要 儿童急性白血病A L K 基因及N P M A L K 融合基因的研究 研究生：李白 导师：刘玉峰 郑州大学第一临床学院儿科 郑州4 5 0 0 5 2 中文摘要 研究背景与目的 近几年，越来越多的研究者认识到人类恶性肿瘤遗传学改变的重要性，对 恶性肿瘤遗传学改变的研究能够在基因水平上解释肿瘤的发病机制，更有利于 相关恶性肿瘤的诊断，针对遗传学异常的靶向治疗给肿瘤患者带来更多长期生 存的机会。目前，在急性白血病中已经发现了许多遗传学改变，包括基因缺失、 基因突变、基因扩增及基因易位等各个方面，已经可以在基因水平了解一部分 急性白血病致病原因，由此产生的基因靶向治疗如R A N 干扰技术等已经得到了 明显的治疗效果。 间变性淋巴瘤激酶( A L K ) 基因是重要的肿瘤相关基因，在许多恶性肿瘤 中存在A L K 基因的异常，包括间变性大细胞淋巴瘤( A L C L ) 、非小细胞型肺癌 ( N s C L C ) 、弥漫性大B 细胞淋巴瘤( D L B C L ) 、炎性肌纤维母细胞瘤( I M T ) 及神经母细胞瘤( N B ) 等，A L K 基因异常引起的细胞增殖过度和凋亡下调是其 主要致瘤原因。核仁磷酸蛋白( N P M ) 基因是一种研究较多的具有癌基因及抑 癌基因双重生物学功能的基因，参与许多恶性肿瘤的形成，包括膀胱癌、乳腺 癌、肺癌和淋巴瘤等实体瘤，也包括急性髓系白血病( A M L ) 和骨髓增生异常 综合征( M D S ) 这两个血液系统恶性肿瘤，最近，研究者们更加关注N P M 基因 对急性白血病的影响。N P M 基因异常导致肿瘤发生的原因与其自身的生物学特 性密切相关，包括参与核糖体组装和运输、分子伴侣功能及调节重要的抑癌因 中文摘要 子的特点。在A L C L 中最常见的嵌合体基因是N P M A L K 融合基因，当前，研 究者们基本明确了N P M A L K 融合基因引起A L C L 主要原因，N P M A L K 融合基 因检测已经应用在A L C L 的诊断及预后判断上，针对N P M A L K 融合基因及融 合蛋白的靶向治疗也得到了预想的成果。 目前，国外仅有报道显示在极少数急性粒单核细胞白血病( A M L M 4 ) 中存 在A L K 基因易位，尚无关于A L K 基因在其他类型儿章急性白血病中表达情况 的报道，N P M A L K 融合基因在血液系统肿瘤中的表达也仅在淋巴瘤中发现，本 研究旨在检测急性白血病、淋巴瘤白血病患儿中A L K 基因、N P M A L K 融合基 因表达情况，探讨A L K 基因、N P M A L K 融合基因在急性白血病发病中是否发 挥作用。 研究方法 1 收集2 0 0 8 年9 月“ - 2 0 1 0 年5 月在郑州大学附属第一医院儿科血液病区初 诊为急性白血病患儿的骨髓液，包括急性淋巴细胞白血病、急性髓系细胞白血 病和淋巴瘤白血病。正常对照组为儿章正常骨髓液。 2 采用逆转录酶聚合酶链反应( R T - P C R ) 法检测A L K 基因及N P M A L K 融合基因，实验步骤：骨髓液的采集、骨髓液的处理、总R N A 的提取、c D N A 的合成及P C R 试验。 3 统计学处理：采用S P S S1 7 0f o rW i n d o w s 软件包进行统计学处理，实验 R T - P C R 产物阳性样本总数用例数( n ) 表示，实验组与正常对照组的比较采用 独立两组二分类定性资料的卡方检验( # ) ，统计检验标准均为双侧概率检验 ( a = 0 0 5 ) ，P 0 0 5 表示差异具有统计学意义。 结果 1 实验组检测结果： ( 1 ) 急性T 细胞淋巴细胞白血病组结果显示，A L K 基因及N P M A L K 融合基 因表达均为阴性。 ( 2 ) 急性B 细胞淋巴细胞白血病组结果显示，A L K 基因及N P M A L K 融合 基因表达均为阴性。 ( 3 ) 急性髓系白血病组结果显示，A L K 基因及N P M A L K 融合基因表达均为 阴性。 I I 中文摘要 ( 4 ) 淋巴瘤白血病组结果显示，A L K 基因及N P M A L K 融合基凶表达均为阴 性。 2 正常对照组检测结果显示A L K 基因及N P M A L K 融合基因表达均为阴性。 结论 1 本实验未发现儿童急性白血病中存在A L K 基因及N P M A L K 融合基因的 表达，A L K 基因及N P M A L K 基因可能仅是A L C L 、D L B C L 的特异性基因，在 急性自血病中不发挥致瘤作用。 2 鉴于以往研究已经证实，A L K 基因及N P M A L K 融合基因在大部分问变 性大细胞淋巴瘤( A L C L ) 和弥漫性大B 细胞淋巴瘤( D L B C L ) 中表达，因此 检测A L K 基因、N P M A L K 融合基因对于A L C L 、D L B C L 有直接诊断意义，并 可以用于鉴别急性白血病与A L C L 、D L B C L 所致的淋巴瘤白血病。 关键词：A L K 基因N P M A L K 融合基因急性白血病淋巴瘤白血病 R T - P C R I I I T h eR e s e r c ho fA L Kg e n ea n dN P M A L Kf u s i o ng e n ei n C h i l d r e nw i t hA c u t eL e u k e m i a B y B a iL i S u p e r v i s o r ：P r o f Y u f e n gL i u D e p a r t m e n to fP e d i a t r i c s F i r s tC l i n i c a lM e d i c a lC o l l e g eo f Z h e n g z h o uU n i V e r s i t y ， Z h e n g z h o u ，4 5 0 0 5 2 A b s t r a c t B A C K G R O U D O B J E C T I V E I nr e c e n ty e a r s m o r ea n dm o r er e s e a r c h e r sr e c o g n i z et h ei m p o r t a n c eo fg e n e t l c c h a n g e si nh u m a nm a l i g n a n c i e s F i r s t ，g e n e t i cc h a n g e sr e s e a r c ho nc a n c e rc o u l d b e a b l et oe x p l a i nt h ep a t h o g e n e s i so fC a n C e ra tt h eg e n e t i cl e v e l S e c o n d ，i ti s m o r e c o n d u c i v et ot h ed i a g n o s i so fr e l a t e d m a l i g n a n c y T h i r d ，u s i n gt h et a r g e t e dt h e r a p y f o rg e n e t i ca b n o r m a l i t i e sc o u l db r i n gm o r eo p p o r t u n i t i e st o C a n C e rp a t i e n t st o ra l o n 野t e ms u r v i v a l A tp r e s e n t ，t h e r eh a sb e e nf o u n da n u m b e ro fg e n e t i cc h a n g e s1 n a c u t el e u k 锄i a ，i n c l u d i n gg e n ed e l e t i o n ，g e n em u t a t i o n ，g e n ea m p l i f i c a t i o na n dg e n e 慨s l o c a t i o n W ec o u l da l r e a d yu n d e r s t a n dt h ec a u s e so fp a r to fa c u t el e u k e m l a i n g e n e t i cl e v e l G e n et a r g e t e dt h e r a p y , s u c ha sR A N i n t e r f e r e n c et e c h n o l o g y , h a Sb e e n o b t a i nas i g n i f i c a n tt h e r a p e u t i ce f f e c t A n a p l a s t i cl y m p h o m ak i n a s e ( A L K ) g e n e l Sa I l i m p o r t a n tt u m o r - r e l a t e dg e n e s a n dm a n ym a l i g n a n tt u m o r sc o n t a i n sA L Kg e n e a b n o r m a l i t i e s ：i n c l u d i n ga n a p l a s t i cl a r g e c e l ll y m p h o m a ( A L C L ) ，n o n s m a l lc e l ll u n g c a n c e r ( N S C L C ) ，d i f f u s e l a r g e B c e l l l y m p h o m a ( D L B C L ) ，i n f l a m m a t o r y m y o f i b r o b l a s t i ct u m o r ( I M T ) a n dn e u r o b l a s t o m a f N B ) ，e t c T u m o r i g e n i cm a m t e a s o n so fA L Kg e n ea b n o r m a l i t i e si n c l u d ee x c e s s i v ec e l lp r o l i f e r a t i o na n d r e d u c t i o n o fa p o p t o s i s N u c l e o p h o s m i n ( N P M ) g e n ei saw e l l s t u d i e dw i t had u a lb i o l o g i c a l f u n c t i o no fo n c o g 锄ea n dt u m o rs u p p r e s s o rg e n ew h i c hi si n v o l v e di nt h ef o r m a t i o n I V A b s t r a c t o fm a n ym a l i g n a n tn e o p l a s m s ，i n c l u d i n gs o m es o l i dt u m o r s ：b l a d d e rc a n c e r , b r e a s t c a l l c e r , l u n gc a n c e ra n dt w oh e m a t o l o g i cm a l i g n a n c i e s ：a c u t em y e l o i dl e u k e m i a ( A M L ) a n dm y e l o d y s p l a s t i cs y n d r o m e ( M D S ) R e c e n t l 5 r e s e a r c h e r sp a ym o r e a t t e n t i o nt oN P Mg e n eo nt h ei m p a c to fa c u t el e u k e m i a B e c a u s eo fi t so w nb i o l o g i c a l c h a r a c t e r i s t i c s ，t h ea b n o r m i t yo fN P Mg e n el e a d st oc a n c e r I tp l a y sm u l t i p l er o l e si n r i b o s o m ea s s e m b l ya n dt r a n s p o r t ，c y t o p l a s m i c - n u c l e a rt r a f f i c k i n g ，c e n t r o s o m e d u p l i c a t i o n a n dr e g u l a t i o no fp 5 3 N P M A L Kf u s i o ng e n ei st h em o s tc o m m o n c h i m e r i cg e n ei nA L C L F o rn o w , r e s e a r c h e r sh a v eb a s i c a l l yi d e n t i f i e dt h em a j o r m e c h a n i s ma b o u th o wN P M A L Kg e n ef u s i o nc a u s e sA L C L N P M - A L K f u s i o ng e n e d e t e c t i o nh a sb e e nu s e di nt h ed i a g n o s i sa n dp r o g n o s i so fA L C La n dt a r g e t e dt h e r a p y a c c o r d i n gt oN P M A L Kf u s i o ng e n ea n df u s i o np r o t e i nh a sa l s ob e e ng o t t h ed e s i r e d r e s u l t s C u r r e n t l y , o n l yav e r y s m a l ln u m b e ro fa c u t em y e l o m o n o c y t i cl e u k e m i a ( A M L M 4 ) e x i s tA L Kg e n et r a n s l o c a t i o nf r o mf o r e i g nr e p o r t T h e r eh a sb e e nn o r e p o r t sa b o u tt h eA L Kg e n ee x p r e s s i o ni nc h i l d r e nw i t ho t h e rt y p e sa c u t el e u k e m i a I n h e m a t o l o g i c a lm a l i g n a n c i e s ，N P M - A L Kf u s i o ng e n ei so n l yf o u n d i nl y m p h o m aa n d a sw ek n o w , s o m el y m p h o m ac a s e sc o u l db et r a n s f o r m e d i n t ol e u k e m i a T h e o b j e c t i v eo ft h i ss t u d yi st od e t e c tt h ee x p r e s s i o n o fA L K g e n ea n dN P M A L K f u s i o n g e n ei nc h i l dw i t ha c u t el e u k e m i aa n dl y m p h o m a c e l ll e u k e m i a A tt h es a m et i m e ，W e e x p l o r et h ep a t h o g e n e s i so fA L Kg e n ea n dN P Mg e n ea n dd i s c u s st h e t r e a t m e n t t a r g e t i n gt h e mt oa p p r o a c hi fA L Kg e n e ，N P M - A L K f u s i o ng e n ep l a yar o l ei nt h e p a t h o g e n e s i so fa c u t el e u k e m i a M E T H o D S 1 C o l l e c t i n gb o n em a r r o wf l u i ds a m p l eo fc h i l d r e nw h oa r en e w l yd i a g n o s e dw i t h a c u t el e u k e m i a ，i n c l u d i n ga c u t el y m p h o b l a s t i cl e u k e m i a ，a c u t em y e l o i dl e u k e m i a a n dl y m p h o m ac e l ll e u k e m i aa tt h eP e d i a t r i co ft h eF i r s tA f f i l i a t e dH o s p i t a lo f Z h e n g z h o uU n i v e r s i t yf r o mS e p t e m b e r2 0 0 8t oM a y 2 010a st h ee x p e r i m e n t a l g r o u p T h ec o n t r o lg r o u pi sn o r m a lb o n e m a r r o wf l u i ds a m p l e so fc h i l d r e n 2U s er e v e r s et r a n s c r i p t a s ep o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n ( R T - P C R ) a s s a yt o t e s tt h e e x p r e s s i o no fA L Kg e n ea n dN P M A L Kf u s i o ng e n e B a s i ce x p e r i m e n t a ls t e p s ： V A b s t m c t c o l l e c t i n gb o n em a r r o wf l u i d ，h a n d l i n gb o n em a r r o wf l u i d ，e x t r a c t i n gt o t a lR N A ， s y n t h e s i z e i n ge D N Aa n dd e t e c t i n gP C R 3 S t a t i s t i c a la n a l y s i s ：T h er e s u l t so ft h i se x p e r i m e n tw e r ea n a l y z e db yS P S S17 0 s o f t w a r ep a c k a g ef o rW i n d o w s T h et o t a lc a s e so fR T - P C Rp o s i t i v es a m p l e sw a s e x p r e s s e db yn u m b e r ( n ) T h ed if f e r e n c e so ft h en u m b e rb e t w e e ne x p e r i m e n t a l g r o u p sa n dt h ec o n t r o lg r o u pw e r et e s t e db yt w oi n d e p e n d e n c eq u a l i t a t i v e s a m p l e s C h i s q u a r et e s t ( x 2 1 S t a t i s t i ct e s t w e r et w o s i d e dt e s to f p r o b a b i l i t y ( a = 0 0 5 ) P r o b a b i l i t yo fl e s st h a nO 0 5w e r ec o n s i d e r e ds i g n i f i c a n t R E S U L T S 1T h er e s u l t so fe x p e r i m e n t a lg r o u p s ( 1 ) T e s tr e s u l t ss h o w e dt h a tt h ee x p r e s s i o n s g e n ei nT - A L Lg r o u pa r eb o t hn e g a t i v e ( 2 ) T e s tr e s u l t ss h o w e dt h a tt h ee x p r e s s i o n s g e n ei nB - A L Lg r o u pa r eb o t hn e g a t i v e ( 3 ) T e s tr e s u l t ss h o w e dt h a tt h ee x p r e s s i o n s g e n ei nA M Lg r o u pa r eb o t hn e g a t i v e ( 4 ) T e s tr e s u l t ss h o w e dt h a tt h ee x p r e s s i o n s g e n ei nL C Lg r o u pa r eb o t hn e g a t i v e o fA L K g e n ea n dN P M A L Kf u s i o n o fA L Kg e n ea n dN P M - A L Kf u s i o n o fA L K g e n ea n dN P M A L Kf u s i o n o fA L Kg e n ea n dN P M - A L Kf u s i o n 2T e s tr e s u l t ss h o w e dt h a tt h ee x p r e s s i o n so fA L K g e n ea n dN P M - A L Kf u s i o ng e n e i nc o n t r o lg r o u pa r eb o t hn e g a t i v e C O N C L U S I o N 1T h e r ei sn oA L Kg e n ea n dN P M A L Kf u s i o ng e n ee x p r e s s i o ni nm o s ta c u t e l e u k e m i a A L Kg e n ea n dN P M - A L K g e n em a yb es p e c i f i cg e n e so n l yi nA L C L a n dD L B C Lm i d t h e yd on o tp l a yat u m o r i g e n i cr o l ei na c u t el e u k e m i a 2P r e v i o u ss t u d i e sh a v es h o w nt h a tm a i n l yi na n a p l a s t i cl a r g ec e l ll y m p h o m a ( A L C L ) a n dd i f f u s el a r g eBc e l ll y m p h o m a ( D L B C L ) e x i s tt h ee x p r e s s i o no f A L K g e n ea n d N P M - A L Kf u s i o ng e n e ，S Od e t e c t i n gA L K g e n e ，N P M - A L Kf u s i o ng e n ef o rA L C L a n dD L B C Lh a sad i r e c td i a g n o s i sa n dc a nb eu s e dt oi d e n t i f ya c u t el e u k e m i aa n d 1 e u k e m i aw h i c hi sA I ，C La n dD I ，B C I ，i n d u c e d V I A b s t r a c t K e yw o r d s ：A n a p l a s t i cl y m p h o m ak i n a s e ( A L K ) g e n e N u c l e o p h o s m i n ( N P M ) g e n e A c u t el e u k e m i a L y m p h o m a c e l ll e u k e m i aR T - P C R V I I 目录 论文部分 缩略词中英文对照表I 1 前言l 2 材料3 3 方法7 4 结果，1 2 5 讨论13 6 结论2 0 7 参考文献2 1 8 附图2 5 综述部分 A L K 基因和N P M 基因生物学特性及致瘤性研究进展2 8 参考文献4 5 附录部分 个人简历5 4 致谢5 5 缩略词中英文对照表 缩略词中英文对照表 r f J U磊 1前言 急性白血病目前是威胁儿童生命第一位的恶性肿瘤。我国1 5 岁以下儿童每 年白血病的发病数约1 5 0 0 0 例左右，9 0 为急性白血病，急性淋巴细胞白血病( A L L ) 约占2 3 ，急性髓系细胞白血病( A M L ) 约占1 3 。国内外先进医疗单位单纯依靠化 疗治疗A L L 的完全缓解率( C R ) 目前已达9 5 以上，5 年以上持续缓解率( C C R ) 已 达8 0 。A M L 的C R 率目前已达9 5 ，5 年无事件生存率( e v e n f l e es u r v i v a l ， E F S ) 达7 0 以上，5 年无病生存率( D F S ) 在5 0 以上几近造血干细胞移植的治 疗效果【l 】。影响A L 预后因素包括患儿年龄、起病时白细胞计数、白血病细胞的 遗传学特征、药效动力学等因素。具有不同遗传特征的急性白血病患儿，治疗 效果不同主要是因为特定遗传学特性的白血病细胞对化疗药物敏感性或耐受性 不相同。如t ( 1 5 ；1 7 ) 染色体易位是A P L 最常见的遗传学异常，易位形成P M L R A R a 融合基因，此类A P L 经全反式维甲酸治疗可达到完全缓解；具有费城染色体 t ( 9 ；2 2 ) ( q 3 4 ；q 1 1 ) 即B C R A B L 融合基因为极高危型的A L L ，其临床特点为患J L 多, I - 周血高白细胞、中枢神经系统白血病( C N S ) 发生率高，预后极差。 淋巴瘤细胞白血病( 1 y m p h o m ac e l ll e u k e m i a ，L C L ) 又称淋巴肉瘤细胞白血病 ( 1 y m p h o s a r c o m ac e l ll e u k e m i a ，L S L ) ，L C L 是淋巴瘤病程后阶段淋巴瘤细胞广泛 播散至骨髓，并出现在外周血，同时伴有正常血细胞的减少。结合国内文献报 道和世界卫生组织( w H o ) 的意见【2 1 ，外周血可见淋巴瘤细胞或无淋巴瘤细胞，骨 髓中淋巴瘤细胞比例2 2 0 即可诊断淋巴瘤白血病。易发生淋巴瘤白血病的主要 为中高度恶性非霍奇金淋巴瘤( N H L ) ，研究认为5 岁以下儿章淋巴瘤发展为淋 巴瘤白血病的几率是3 4 。L C L 临床表现多同A L L ，恶性程度高，化疗预后较 差，骨髓移植术治疗L C L 虽然达到很好的效果但存在花费高、配型难等诸多问 题。 间变性淋巴瘤激酶【3 】，【4 ( a n a p l a s t i cl y m p h o m ak i n a s e ，A L K ) 基因是一个重要的 肿瘤相关基因。A L K 基因所编码的A L K 蛋白是一种酪氨酸激酶受体( r e c e p t o r t y r o s i n ek i n a s e ，R T K ) ，属于胰岛素超家族的成员【5 】。A L K 蛋白是一种参与正常 发育，又可导致肿瘤形成的R T K 。最近的研究发现A L K 基因与越来越多疾病的 发病机制有关，包括A L C L 和D L B C L 。2 0 0 7 年，在N S C L C 中发现了A L K 基因 H U鬲 倒位及其融合基因的表达【6 】。2 0 0 8 年，研究发现家族性及非家族性小儿交感肾上 腺系统肿瘤N B 的病例中存在A L K 基因的异常表达【7 】 【9 】。研究发现在I M T s 中 也存在一系列有形成二聚体能力的、能够和A L K 基因形成融合基因的配对基因 【l o 】。A L K 基因的异常涉及染色体易位、扩增或突变，其中以染色体易位形成融 合基因最常见，尤以A L K 阳性A L C L 中的N P M A L K 融合基因常见。2 0 1 0 年4 月国外首次报道了关于A L K 基因在儿章非典型骨髓增生性白血病中的表达情 况，R 6 t t g e r s 1 1 l 等收集1 7 0 8 例德国和意大利患儿骨髓及外周血标本，其中1 2 7 8 例A M L ，4 3 0 例M D S ，采用R T - P C R 及基因测序方法在4 3 0 例骨髓增生异常综合 征( m y e l o d y s p l a s t i cs y n d r o m e s ，M D S ) 患儿骨髓和外周血中均未检测到A L K 基 因的表达，在1 2 7 8 例A M L 中发现3 例存在染色体2 p 2 3 位点A L K 基因的易位， 基因测序发现其中2 例为i n v ( 2 ) ( p 2 3q 1 3 ) ，1 例为t ( 2 ；2 ) ( p 2 3 ；q 1 1 “ - q 1 3 ) ，R 6 t t g e r s 等认为极少数A M L 中存在A L K 基因缺失及易位，使用A L K 抑制剂治疗A L K 阳性A L C L 得到预期的效果，A L K 抑制剂有可能在临床上用于A L K 阳性A M L 患儿的辅助治疗。 N P M ( N u c l e o p h o s m i n ，N P M ) 基因属于管家基因，编码与核仁相关的磷酸 蛋白，N P M 基因发生基因突变、易位及扩增与多种肿瘤的发生密切相关，是重 要的癌基因和肿瘤标志物【I2 1 。研究显示N P M 基因过表达与膀胱癌相关，N P M 表达水平与膀胱癌向更晚期发展和复发相关【1 3 】。人乳腺癌细胞中也存在N P M 基 因过表达【14 1 。N S C L C 、M D S 细胞都存在N P M 基因的缺失【1 5 】【16 1 。3 0 成人A M L 患者中发现N P M 基因1 2 号外显子的突变，大量研究认为这些肿瘤的发生与N P M 基因缺失及突变密切相关【1 7 】。其中最常见的是A L C L ，8 5 A L K 阳性A L C L 患 者肿瘤细胞中存t ( 2 ；5 ) ( p 2 3 ；q 3 5 ) 染色体易位，形成N P M A L K 致癌融合基因【1 8 】。 其次，在A M L 中发现了两种类型N P M 融合基因，N P M R A R a 融合基因和 N P M M L F l 融合基因【1 9 】 【2 0 1 。 据此，我们采用逆转录聚合酶链反应( R e v o r s eT r a n s c r i p t a s eP o l y m e r a s eC h a i n R e a c t i o n ，I m P C R ) 方法检测急性淋巴细胞白血病、急性髓系细胞白血病和淋巴 瘤白血病骨髓中A L K 基因、N P M A L K 融合基因的表达情况，探讨其致瘤性能 否导致急性白血病的发病，为急性白血病的诊断提供新的依据。 2 材料 2 材料 2 1 采集标本 收集2 0 0 8 年9 月“ - 2 0 1 0 年5 月在郑州大学附属第一医院儿科血液病区仞诊 为急性白血病患儿的骨髓液，包括急性淋巴细胞白血病、急性髓系细胞白血病 和淋巴瘤白血病，患儿的诊断和治疗方法均依照2 0 0 6 年上海中华医学会儿科学 分会提出的诊疗建议。对照组选择：2 0 0 8 年9 月2 0 1 0 年5 月在郑州大学附属 第一医院疑似血液系统疾病，骨髓细胞学检查正常的儿章。入选对象均征得患 儿家长的知情同意。 本次实验共收集实验组骨髓标本9 2 份，急性淋巴细胞白血病6 8 例占7 3 9 ， 其中T 细胞型1 2 例占1 7 6 ，男女比例为1 4 ：1 ，中位年龄5 5 岁( 1 2 1 0 ) ， B 细胞型白血病5 6 例占8 2 4 ，男女比例1 7 ：1 ，中位年龄4 岁( 1 8 ) ；急性 髓系白血病2 2 例占2 3 9 ，其中急性白血病部分分化型( A M L M 2 ) 1 6 例占 7 2 7 ，男女比例1 4 ：1 ，中位年龄6 5 岁( 2 5 “ - - - 1 2 ) ，急性早幼粒细胞白血病 ( A M L M 3 ) 3 例占1 3 6 ，急性粒单核细胞白血病( A M L M 4 ) 1 例占4 5 ，急 性单核细胞白血病( A M L M 5 ) 2 例占9 1 ，；L C L 2 例，均为T 细胞淋巴瘤白 血病。对照组骨髓标本1 3 例，男女比例1 2 ：1 ，中位年龄5 岁( 1 5 1 1 ) 。 2 2 主要仪器 台式离心机：上海飞鸽牌型号T G L 1 6 G 恒温鼓风干燥箱：上海新苗型号D H G 9 1 4 3 B S I I I 微波炉：格兰仕型号W D 9 0 0 Y P C R 仪：V e r i t i9 6 w e UT h e r m a lc y c l e r 型号9 9 0 2 可调温度离心机：e p p e n d o r f c e n t r i f u g e 型号5 4 1 5 振荡器：V o r t e x 其林贝尔型号Q L 9 0 1 隔水式电热恒温培养箱：上海新苗型号G N P 9 1 6 0 B S I l l 高压灭菌锅：S A N Y O 型号M L S 3 7 5 0 超净工作台：T h e r m o ，B i o l o g i c a lS a f e t yC a b i n e t ，F o r m aC l a s sI I 型号1 2 8 5 3 材料 分光光度计：N a n oV u e 型号2 8 9 2 3 2 1 6 1 电子天平：M e t t l e rT o l e d o 型号A L l0 4 2 0 电冰箱：海尔型号B C D 2 1 5 A D L 电热恒温水槽：上海精宏型号D K 8 D 电热蒸馏水器：上海博远型号Y N Z D Z 8 0 。C 超低温冰箱：S A N Y O 型号M D F C 8 V ( N ) 超纯水设备：M I L L I P O R E 型号P F 0 9 7 7 1 凝胶摄录系统：B i o s p e c t r u mU V P 型号3 1 0I m a g i n gS y s t e r m 紫外投射仪：北京六一仪器厂型号W D 9 4 0 3 F 全自动制冰机：雪花牌型号I M S 1 0 0 移液枪0 5 10 I r t l2 - 2 0 9 l10 - 10 0 9 l2 0 2 0 0 9 l 10 0 1 0 0 0 1 a l - c j e n e xB e t a 2 3 主要耗材 枪头：1 0 9 l2 0 9 l1 0 0 9 l 枪头盒：1 0 9 l2 0 0 9 l1 0 0 0 9 l 量筒：5 0 m l1 0 0 m l1 0 0 0 m l 玻璃瓶：1 0 0 m l5 0 0 m l1 0 0 0 m l 锥形瓶：1 0 0 m l E P 管：1 5m l1 5m l P C R 管 E P 管架 P C R 管架 一次性使用薄膜手套 一次性使用橡胶手套 2 4 主要试剂及试剂盒 以下试剂由森斯科贸北京康为世纪生物科技有限公司提供 三羟甲基氨基甲烷“ I r i sS i g m a1 0 0 9 冰醋酸风船5 0 0m l 7 , - 胺四乙酸二钠E D T AN a 2A m r e s c o1 0 0 9 4 材料 溴化乙锭E BS o a r b i ol m l 焦磷酸二乙酯D E P CA m r e s c oE 1 7 41 0 m l 琼脂糖B I O W E S TR E G U L A RA G A R O S EG 1 0 ( 西班牙) 1 0 0 9 无水乙醇安特5 0 0 m l 三氯甲烷风船5 0 0 m l 异丙醇风船5 0 0 m l D M 5 0 0D N AM a r k e r5 0 次 2 x E ST a qM a s t e r M i x ( 含染料) l m l T R I Z O L I n v i t r o g e n ( 美国) l O O m l 红细胞裂解液北京天根生化科技有限公司l O O m l e D N A 合成试剂盒F e r m e n t a sR e v e r t A i d T MF i r S tS t r a n dc D N AS y n t h e s i sK i t10 0 次 P C R 扩增试剂盒森斯科贸北京康为世纪生物科技有限公司提供 引物生工生物工程( 上