毕业设计（论文）-气相色谱法测定大鼠粪便短链脂肪酸色谱条件的优化.doc

北京工商大学毕业论文（设计）编号：1002070321毕业论文（设计）题目气相色谱法测定大鼠粪便短链脂肪酸色谱条件的优化院（系） ：食品学院 专业 ：食品科学与工程学生姓名 ：成绩：指导教师（职称）副教授2014年05月III诚信声明本人郑重声明：所呈交的毕业设计（论文）是我个人在导师指导下,由我本人独立完成。有关观点、方法、数据和文献等的引用已在文中指出,并与参考文献相对应。我承诺，论文中的所有内容均真实、可信。如在文中涉及到抄袭或剽窃行为，本人愿承担由此而造成的一切后果及责任。毕业论文（设计）作者签名：签名日期： 年 月 日摘要气相色谱法是测定短链脂肪酸的常用方法。为了研究原花青素对肥胖大鼠肠道菌群的影响，需要对大鼠粪便中的短链脂肪酸定性和定量。本论文对影响短链脂肪酸测定的两个关键因素：样品前处理方法以及色谱条件进行了优化，比较了三种色谱条件以及四种样品前处理方法：盐酸水提法、偏磷酸处理法、水提乙醚萃取法和固相微萃取法。结果表明最优样品前处理法为盐酸水提乙醚萃取法，优化的色谱条件为：色谱条件B。色谱条件B：柱型号JM122-7032；柱规格为30.0m250mm0.25m的DB-WAX毛细管柱。测定采用程序升温，初温100，保持0.5min；以8/min速度升至180，保持1min；然后以20/min速度升至200，保持5min，分流比为10:1，载气为He，流速为1.2mL/min，FID检测器温度为250，进样口温度为250。测定了15个大鼠粪便样品中短链脂肪酸的含量。关键词：短链脂肪酸；大鼠粪便；气相色谱；样品前处理ABSTRACTGas chromatography is a common method for the determination of short-chain fatty acids.To study the effect of proanthocyanidins on gut microbiotaof rats,the short-chain fatty acids were qualified and quantified.Two key factors influencing the determination of short-chain fatty acids,i.e.,sample preparation methods and chromatographic conditions,were optimized,and totally3 chromatographic conditions and 4 sample preparation methods were compared,i.e.,hydrochloric acid-acidified water extraction,metaphosphoric acidextraction, acidified water extraction followed by ether extraction and solid phase micro-extraction.Results showed that optimum preparation method was hydrochloric acid-acidified water extraction,and the optimum GC conditions were as follows:Column Type JM122-7032;30.0m250mm0.25m the DB-WAX capillary column.Determined by temperature-programmed,initial temperature 100,keeping 0.5min;with 8/min rate rose to 180,keeping 1min;then with 20/min rate rose to 200,keeping 5min,split ratio of 10:1, The carrier gas is He,flow rate 1.2mL/min,FID detector temperature is 250,inlet temperature is 250.Totally 15 rats feces samples were determined.Key word:Short-chain fatty acids;rat feces;Gas chromatography; Sample preparation methodIII目录第一章 绪论21.1 短链脂肪酸与其生理功能21.2 短链脂肪酸的生成与代谢21.3 短链脂肪酸测定方法21.3.1 前处理方法21.3.2 GC法21.3.3 HPLC法21.3.4 CE法21.4 GC原理和应用21.5 研究现状及进展2第二章 材料与方法22.1 实验材料22.1.1 实验试剂和药品22.1.2 实验仪器和设备22.2 实验方法22.2.1 标准液配制22.2.2 色谱条件的优化22.2.3 样品处理方法22.2.4 样品的测定2第三章 结果与分析23.1 气相色谱条件优化23.2 标曲制作23.3 前处理方法的优化23.4 大鼠粪便SCFA含量的测定23.5 误差分析2第四章 结论与建议24.1 结论2致谢2参考文献2附录2第一章 绪论1.1 短链脂肪酸与其生理功能短链脂肪酸（Short chain fatty acid, SCFA），也称作为挥发性脂肪酸（volatile fatty acids,VFA),是指碳原子数1-6的羧酸,如、乙酸、丙酸、丁酸、戊酸、异戊酸、异丁酸等，大多是由食物中尚未被完全消化吸收的碳水化合物,在结肠腔内,经细菌酵解生成,也有少量来自于膳食蛋白和内源性蛋白,例如粘膜和脱落上皮细胞。研究表明短链脂肪酸具有促进肠道细胞增殖，诱导细胞分化和凋亡的作用。它作为肠道菌群发酵产物，对宿主也有主要的生理功能，它可以调节肠道菌群，维持体内电解质的平衡，给宿主提供能量，给肠道上皮细胞提供营养等。人体内主要的SCFA包括乙酸、丙酸和丁酸，其中丁酸是结肠黏膜上皮细胞最主要的能量来源，乙酸可用来合成长链脂肪酸、谷氨酰胺、谷氨酸盐及82羟丁酸，而丙酸盐可抑制肝合成胆同醇，并使血胆同醇向肝内再分布。短链脂肪酸是肠道中的代谢产物，所以它可以反映出生物的各种代谢情况，因此我们可以把短链脂肪酸当作一些特定食物在生物体内代谢研究的指标和一些特殊生理状态下的生物体代谢研究的指标，如羊肚菌多糖对大鼠肠道中乙酸、丙酸、异丁酸、丁酸等短链脂肪酸的产生有促进作用1等。因此目前SCFA研究比较普遍，如人血清SCFA的研究，肥胖大鼠肠道SCFA的研究，盲袢综合征即小肠细菌过度生长(enteric bacterial overgrowth syndrome，EBOS)大鼠SCFA代谢研究等各种研究。1.2 短链脂肪酸的生成与代谢SCFA是人结肠细菌发酵的主要产物，主要包括乙酸、丙酸、异丁酸、丁酸、异戊酸、戊酸、异己酸和己酸。其中乙酸、丙酸和丁酸含量最高，乙酸约为40100mmol，丙酸为1540mmol，丁酸为1030mmol/kg内容物，是肠道中主要的SCFA。SCFA主要来自大肠内碳水化合物发酵和蛋白质降解,肠道菌群通过产生SCFA,对人体多个器官和代谢产生较大的影响。Weaver等研究了35个健康人结肠的内容物,发现乙酸: 丙酸: 丁酸的比率为60.7:15.8:17.3。大肠中的细菌几乎都能分解糖类,并从降解碳水化合物中获取能量和碳源，见表1.1所示1。进入结肠的碳水化合物,有些是尚未消化吸收的食物残渣,有些是蛋白及宿主的分泌物,其数量和类型主要取决于食物被消化吸收的程度,这些物质都可被微生物发酵。由于细菌连续的代谢活动,结肠内的氧化还原电位很低,只有极微量的氧存在,是一个适合严格厌氧微生物繁衍的环境。复杂的碳水化合物经过连续水解成为简单的糖,受到菌群的进一步代谢,最终成为多种发酵产物,如SCFA,其它有机酸、乙醇、氢和二氧化碳等。如图1.1所示1。表1.1人大肠中的主要解糖细菌菌属粪便中平均菌数(logCFU/g 干重)主要发酵产物拟杆菌属11.3乙酸、丁酸、琥珀酸双歧杆菌属10.2乙酸、乳酸、乙醇、甲酸真杆菌属10.7乙酸、丁酸、乳酸瘤胃球菌属10.2乙酸消化链球菌属10.1乙酸、乳酸乳杆菌属9.6乳酸梭菌属9.8乙酸、丙酸、丁酸、乳酸链球菌属8.3乳酸、乙酸图1.1结肠细菌碳水化合物代谢的主要途径生理状况下，结肠内SCFA以阴离子形式存在，其吸收是通过离子与非离子形式进行的，已经证实，60以上的SCFA是经上皮的非离子简单弥散形式吸收的，非离子形式吸收首先需要SCFA阴离子质子化，SCFA阴离子被H+质子化后以被动吸收形式经上皮细胞弥散人血，非离子形式弥散是SCFA的主要吸收形式，具有浓度依赖性特点。SCFA离子形式的吸收可能经由细胞内外SCFAHCO3交换进行的。因此，SCFA吸收过程刺激了肠道Na+、K+和H20的吸收、C02的消除以及HCO3的分泌，在维持水电解质的吸收上起着重要作用。影响SCFA生成的因素多种多样，肠道菌群的种类和数量，发酵基质的数量、类型、降解速率和降解程度、结肠转运时间、黏膜分泌、药物作用等。通过阶段接触时间和宿主生理状态等因素均可从不同层面对SCFA的生成产生影响。在众多的因素中，肠道菌群和发酵基质的种类和数量是两个最主要的因素。1.3 短链脂肪酸测定方法短链脂肪酸在机体的生理和病理过程中具有重要的临床意义,它们的检测方法研究具有广阔的应用前景。建立省时、简便、样品量小、定量准确、灵敏度高、选择性好的测定方法是短链脂肪酸研究的一个关键环节。由于生物样品中短链脂肪酸含量低、样品量少、干扰物质多及易挥发等特点,其测定方法一直是SCFA研究的一个难点,而这些特点又使得样品的前处理特别重要。短链脂肪酸含量的早期测定方法是滴定法,该法特异性不强,准确度低。随着色谱技术的发展,气相色谱(GC)、高效液相色谱(HPLC)以及毛细管电泳(CE)已广泛用于短链脂肪酸的测定2。但极性大、挥发性强和水溶性大的特点使SCFA难以定量,生物基质的复杂性也更增加了定量工作的难度。同时,短链脂肪酸的测定首先需要对样品进行提取纯化,因此,提取纯化方式的选择也一直是研究热点。样品提取方法有：蒸馏法，高速离心法，超过滤法，萃取法，固液相萃取法等。本实验涉及高速离心，有机萃取，固液相萃取等方法3。1.3.1 前处理方法蒸馏法粪:便样品的蒸馏有许多缺点,首先需要大量样品,蒸汽蒸馏法还需用强酸酸化样品,从而导致蛋白和碳水化合物的消化产物对蒸汽的污染。另外,样品中含有的乙酰基分解会导致乙酸值过高。因此,蒸馏法现已很少使用。高速离心法：粪水可通过高速离心进行分离,但得到的液体量较少。用离心法获得的液体中含有较多其他类型的有机酸以及糖和胺等超滤法：超滤法借助离心力的作用,使样品中的液体与相对分子质量小的物质一起通过半透膜而进行分离。Chen等用Millipore超滤离心管,超滤膜截止相对分子质量(Mr)为3000,样品在15000r/min(2)下离心60min过滤,滤液用6mol/L硫酸酸化后采用HPLC法测定粪便中的SCFA5。超滤法的缺点是有一部分有机酸会吸附在滤膜上,造成定量不准确,而含量低的样品不易被检测出。萃取法：乙醚、乙酸乙酯、氯仿和二氯甲烷等为常用萃取剂。在萃取前要把粪便配成悬液, 一般在悬液中加入酸使脂肪酸更易被有机溶剂提取。但Ayesh等用NaOH配成悬液,用乙醚提取两次后衍生化处理进样也得到了较好的结果5。萃取后一般通过挥发溶剂来浓缩样品。由于SCFA的挥发性太强会随着有机溶剂一起挥发,因此液-液萃取法虽然操作相对简单,但回收率偏低。固相微萃取(SPME)：是从多种底物中提取挥发性和半挥发性物质的一种新技术,它基于吸附和解析进行样品处理。SPME装置形如一个改进的微量注射器,涂有聚合物薄膜的熔融石英纤维固定在不锈钢针上,构成了萃取头。利用萃取头可一步完成提取、分离、浓缩步骤。萃取头上涂膜的类型、样品基质的pH条件、SCFA的形态和反应时间对样品的吸附起决定性作用。Zhao等报道了一种步骤很简便的测定粪便和结肠内容物中SCFA的方法6:冻干的样品称重后用5mL水复溶搅匀,加入5mol/L的盐酸调节上清液pH23,静置10min后离心,直接取上清液进入气相色谱系统检测。但粪便中其他物质与SCFA是否存在相互作用还有待进一步观察。因此本文也对该试验方法做了验证。1.3.2 GC法GC是SCFA分析的最广泛方法。程序升温、分流比、色谱柱类型、载气和检测器等条件都是决定测定准确度和精确度的重要因素。酸与填充柱相互反应会导致峰拖尾,酸在柱上的保留会引起连续进样分析过程中吸附的酸被释放而出现“鬼峰”7。降低填充柱的精确度和准确度。制备填充柱时加入少量磷酸、在载气中加入甲酸或采用毛细管柱可减少这种影响。一般不考虑用玻璃柱,因为玻璃柱在大约进样30次后,非挥发性物质会积累产生沉淀,降低色谱柱的分离效率。毛细管柱能克服填充柱和玻璃柱的缺点,因而得到广泛应用。在毛细管柱中,非极性柱(如DB-1)、弱极性柱(如DB-5)、强极性柱(如FFAP)都有应用报道,而FFAP柱对于SCFA有很好的分离效果。Zhao等认为它对水相当稳定,因此可以直接进水样检测脂肪酸。当然,没有经过提取或衍生步骤,基质中的许多干扰物也进入色谱系统,在进几次样后就会出现“鬼峰”7, 这一问题可以通过在溶液中加入甲酸予以解决。1.3.3 HPLC法HPLC测定脂肪酸最主要的问题是脂肪酸分子结构中缺乏具有紫外吸收和荧光的基团。为了解决这一问题,经常在对脂肪酸进行柱前或柱后衍生化后用紫外或荧光检测器检测有时也可不经衍生化而直接采用HPLC法测定SCFA。Stein等用HPLC紫外(UV)检测法测定了生物样品，如结肠组织、粪便、唾液、十二指肠液、尿和血浆中的SCFA。样品以2，2-二甲基丁酯为内标,通过真空蒸馏和在碱性条件下冻干浓缩后,在磺酸基聚苯乙烯-二乙烯基苯色谱柱上分离,所得结果与GC所得结果相似。Horspool等用离子交换柱进行分离,采用UV检测器在210nm波长下测定了马盲肠液中的7种SCFA8。Chen等用ORH-801有机酸柱分离粪便中C2C5的直链和支链SCFA,用电导检测器进行检测。与紫外检测比较,电导检测更适用于SCFA的检测。1.3.4 CE法与GC和HPLC相比,CE用于SCFA的测定具有快速、简便、样品量少和反应条件温和等优点。但CE技术对样品的水溶性要求较高,并且由于脂肪酸缺乏紫外或荧光发色基团,在进行直接或间接紫外检测和激光诱导荧光(LIF)检测时选择衍生化试剂非常关键。CE分离测定SCFA的方法有胶束电动毛细管色谱(MEKC)、等速电泳(CIEF)和毛细管区带电泳(CZE)。间接和直接毛细管电泳-紫外检测法(CEUV)都曾被用来测定SCFA,其中间接CE-UV法因可对SCFA进行快速有效地分离而被广泛应用9。通常CE-UV能较好地分离较大范围的脂肪酸,但该方法灵敏度较低；虽然CE-LIF提高了灵敏度,但分离范围窄，这是因荧光试剂的质量大和荧光衍生化试剂的反应活性等问题引起的。例如,Zuriguel等用间接CE-UV法成功地分离了C5C18的脂肪酸,但灵敏度极低,而脂肪酸经5-BMF衍生化后用CE-LIF测定,灵敏度得到大大提高,但只能分离C8C11的脂肪酸10。因此,最佳衍生化试剂的寻找是进行CE-LIF分析的一个难点11。1.4 GC原理和应用GC是一种分离技术，利用物质的沸点、极性及吸附性质的差异来实现混合物的分离。GC用气体作流动相，即载气，一般为惰性气体，载气的主要作用是将样品带入GC系统进行分离，其本身对分离结果影响很小。GC通常以表面积大且具有一定活性的吸附剂作为固定相。当多组分混合样品进入色谱柱后，由于各组分的沸点、极性或吸附性能不同，每种组分都会在流动相和固定相之间形成分配，吸附平衡，由于载气的流动性，使各组分在运动中反复多次进行分配，吸附，结果载气中分配浓度大的组分先流出色谱柱，固定相中分配浓度大的后流出。组分流出色谱柱后随即进入检测器，检测器将各组分转换成与该组分浓度大小成正比例的电信号。当这些信号被记录下来时就是色谱图，其包含有全部原始信息。气相色谱在各领域中均有广泛的应用。在食品分析中的应用主要涉及营养成分分析和食品添加剂分析。在这两个方面气相色谱都能发挥其优势，重要的营养组分，如氨基酸、脂肪酸、糖类都可以用GC进行分析；食品的添加剂有千余种，其中有许多可用GC来检测。气相色谱在农药残留检测方面的应用：农药残留分析是复杂混合物中痕量组分分析技术，农残分析既需要精细的微量操作手段，又需要高灵敏度的痕量检测技术，自20世纪60年代以来，气相色谱技术得到飞速的发展，许多灵敏的检测器开始应用，解决了过去许多难以检测的农药残留问题12。气相色谱在药物和临床分析中的应用也有很多，实际上气相色谱方法简单易于操作，如果用气相色谱可以满足分析要求，它应该是首选的方法。特别是把GC和MS结合起来是一种集分离和鉴定、定性与定量于一体的方法，如果把固相微萃取(SPME)和GC或GC-MS结合在一起，又把样品处理及定性与定量于一体，在临床分析中很有意义。另外气相色谱还在石油和化工分析，环境污染物分析中具有广泛的应用。1.5 研究现状及进展短链脂肪酸是结肠腔内重要的有机酸阴离子,通过离子或非离子形式被结肠粘膜吸收,是结肠和小肠上皮细胞的主要供能物质.临床研究表明,短链脂肪酸能较强地维护肠道形态及功能,并具有一定的治疗作用,通过测定生物基质中短链脂肪酸的水平可以整体诊断体内厌氧菌的变化,短链脂肪酸的含量也可以反映细菌活性.因此,短链脂肪酸的测定对营养、微生物和环境的研究有重要的意义.短链脂肪酸含量的早期测定方法是滴定法，随着色谱技术的发展,气相色谱(GC)、高效液相色谱(HPLC)以及毛细管电泳(CE)已广泛用于SCFA的测定，但极性大、挥发性强和水溶性大的特点使短链脂肪酸难以定量,生物基质的复杂性也更增加了定量工作的难度.目前,原子吸收分光光度法、反相高效液相色谱技术也使用较多,方法也比较成熟。气相色谱也涉及到好多领域，比如药分析，环境污染物分析，石油化工分析，食品分析等。因此气相色谱的研究和发展也不断地进行中，自动化程度进一步提高，特别是EPC（电子程序压力流量控制系统）技术已作为基本配置在许多厂家的气相色谱仪上安装（如HP6890，ShimadzuGC-17AGC-2010，Varian3800，PEAutoXL，CE Mega8000等），从而为色谱条件的再现、优化和自动化提供了更可靠更完善的支持。色谱仪器上的许多功能进一步得到开发和改进，如大体积进样技术，液体样品的进样量可达500微升；检测器也不断改进，灵敏度进一步提高；与功能日益强大的工作站相配合，色谱采样速率显著提高，最高已达到200赫兹，这为快速色谱分析提供了保证。色谱工作站功能不断增大，通讯方式紧跟时代步伐，已实现网络化，从技术上讲，现在实现气相色谱仪的远程操作（样品已置于自动进样器中）是没有问题的13。第二章 材料与方法2.1 实验材料2.1.1 实验试剂和药品表2.1实验试剂和药品一览表试剂名称纯度来源乙酸色谱纯北京半夏科技有限公司丙酸色谱纯北京半夏科技有限公司丁酸色谱纯北京半夏科技有限公司乳酸色谱纯北京半夏科技有限公司2-甲基丁酸色谱纯北京半夏科技有限公司乙腈色谱纯北京半夏科技有限公司盐酸分析纯国药集团化学试剂有限公司氯化钠分析纯国药集团化学试剂有限公司磷酸分析纯国药集团化学试剂有限公司偏磷酸分析纯国药集团化学试剂有限公司乙醚分析纯国药集团化学试剂有限公司2.1.2 实验仪器和设备表2.2实验仪器和设备一览表仪器设备名称型号规格来源气相色谱仪CP3800美国瓦里安VARIAN公司气相色谱注射针5微升迪马公司离心机实验室仪器搅拌机H7-SGJ101实验室仪器电子天平AY220型实验室仪器2.2 实验方法2.2.1 标准液配制标准液配制：量取乙、丙、丁酸的色谱纯标准品，分别加入10L, 1mol/L的内标溶液（2-甲基丁酸），以溶剂乙腈稀释至0.1mL，制成乙、丙、丁酸浓度分别为0.02，0.04，0.06，0.08，0.1mmol/l的标准系列溶液。2.2.2 色谱条件的优化色谱条件是直接决定色谱图质量的一个重要实验条件。为了确定效果好的气相色谱条件，我们用标准短链脂肪酸样品测定对象，比较了3种色谱条件。色谱条件A：柱型号JM122-7032；柱规格为30.0m250mm0.25m的DB-WAX毛细管柱测定采用程序升温，初温90，保持1min；以60/min速度升至170；然后以15/min速度升至250，柱温度90，分流比为7.8；1，载气为氮气，燃气氢气，流速为17.6mL/min，FID检测器温度为250，进样口温度为200，进行时间6.33min.色谱条件B：柱型号 JM122-7032；柱规格为30.0m250mm0.25m的DB-WAX毛细管柱。测定采用程序升温，初温100，保持0.5min；以8/min速度升至180，保持1min；然后以20/min速度升至200，保持5min，分流比为10:1，载气为He，流速为1.2mL/min，FID检测器温度为250，进样口温度为250。色谱条件C：柱型号JM122-7032；柱规格为30.0m250mm0.25m的DB-WAX毛细管柱。柱子温度230，进样口温度230，初温60保持1min，以6/min的速度升至120，再以20/min的速度升至220，保持5min。2.2.3 样品处理方法色谱条件为上面所述色谱条件二（下同）。标准溶液的配制和测定跟上面所述保持一致。第一个样品处理方法：盐酸水提法。准确称取粪便样品0.5g于10mL离心管中；加入4mL稀释液(15mL100mmol/L2-乙基丁酸和50mL5mmol/L的HCl混合而成)；均质1min；于5000r/min离心20min；取1mL上清液于安培瓶中，进行GC分析。根据标准曲线计算得出短链脂肪酸含量。第二种样品处理方法：偏磷酸处理法。准确称取备用大鼠粪便0.5克溶于7mL离心试管中，加纯水0.5mL，漩涡混匀5min，以转速15000r/m,4，离心20min，取上清液于另一个离心管，加入体积分数为25%的偏磷酸溶液100mL，漩涡混匀5min，4，放置过夜，后再以转15000r/m,4，离心20min，取上清液，再用10L上清液，加10L内标配成0.1mmol/L样品溶液，走气相色谱。偏磷酸在本实验中具有脱水浓缩样品，沉淀粪便溶液中的蛋白质和磷酸化的作用。第三个样品处理方法：水提乙醚萃取法。准确称取备用的大鼠粪便0.5g，加入4mL稀释液(15mL100mmol/L的2-乙基丁酸和50mL5mmol/L的HCl混合而成)，涡旋混匀，4000r/min离心10min，取1mL上清液于EP管中，用乙醚萃取3次，三次的乙醚倒在一起，加10L内标，加适量的无水硫酸钠除水，把乙醚转移到有塞子的小瓶子里，在通风处挥发到一定体积，盖上盖子放在4冰箱待测，乙醚挥发速度很快，一定注意也要尽快测定。第四种样品处理方法：固相微萃取法。冻干的样品称重取0.5g后用5mL水复溶搅匀,加入5mol/L的盐酸调节上清液pH23,静置10min后离心,取上清液，在SPME装置上，60条件下，萃取半个小时，把萃取针萃取的溶液进入气相色谱系统检测。2.2.4 样品的测定实验大鼠分为对比组和实验组，对比组包括正常大鼠和模型（肥胖的）大鼠，实验组包括高剂量，中剂量，低剂量灌胃原花青素的大鼠。实验样品为取自上述三组大鼠两周，四周，六周时间间隔后的粪便，放在零下20冰箱里的备用品。样品前处理之后，标号，走选择好的气相色谱程序，获得各样品气相色谱图之后，根据各酸的标曲算出个样品中四种短链脂肪酸的含量。根据数据分析实验结果并总结。第三章 结果与分析3.1 气相色谱条件优化采用乙酸标准品，研究3种色谱条件对乙酸气相色谱分离效果，峰型的影响。图3.1 采用色谱条件A的乙酸GC图谱（3：内标；4：乙酸；6：溶剂）图3.2 色谱条件B的乙酸GC图谱（1：内标；2：乙酸；3：溶剂）图3.3 采用色谱条件A的乙酸GC图谱（1：内标； 3：乙酸； 4：溶剂）以乙酸标准样品气相色谱图为例，比较三种色谱条件效果。色谱图的质量可以从色谱图基线平度，各峰相互分离的程度，杂峰数量等几个方面可以确定。从乙酸三种色谱条件下的图可以看出第一种和第三种方法，基线不平，各峰没有完全分离开来，第二种色谱条件下出来的峰比较分散，可以更好的定性和定量分析，所以可以确定最佳色谱条件为色谱条件B。3.2 标曲制作为了确定样品中短链脂肪酸的含量，先用五个已知浓度梯度的短链脂肪酸标准溶液，作出一条标准曲线。以系列溶液中各酸的浓度（mmoL/L）与内标物浓度mmoL/L）比为横坐标(x)，各酸组分与内标物的峰面积比为纵坐标（Y），建立标准曲线，进行回归计算，得到线性回归方程。本实验测得乙酸，丙酸，丁酸，乳酸的标准曲线如表所示。表3.1SCFA保留时间和标曲酸名酸名保留时间（min）线性方程R平方值乙酸1.07Y=0.4554x+0.0220.992丙酸1.25Y=0.5421x+0.1230.99丁酸1.75Y=0.5568x+0.1210.994乳酸6.83Y=0.4242x+0.0160.9943.3 前处理方法的优化为了使样品前处理方法具有可比较性，所有的样品选择4号样品做测试对象。以下为4种方法的气相色谱图。图3.4 盐酸提水法GC色谱图（1.乳酸2.内标4.丁酸5.乙酸6.溶剂7.丙酸）图3.5 偏磷酸法GC色谱图（ 1.乳酸；2.内标；5.丁酸；6.丙酸；7.乙酸）图3.6 水提乙醚萃取法GC色谱图（1：乳酸；2：内标；3：丁酸；4：丙酸；6：乙酸；7：乙醚）图3.7 固相微萃取法GC色谱图（1.乳酸4.丁酸5.丙酸7.乙酸）从色谱图的角度分析，盐酸水提法得到的样品图各峰没有彻底分离开来，有峰连续的现象，基线不平的现象。偏磷酸处理法，还存在一些明显的杂峰还没消除掉，但基线比盐酸水提法基线的平度好，可以提高分析结果的准确性。有机萃取法是短链脂肪酸提取中的有效方法，本实验中经过多次试验之后，水提乙醚萃取法效果比其他方法好，各目标酸峰分离的比较好，虽然气相色谱图结果当中乙醚峰面积最大，但结合内标峰面积可以比较准确的算出短链脂肪酸的含量。固相微萃取效果相对第一和第二种方法效果好，但还是存在杂峰比较多，效果不如水提乙醚萃取方法好。固相微萃取中萃取时间比较长，萃取温度也比较高，因为粪便中各种物质种类比较多，在这种萃取条件下难以确定短链脂肪酸是否与粪便中的其他物质发生反应，这方面还需要进一步研究确。3.4 大鼠粪便SCFA含量的测定测定来自三组大鼠的15个粪便样品，得到SCFA含量如图3.8所示。图3.8大鼠粪便样SCFA浓度从图3.8可以看出模型组的SCFA总含量少于其他两个组，灌胃原花青素的实验组SCFA总含量比其他两组高。低，中，高剂量组相互比较时，SCFA随着原花青素的剂量增加而增加，这说明原花青素对大鼠降脂有一定的促进作用。四种酸含量中乙酸和乳酸比较多，丁酸明显少于其他SCFA。3.5 误差分析本次试验存在一些造成误差的因素，这些因素包括样品的状态，样品处理过程中实验者操作中产生的误差，因为各种原因在色谱图中产生的基线不平，杂峰多等几个方面因素。所谓基线不稳定，也就是基线的噪音、漂移以及该检测器的基流等超出了仪器所要求的最低指标。引起基线不稳的因素很多，如外围条件、工作站、电路、气路都有可能。样品太脏，柱箱或者检查器温度不稳定，FID气体配比不合适导致火焰不稳，柱填充物松动，柱中固定相流失等状态都可能导致基线不平。同理使保留时间改变的因素也很多，气路泄露，进样不合适，进样者进样操作不一致或不规范都可能导致保留时间不一样。样品的状态也是直接影响实验结果质量的关键因素。实验过程中多次重复融化样品和冻结样品，导致样品质量变差。实验15个样品，数量比较多，这个因素也可能导致往后测得样品结果有所差别。这些造成实验误差的因素，都可以加以调整，从而减少或避免误差的产生。第四章 结论与建议4.1 结论1.通过三组优化实验得到测定大鼠粪便中短链脂肪酸的最佳色谱条件:色谱条件B。色谱条件B:柱型号JM122-7032；柱规格为30.0m250mm0.25m的DB-WAX毛细管柱。测定采用程序升温，初温100，保持0.5min；以8/min速度升至180，保持1min；然后以20/min速度升至200，保持5min，分流比为10:1，载气为He，流速为1.2mL/min，FID检测器温度为250，进样口温度为250。2.四种样品前处理方法当中最佳方法:乙醚萃取法。3实验结果为模型组的SCFA总含量少于其他两个组，灌胃原花青素的实验组SCFA总含量比其他两组高。低，中，高剂量组相互比较时，SCFA随着原花青素的剂量增加而增加，这说明原花青素对大鼠降脂有一定的促进作用。4.2 建议本实验的研究仍有许多工作有待进一步研究，本实验没有定量算出四种样品前处理方法的SCFA提取率，只局限在从色谱图的质量来分析，因此前处理方法的优化过程还有进一步细化的空间。大鼠粪便中各种物质种类很多，SCFA是否与其他物质发生反应，发生什么样的反应还是一个值得进一步研究的内容。致谢 在本次论文设计过程中，感谢我的学校，给了我学习的机会，在学习中，老师从选题指导、论文框架到细节修改，都给予了细致的指导，提出了很多宝贵的意见与建议，老师以其严谨求实的治学态度、高度的敬业精神、兢兢业业、孜孜以求的工作作风和大胆创新的进取精神对我产生重要影响。他渊博的知识、开阔的视野和敏锐的思维给了我深深的启迪。这篇论文是在老师的精心指导和大力支持下才完成的感谢所有授我以业的老师，没有这些年知识的积淀，我没有这么大的动力和信心完成这篇论文。感恩之余，诚恳地请各位老师对我的论文多加批评指正，使我及时完善论文的不足之处。感谢认真教我具体实验操作，指导我分析数据和论文修改的宋雪琳学姐。谨以此致谢最后，我要向百忙之中抽时间对本文进行审阅的各位老师表示衷心的感谢。参考文献1陈燕,曹郁生,刘晓华.短链脂肪酸与肠道菌群J.江西科学,2006,24(1):38-40.2刘小华，李舒梅，熊跃玲.短链脂肪酸对肠道功效及其机制的研究进展J.肠外与肠内营养,2012,19(1):1-33徐丹凤,孙建琴.短链脂肪酸对结肠功能的影响J.营养健康新观察.2009,12(2):7-104谭力,罗楠,刘放南等.非衍生化2-气相色谱法测定人血清游离脂肪酸谱J.肠外与肠内营养,2003,10(4):236-2385包娜然,卯新民.血及尿中挥发性脂肪酸的气相色谱测定J.兰州医学院学报,1990,16(4):185-1876翁霞,辛广.生物样品中短链脂肪酸提取测定及其应用进展J.鞍山师范学院学报,2010,12(4):27-327张玉宝.气相色谱仪的应用及发展趋势J.生命科学仪器,2006,4(6):26-288孙晓红,HeinerAM,ElzingaH等.用气相色谱-同位素比值质谱法测定体外肠道细菌发酵产生的短链脂肪酸J.贵阳医学院学报，2002,27(2):95-999令博，赵国华，明建.天麻多糖PGEB-3-H对大鼠肠道内短链脂肪酸的影响J.食品科学,2011,32（11）：284-28710黎源倩,张立实,刘国钧等.大鼠粪样中Cl-C6脂肪酸的分析J.华西医大学报.1994，25(4),456-45911孙树英,王秀玉,李启清.尿短链脂肪酸的气相色谱测定法J.中国病理生理杂志,1989,5(4):255-257.12徐运杰,方热军,戴求仲.短链脂肪酸的营养生理作用J.饲料研究,2007,(8):26-28.13詹彦,支兴刚.短链脂肪酸的再认识实用临床医学J.2007,(8):134-136.14王子花,申瑞玲,李文全.短链脂肪酸的产生及作用J.畜牧兽医科技信息,2007(2):12-13.15申瑞玲,王章存,姚惠源.燕麦-葡聚糖对小鼠肠道菌群的影响J.食品科学,2005,26(12):208-212.16张勇兵,气相色谱法在微生物检测中的应用J.实用预防医学,2008,15(1):291-29317张树成，张海兰，王维林等功能性便秘儿童粪便短链脂肪酸的气相色谱分析及临床意义J中华小儿外科杂志,2010,31(4)276-27918孙树英.尿短链脂肪酸的气相色谱测定法J.中国病理生理学杂志1989;5(4):255-25919耿珊珊.短链脂肪酸对结肠肿瘤细胞增殖分化的影响J.肠外与肠内营养,2005,12(5):295-298.20谢笔钧,龚玉石,肖俊松等.莲房原花青素对大鼠红细胞膜维生素E及膜脂流动性的影响J.营养学报,2005,27(1):30-3321MintzerMA,SimanekEE.Nonviral 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介绍短链脂肪酸有人类结肠中细菌发酵而产生。今年来对短链脂肪酸生成的兴趣增加是因为有关其中一些酸的积极生理效应的证据在增多。大肠中的主要短链脂肪酸乙酸、丙酸和丁酸。丁酸是粘膜细胞首选的能量底物，而且被提出在预防和治疗结肠疾病中发挥重要作用。从结肠细胞代谢中逸出的短链脂肪酸会进入肝组织门脉血液。乙酸可以是脂肪生成的前提物质，也会促进糖异生作用，丙酸则抑制糖异生，在肝脏中用乙酸合成胆固醇。一般认为丙酸是被结肠上皮细胞代谢的，但最近在猪上的研究发现随着结肠中生产速率的增加它在门静脉和颈静脉上的浓度也增加。从这种关系来看，我们应该注意的是丙酸也会影响纳米-2-细胞中的脂质代谢。既然短链脂肪酸的生成方式和含量是由结肠附近的碳水化合物来决定，那通过膳食改变这些参数也有可能。因此血液中短链脂肪酸的测定，在设计健康饮食方案时，在结肠附近膳食纤维和膳食碳水化合物的影响筛选，诊断和检测中起重要作用。但是跟粪便，血液，血浆或血清含有的短链脂肪酸浓度低，所以操作中会需要高灵敏度的技术。一般的短链脂肪酸测定方法包括带有或不带有溶剂萃取之后的质谱分析，离子交换，真空蒸馏，固相微萃取和衍生化的毛细管气相色谱法。其他常用分析血液中短链脂肪酸的技术包括高效液相色谱法，稳定同位素示踪和毛细管电泳等。虽然乙酸，丙酸，i-丁酸，n-丁酸，i-戊酸和n-戊酸等短链脂肪酸在血液中被发现，只有乙酸，丙酸，丁酸可以用上述提到的方法定量和定性分析，而i-丁酸，i-戊酸，戊酸在各种血液样品中微量的存在不能被定量测定出来。此外，这些方法经常需要至少400微升的血液样品，这有时候可能成为限制反应的因素，尤其是在动物实验中，像老鼠等。因此，在少量样品中的这些分析物的富集和纯化方法的发展有很大的必要。支掌液膜萃取已经被在生物液中各种分析物的选择性清理和预富集步骤，包括各种集体中的少量羧酸。这个研究中，中空纤维支掌液膜方法在用气相色谱分析之前的血清短链脂肪酸的萃取和富集方面做了研究。这个方法的目的是为在限制量为100微升的血清样品中的这些上述提到的短链脂肪酸，提供足够的富集量，使它们被定量测定。2. 实验过程2.1设备色谱分析进行了使用 装有火焰电离检测器的安捷伦6890N气相色谱仪系统 （FID）和N10149自动液体进样器（美国Agilent公司）。与游离脂肪酸相熔融石英毛细管柱使用 （DB-FFAP125-3237，JW科学公司，安捷伦科技公司 公司，美国）30米0.53毫米内径涂有0.50微米厚的薄膜。数据处理进行了惠普 化学工作站Plus软件（A.09.xx，安捷伦）。聚丙烯中空纤维管（50微米壁厚， 280微米内径0.1微米孔径大小，型号50280 Accurel PP）是从Membrana有限公司（伍珀塔尔获得 德国）。BD微细注射器（带0.30毫米针 外直径8厘米长，0.5毫升保持体积和制备 对于U-100胰岛素注射剂）购自BD消费者获得 医疗保健（经由本地药学），和用于填充受体 到中空纤维提取的内腔并冲洗掉 受体从该中空纤维的内腔中加入100微升 拉点锥形玻璃瓶（安捷伦，美国）。2.2材料高纯度的短链脂肪酸被用来制备标准品。 乙酸（100）和戊酸（99）为购买于 默克公司（德国达姆施塔特）。丙酸（100）购自 詹森化学（比利时），而i-丁酸（99），但丁酸（99）和 i-戊酸（99）购自Sigma（圣路易斯，密苏里州，美国）。2- 乙基丁酸用作内标，从 Sigma-Aldrich公司购买的（化学有限公司，斯德海姆，德国）。配制浓度为25mM的乙酸，1mM的丙酸，丁酸，i-丁酸，3mM的戊酸，0.5mM的i-戊酸标准水溶液。一个包含六种目标分析物的溶液用适量个级别的库存溶液用水稀释。也要配制一个内标标准溶液含有2 - 乙基丁酸用12甲酸溶液 。所有的标准溶液和样品溶液， 配制好之后贮存于-0.20，直到使用。正三辛基氧化膦（TOPO）和二己基甲醚 （DHE）均购自Sigma（圣路易斯，密苏里州，美国）。有机膜液是用适当的正三辛基氧化膦溶解在二己基甲醚配制。用到分析纯盐酸（30） 和甲酸（98-100）。12M盐酸用于供体酸化，用12（V / V）甲酸清洁气相色谱柱。分析纯氢氧化钠购自Merck公司（达姆施塔特， 德国）和它的水溶液（0.1-0.3 M）作为基本 受体。试验中使用的所有的水用Milli-Q水纯化系统纯化（Millipore，法国Molsheim）。2.3样品的准备由隆德大学医院（瑞典）提供冷冻人血清用于方法开发和验证。方法实行的时候，人血清来自四个健康受试者 门脉血清从9 个斯普拉格-杜勒鼠(Sprague-Dawley)大鼠样品 。隆德大学对人类和动物研究伦理委员会认可这个实验。大鼠的样品中，2个门静脉血样品取自用含有8的菊粉的饮食喂养（w / w的计算上干 重量为基准，DWB）为13天的大鼠 ，而其他7个样品，取自喂食含12蓝莓壳的饮食 （w / w的，DWB）和1毫升益生菌/天（加氏乳杆菌，L. crispatus，L. 植物乳杆菌，之B. infantis）为13天的大鼠.大鼠获得的门脉血转移至血清管和离心15分钟（2500克，19C）和储存在-20C直到准备样品和分析。为准备酸性供体，100微升血清样品用与1350微升水稀释.稀释的血清溶液的pH，用2M 的盐酸（约11微升需要的话）调节至2， 稀释的血清溶液体积通过加入水达到1500微升 。2.4提取过程提取过程是根据作者刘静福等人的描述进行了一些修改。简单地说，一块中空