毕业设计（论文）-苯环5-取代磺酰脲类除草剂的水解研究.doc

论文封面苯环5-取代磺酰脲类除草剂的水解研究【摘要】随着磺酰脲类除草剂在农业生产中的广泛使用，一些磺酰脲类除草剂在土壤中的残留大大地超出了人们的预期，其残留问题以及对后茬作物产生的危害已经引起关注。因此，开发新型的环境友好型磺酰脲类除草剂，具有重要的意义，而新品种的开发和应用在关注活性、选择性的同时，更需注意残留问题，提高对后茬作物的安全性。本文所研究的几种化合物是常用的除草剂氯嘧磺隆和我们课题组自主研发的高效、低毒和易降解的新型磺酰脲类除草剂品种， 通过高效液相色谱法测定【关键词】磺酰脲除草剂；水解；高效液相色谱；半衰期Study on hydrolysis experiments of the 5-substituted benzene sulfonylurea hebicides【Abstract】With the worldwide application of the Sulfonylurea herbicides in agriculture, somesulfonylurea herbicides residuesmight exist in soil longer then people expected, so the residualproblems andthe harm toafter cropshavecaused more attention. Consequently,it has great significance to develop environment friendly type of sulfonylurea herbicides.Focus on the development and application of new varieties in activityand selectivity,at the same time, more attention should be paid to residual problems,to improve the safety on the succeeding crops. Several compounds in this research are new sulfonylurea herbicides in our group of independent research, with the features of high efficiency,low toxicity and easy degradation.【Keywords】Sulfonylurea；Hydrolysis；HPLC；Half-life第一章 前言1.1 乙酰羟酸合成酶及其抑制剂概述1.2 磺酰脲类除草剂的研究进程及种类1.2.1磺酰脲类除草剂的基本结构与特点 1.2.2磺酰脲类除草剂的研究开发 1.2.3 已商品化的磺酰脲类除草剂的种类1.3 磺酰脲类除草剂的降解方式及其影响因素 1.3.1 磺酰脲类除草剂的化学水解及其影响因素 1.3.2磺酰脲类除草剂水解的微生物降解及其影响因素 14 磺酰脲类除草剂残留问题1.5 论文的立题依据、研究内容和创新点第二章 高效液相色谱法简介和色谱条件的选择 2.1 高效液相色谱法 2.2 色谱条件的选择 2.2.1 固定相的选择 2.2.2 最佳检测波长的选择 2.2.3 流动相的选择 2.2.4 流动相比例的选择 2.2.4 最佳流速的选择第三章 实验方法和步骤 3.1 实验材料和仪器 3.1.1 实验原料与试剂 3.1.2 主要设备与仪器 3.2 缓冲溶液的配制 3.3 标准工作曲线的制备 3.4 样品的水解动力学测试第二章 实验结果与讨论第一章 前言1.1 乙酰乳酸合成酶及其抑制剂概述1.1.1乙酰乳酸合成酶乙酰乳酸合成酶（acctolactate synthase,ALS）在高等植物中，存在于叶绿体的基质，是支链氨基酸生物合成途径中的一个关键酶，是绿色除草剂的重要作用靶标1。 ALS活性受产物缬氨酸和异亮氨酸的反馈调节，其活性的降低，会导致支链氨基酸缬氨酸，亮氨酸和异亮氨酸的合成受阻，从而影响蛋白质的合成，抑制细胞分裂，使有丝分裂指数下降，同时植物组织失绿，黄化，植物生长受阻，最后逐渐死亡。在关于杂草和作物的耐药性、抗药性的研究方面，ALS有着极其重要的作用。1.1.2乙酰乳酸合成酶抑制剂ALS抑制剂通过抑制ALS酶而使植物体内缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸的合成受阻，由于此生物合成过程只存在于植物和微生物体内，因此，此类抑制剂对人和动物并无危害。另外，ALS抑制剂因兼具生物活性高、应用范围广、高选择性和低毒性的特点，使其成为杂草防除技术发展的一大突破。目前，磺酰脲类除草剂是开发最多的ALS抑制剂，到2007年全球已有32个品种。1978年，DoPont公司成功开发第一个ALS抑制剂氯磺隆(Chlorsulfuron)。氯磺隆具有超高效、高选择性、低用量等特点，一般使用量2 g/hm2就可以达到很好的除草效果，并且对哺乳动物安全低毒，其半致死量为6000 mg/kg，能杀死包括麦类、亚麻田等在内的大多数杂草。以ALS为靶标的抑制剂大致可分为15类，其中重要的结构有5类（图1）：磺酰脲类（Sulfonylureas,1）、咪唑啉酮类（Imidazolinones, 2）、三唑嘧啶类（Triazolo-Pyrimidines, 3)、嘧啶水杨酸类（Pyrimidinylthio-benzoates, 4）和 磺酰胺基羰基三唑啉酮类（Sulfonylamino-carbonyltriazolinones, 5）等2。图1.1 五类ALS抑制剂的基本结构Fig.1.1 Basic strucure of five types of ALS-inhibiting herbicides这些除草剂均为内吸传导型，可被杂草吸收，并传导到其他部位起作用，在分生组织内积累而使植物逐渐死亡。杂草的中毒症状一般为：叶片失绿，黄化，节间缩短，顶芽死亡，最后全株死亡。随着除草剂的研究开发，涉及的化合物类型也越来越多，植物ALS抑制剂不仅会向高效、低毒和高选择性发展，而且随着三维构效关系研究和分子设计水平的提高，定将出现更多结构新颖的品种3。1.2磺酰脲类除草剂概述磺酰脲类除草剂自诞生以来因高效、低用量、高选择性等特点得到了广泛的应用，是目前世界上最大的一类除草剂，其研究开发具有重要的意义。磺酰脲类除草剂作为一种乙酰乳酸合成酶（ALS）抑制剂而对人和动物的低毒性也使其在将来仍是农药除草剂高科技发展的研究方向。一般来说，磺酰脲类除草剂具有如下特点：（1） 超高活性和低用量 磺酰脲类除草剂通过抑制植物体内乙酰乳酸合成酶（ASL），使支链氨基酸（缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸）的生物合成受阻，从而抑制植物细胞分裂和生长。由于抑制ASL活性所需外源物质质量浓度极低，磺酰脲类除草剂以极低剂量（约275 g/hm2）表现出超高的除草活性，为传统除草剂的1001000倍。（2） 高选择性 Sweetser等科学家阐明了磺酰脲类除草剂具有选择性的机理4。不同植物对除草剂代谢能力、途径和降解水平差异很大，表现出的敏感度不一样。同种除草剂在不同植物内的降解速度也不同，如氯磺隆在小麦植株内代谢很快，半衰期为24 h，而在敏感植物体内半衰期大于2448 h。（3） 杀草谱广 全部品种都能防除阔叶草，部分可杀害乔本科或莎草科杂草。（4） 低毒性 ALS抑制剂通过抑制ALS酶而使植物体内缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸的合成受阻，由于此生物合成过程只存在于植物和微生物体内，因此，此类抑制剂对人和动物并无危害。（5） 对环境友好 所有磺酰脲类除草剂都容易在土壤中发生化学水解和微生物降解，半衰期为18周。该类除草剂是非挥发性弱酸，pKa在3.35.3之间。在正常土壤PH下，磺酰脲桥上得氮都可以发生电离，形成中性分子和阴离子态分子5。(6) 一些品种土壤残留较长，影响后茬作物1.2.1磺酰脲类除草剂的发现Levitt G.博士最开始在杜邦公司的工作是合成许多磺酰基异氰酸酯，目的是合成除草剂（1）的类似物（2），并于1957年合成了化合物（2），但化合物（2）和（3）没有值得重视的活性，因此该工作停止。1973年，Sharp S.S.博士在研究螨类化学绝育活性时，意外发现化合物（3）可使螨类不育。于是，Levitt G.博士就合成了化合物（3）的类似物化合物（4），发现（4）在2.0kg/hm2剂量下具有弱的植物生长调节活性。两年后，Levitt G.博士6对（4）进行了结构修饰，把右边4-氰基苯基换为4,6-二取代基嘧啶基，合成了化合物（5）。化合物（5）可以说是磺酰脲类除草剂真正的先导化合物，其活性是化合物（5）的1000倍。到1978年，DuPont公司的研究团队开发出第一个商品化的磺酰脲类除草剂氯磺隆（6）。氯磺隆除草剂施用量为2g/hm2就能达到很好地抑制效果，且对人畜无害7。图1.2 磺酰脲类除草剂的发现Fig.1.2 The discovery of sulfonylurea herbicides1.2.2磺酰脲类除草剂的基本结构磺酰脲类除草剂由芳环、磺酰脲桥和杂环组成，为内吸传导型选择性除草剂，通过作用于植物体内的乙酰乳酸合成酶（ALS）抑制植物根和幼芽顶端生长，从而使杂草渐渐死亡8。磺酰脲类除草剂的结构通式如（图1.3）所示，可分为苯环、脲桥和杂环。磺酰脲桥连接着芳环和杂环，R1可以是脂肪族、芳族或杂环，杂环可以是取代三嗪类或嘧啶类。图1.3 磺酰脲类除草剂的基本结构Fig. 1.3 Basic structure of sulfonylurea herbicides1.2.3 磺酰脲类除草剂的研究与发展20世纪80年代，美国杜邦公司的Levitt首先报道磺酰脲类除草剂具有除草活性，并于1982年首次开发出麦田除草剂氯磺隆(chlorsulfuron)，它以极低用量进行苗前土壤处理或苗后茎叶处理,可有效地防治麦类与亚麻田大多数杂草，标志了除草剂进入超高效时代。自此，许多大农药公司纷纷开始进行此类除草剂的研究和开发，如巴斯夫、拜耳作物科学、杜邦、ISK、日本日产化学和孟山都等公司9。紧接着开发出甲磺隆，随后又开发出甲嘧磺隆、氯嘧磺隆、苯磺隆、阔叶散、苄嘧磺隆等一系列品种。磺酰脲类类除草剂对众多一年生或多年生杂草有显著效果，广泛应用于水田、旱地、园林、森林防火隔离地带与非耕地杂草。我国是磺酰脲类除草剂生产和使用大国，许多品种如苄嘧磺隆、氯磺隆、甲磺隆和苯磺隆等在我国推广使用超过20年，为我国农作物增产增收发挥了巨大的作用10。2007年全球有32个磺酰脲类除草剂商品，其中销售额上亿美元的有8个，销售额在0.51亿美元的有7个，销售额在0.30.5亿美元的有6个，0.3亿美元以下的品种11个11。1.2.4 已商品化的磺酰脲类除草剂的种类自氯磺隆除草剂成功投入市场后，磺酰脲类除草剂进入了迅速发展的阶段。除杜邦公司外，其它农药公司也纷纷进行研究和开发，如国外公司德国拜耳、孟山都、日本化学、美国氰胺，国内研究机构湖南化工研究所、南开大学等，已有的商品化品种见表1.112-16。表1.1 已商品化的磺酰脲类除草剂品种Table. 1-1 The variety of commercial sulfonylurea herbicidesCommon name(中文名称)Code化合物结构适用作物用量(g/hm2) Chlorsulfuron(氯磺隆)DPX 4189谷类925 (Metsulfuron-Methyl)(甲磺隆)DPX-T6376谷类48 Thifensulfuron-Methyl（噻吩磺隆/阔叶散/宝收）DPX-M6316谷类/大豆1530 Sulfometuron-Methyl（甲嘧磺隆/嘧磺隆）DPX 5648草坪70840Triasulfuron(醚苯磺隆)CGA 131036谷类510Cinosulfuron(甲醚磺隆/莎多伏/耕夫)CGA 142464水稻1530Bensulfuron-Methyl（苄嘧磺隆/农得时)DPX-F5384水稻2075Chlorimuron-Ethyl)(氯嘧磺隆/豆威/豆磺隆)DPX-F6025大豆1025Tribenfuron-Methyl(苯磺隆/巨星)DPX-L5300谷类930Pyrazosulfuron-Ethyl(吡嘧磺隆/草克星)NC-311水稻1530Prosulfuron(氟磺隆/比克)CGA152005玉米1040Ethametsulfuron-Methyl(苯胺磺隆)DPX-A7881油菜1025Nicosulfuron (烟嘧磺隆/玉农乐)DPX-V9360玉米3570Primisulfuron-Methyl(氟嘧磺隆)CGA136872玉米1040Flazasulfuron (啶嘧磺隆/秀百宫)SL-160草坪25100Triflusulfuron-Methyl(氟胺磺隆)DPX 66037甜菜1025Azimsulfuron (四唑嘧磺隆/康宁)DPX A8947水稻2025Cyclosulfamuron(环丙嘧磺隆/金秋)AC 322140谷类/水稻25504560Amidosulfuron(酰嘧磺隆/好事达)AE F075032谷类3060Rimsulfuron(砜嘧磺隆/宝成)DPX E9636玉米1035Sulfosulfuron(磺酰磺隆)MON 37500小麦1035Ethoxysulfuron(乙氧嘧磺隆/太阳星)Hoe 095404谷类/水稻10120Oxasulfuron (环氧嘧磺隆/大能)CGA 277476大豆6090Flupytsulfuron-Methyl Sodium(氟啶嘧磺隆)DPX KE459谷类10Iodosulfuron-Methyl Sodium(碘甲磺隆钠)AEF 115008谷类10Foramsulfuron(甲酰胺嘧磺隆)AEF 130360玉米3045Mesosulfuron-Methyl(甲磺胺磺隆)AEF 130360谷类1530甲硫嘧磺隆反枝苋3045单嘧磺隆粟3060单嘧磺酯小麦15301.3 磺酰脲类除草剂的降解方式及其影响因素 磺酰脲类除草剂在水及土壤中的降解方式只要有两种：化学水解和微生物降解，通过其他降解途径如光解、挥发等转化的很少，只有Brown(1998年)报道的嘧磺隆在水溶液中和土壤表面会迅速光解而消失17。1.3.1 磺酰脲类除草剂的化学水解磺酰脲类除草剂的化学水解（图1.4）主要是指磺酰脲键桥断裂，生成相应的磺胺及杂环型的胺类化合物。化学水解是磺酰脲类除草剂在酸性和中性土壤中重要的降解途径，一般认为，磺酰脲类除草剂在水及土壤中发生酸催化的非酶化学水解反应的机理是水分子作用于磺酰脲桥的羧基碳，使脲桥断裂成无除草活性的芳基磺酰胺和氨基杂环，放出CO2。 Schneiders等认为磺酰脲除草剂的水解机制是磺酰脲桥缩短，而噻吩磺隆水解机理则是断裂磺酰脲键桥和在三嗪环甲氧基功能团上发生脱甲基反应18。Hemmala等（1994年）研究了绿黄隆、甲黄隆的水解机理，结果表明：在酸性或碱性介质中，绿黄隆、甲黄隆先水解为较大分子的芳基磺酰胺甲酸，再水解为小分子的磺酰胺和CO219。图1.4 磺酰脲类除草剂的化学水解Fig.1.4 Chemical hydrolysisof sulfonylurea herbicides1.3.2 影响磺酰脲类除草剂化学水解的主要因素影响磺酰脲类化合物的化学水解的主要因素是化合物本身的化学结构、缓冲溶液的PH和温度，除此之外，土壤PH值、有机质含量和降雨量也影响着磺酰脲类除草剂的化学水解。(1) 化合物的自身结构 磺酰脲类除草剂的化学水解主要取决于化合物本身的化学结构，化学结构的微小改变都会影响微生物的降解。结构相同的磺酰脲类化合物分子型比阴离子型敏感250 1000倍；不同结构的磺酰脲类除草剂化学水解的途径也不相同，含苯系芳环的化合物易发生脲桥水解和杂环部分烷氧基的羟基取代反应20。不同化学结构的磺酰脲化合物水解速度也不同，苯磺隆的噻吩取代了芳基也容易水解。近年来开发的麦田除草剂苯磺隆、噻磺隆初始降解速度比绿磺隆、甲磺隆快2050倍，半衰期为7d左右，主要是由于化学结构的改变所致，从结构上看，苯磺隆和噻磺隆都是甲磺隆的“类似物”，区别在于苯磺隆的磺酰脲桥上多了一个取代甲基，这一改变使苯磺隆在酸性和碱性条件下，磺酰脲桥对水解更加敏感，水解速度比“正常桥”快1025倍，而噻磺隆则以噻吩代替甲磺隆的苯环，此变化决定了噻磺隆在土壤中对微生物的分解更加敏感21。(2) 温度和PH值1997年，Dinelli研究了四种磺酰脲类除草剂的降解速度与温度的关系后得出，温度越高，降解半衰期越短22。实验表明，在25，PH为2时，玉嘧磺隆的半衰期为0.08d，PH值为6.5时，半衰期为11.89d；氟嘧磺隆在PH值为2时为0.9d，而在PH值为7.5时，半衰期为398.8d。同时，将温度与降解速率常数之间的关系拟合为阿累尼乌程，建立降解速率与温度、湿度之间的函数关系,如（表1.2）所示，用来预测它们的降解情况。表1.2 4种磺酰脲类除草剂在水中降解速度与温度和PH的函数关系 Table.1.2 The function relationof 4 sulfonylurea herbicidesin waterdegradationspeed and temperatureand PH磺酰脲PH范围函数关系方程式Prosulfuron2-4lnk=(-8608/R)(1/T-1/298)+(-0.49pH+0.63)4-7.5lnk=(-8608/R)(1/T-1/298)+(-1.42pH+4.01)氟嘧磺隆2-4lnk=(-58016/R)(1/T-1/298)+(-0.06pH-0.16)4-7.5lnk=(-58106/R)(1/T-1/298)+(-1.57pH+5.57)玉嘧磺隆2-6.5lnk=(-92285/R)(1/T-1/298)+(-1.144pH+4.77)6.5-8.5lnk=(-92285/R)(1/T-1/298)+(+1.97pH-15.32)噻磺隆2.5-6.5lnk=(-34442/R)(1/T-1/298)+(-1.07pH+4.77)6.5-8.5lnk=(-34442/R)(1/T-1/298)+(+0.38pH+0.63)注：k为水解速率常数；R为KJ1/mol; T为绝对温度（K）1.3.3 磺酰脲类除草剂的微生物降解土壤中磺酰脲除草剂的降解除化学水解外，微生物降解也是非常重要的一种降解途径。其中PH值、温度、湿度和土壤类型等环境因子均能影响微生物降解除草剂的活性23。此外，微生物的种类和数量、化合物本身的结构也决定着微生物降解速度和代谢途径24, 25。磺酰脲类除草剂在灭菌土壤中的降解均比在未灭菌土壤中缓慢，而且在未灭菌土壤中降解产物更为复杂。在纯培养液中已经分离出了能降解磺酰脲类除草剂的微生物，其中包括细菌（Bacterial）、真菌（Fungi）和放线菌（Actinomycetes）26。放线菌浅灰链霉菌可以使甲基-噻磺隆迅速地降解，并且产生了9种代谢产物，这些代谢反应包括烷基化、芳基化以及N去甲基化和酯水解。甲基噻磺隆在不灭菌的的土壤中能够迅速降解，降解的第一步是去酯衍生化生产没有杀草活性的噻磺酸。另外，在不同的条件（有氧和无氧）下，微生物降解的产物也是不同的。1.3.4 影响磺酰脲类除草剂微生物降解的主要因素土壤PH值、温度、湿度等对磺酰脲类除草剂的微生物降解有极其重要的影响，除此之外，其他因素如降雨量、土壤氧气浓度、除草剂施用量和施用期等亦影响着此类化合物在土壤中的降解速度。（1） 土壤PH磺酰脲类除草剂在土壤中的移动、下移深度和速度直接与土壤类型性质有关，一般有机质含量和粘粒含量高的重土壤，吸附较强，相对移动慢，相反，有机质含量和粘粒含量低的轻土壤，吸附较弱，相对移动快，下移深27。土壤深度越深，微生物数量越少，生物降解速度越慢。磺酰脲类除草剂在土壤中的降解速度随基质PH的降低而加快。PH可直接影响微生物群落种类及微生物数量等，从而对微生物的降解能力产生影响。在酸性和中性条件下，磺酰脲类除草剂以中性型存在，水溶性弱；在碱性条件下，则以阴离子型存在，水溶性强。因此，不同PH可通过改变磺酰脲类的存在状态间接微生物的降解。另外，PH影响此类化合物辛醇/水的分配系数和水溶性，从而影响其移动性。当PH为5.0时，化合物处于中性分子状态，亲酯性最强，亲水性最弱；当PH为7.0时水溶性提高10100倍，亲酯性下降。（2）温度和湿度磺酰脲除草剂的降解速度受温度、湿度的影响，如绿磺隆在土壤中的半衰期，10时为64d，30时为9d，45时为0.4d28。磺酰脲类除草剂在土壤中的降解随着温度和湿度的升高而加快，温度和湿度对磺酰脲类除草剂的降解速度是相互作用的，且受其他环境因素的制约。不同化合物对温度和湿度的变化具有不同的反应，因为温度和湿度通过影响化合物在土壤水相中的溶解度和活性，从而影响化合物降解速度。此外，温度和湿度通过影响土壤中微生物活动及酶的活性，从而对磺酰脲类除草剂的微生物降解产生影响26。1.4 磺酰脲类除草剂的残留问题磺酰脲类除草剂可通过化学水解、光解和微生物等方式代谢降解，但仍然存在一定的残留药害。磺酰脲类除草剂残留活性土壤PH、有机质含量、温度和土壤湿度等有关。此外，磺酰脲除草剂具有很强的选择性，对不同作物的敏感性差异很大。例如玉米、小麦能降解氯吡黄隆，但大豆不能很好地降解此化合物。又如棉花对甲磺隆最敏感，对玉米次之，而水稻和油菜的耐药性较强，因此残留的甲磺隆易对敏感作物产生药害。欧盟规定对大豆中噻吩磺隆不能超过0.05mg/kg,甲磺隆不能超过0.1mg/kg，日本规定大米中苄嘧磺隆不能超过0.05mg/kg，小麦中苄嘧磺隆不能超过0.05mg/kg,番茄、洋葱和胡萝卜等蔬菜中苄嘧磺隆、氯吡嘧磺隆和甲基碘磺隆不能超过0.02mg/kg29。氯磺隆作用部位单一，易诱导抗药性杂草形成。据报导，国外在90年代初已出现抗氯磺隆的看麦娘和千金子，而且这种抗性是交互的，可使脲类、咪唑啉酮类和三氮苯类除草剂失去作用，因此在80年代末美国7个州已停止销售这一产品。此外，氯磺隆在土壤中的残留时间较长，已危及非靶标植物，我国旱作地区后茬为玉米、大豆、棉花和甜菜的麦田已被禁用30。1995年,沈阳曾发生氯磺隆污染水稻的重大事故，造成53313 hm2稻田受害，其中267 hm2绝收；1992年，因在河北麦田中使用甲磺隆，而造成后茬玉米大面积药害；1994年，在江苏油菜田施用胺苯磺隆，造成后茬水稻大面积产生药害；1984年，在英国使用过氯磺隆的田块到1986年也发生对甜菜的大面积药害31。迄今为止，已发现磺酰脲类除草剂的残留药害可伤及水稻、大豆、玉米、油菜、棉花、甜菜、亚麻、向日葵和红花等多种作物。对于氯磺隆、甲磺隆和胺苯磺隆三种磺酰脲类除草剂在使用后产生的严重药害，建议有关部门要尽快采取措施，制定长残留除草剂使用管理办法，对有些品种可以撤销登记，筛选替代品种，加快替代步伐32。1.5 论文的立题依据和意义、研究内容和创新点1.5.1 立题依据和意义随着人口的增加，人类对粮食的需求量也日益增加。据美国国际粮食政策研究所推算，现在世界粮食增长赶不上人口增长的速度。1985年后人口增长速度未变，则每年将短缺1亿吨粮食和5000万吨蛋白质，降会有更多国家人民不得不处于饥饿和营养不良的状态。据报道，为缓解粮食短缺问题，粮食增长必须提高到每年 1.5%的增长速度。因此，只有提高单位面积产量并改善作物品质，才能从根本上解决人类粮食短缺问题。农药在提高单位面积产量和确保农业稳定丰收起着至关重要的作用。因此，研发环境友好型的高效、安全低毒、低残留和低用量的绿色农药，是今后农药研究发展的趋势。磺酰脲类除草剂自诞生以来以高效、杀谱广和高选择性等特点得到了广泛的应用，作为一种乙酰乳酸合成酶（ALS）的抑制剂而对人和动物的低毒性也使其在未来仍将是除草剂研究的主要方向。但由于磺酰脲类除草剂大量、频繁地使用，越来越多的农药对该类除草剂产生了抗性，同时早期的磺酰脲剂除草剂存在降解慢和残留药害等问题。因此，对磺酰脲类除草剂的化学水解特性进行检测，得出其水解规律，有利于加快其商品化和市场化推广。根据活性测试和水解实验研究结果，课题组以氯嘧磺隆为模板设计出的 C4-氨基磺酰脲类化合物比现有商品化氯嘧磺隆的活性更好，并且降解速率快，在PH为5的条件下水解半衰期为3.22天。1.5.2 研究内容磺酰脲类除草剂在土壤环境中易发生化学水解和微生物降解，开发环境友好型的高效、低残留的除草剂是新农药研制的重要课题。环境中存在着水体、土壤有机质和温度湿度等复杂的因素，因此磺酰脲类除草剂的化学水解受多方面的影响。本文研究的几种化合物是市面上商品化的氯嘧磺隆及以其为基础自主研发的新型磺酰脲类除草剂，是经过理论模拟设计、合成以及活性测试研究的高效、易降解、高选择性的除草剂。为便于比较氯嘧磺隆和本课题合成的磺酰脲类化合物的水解规律，我们控制了无关变量，只考察在无光照条件下，PH为5的缓冲溶液的水解特性。通过实验探索氯嘧磺隆和新型除草剂的液相色谱分析条件，确定最佳检测波长、流动相及其配比、流速、固定相等色谱参数，确保实验的顺利进行和实验数据的准确性。绘制氯嘧磺隆和新除草剂的标准曲线和水解曲线，从而计算出其水解半衰期，并分析其水解特性。1.5.3 创新点目前，国内尚未出现对苯环4位取代磺酰脲类化合物的报道，本文对课题组合成的苯环4位不同取代磺酰脲类化合物进行了水解特性研究，绘制出其水解曲线并得出水解规律，开发出一种具有潜在价值、高活性和易降解的新型磺酰脲类除草剂。第二章 高效液相色谱法简介和色谱条件的选择 2.1 高效液相色谱法简介气相色谱法（Gas Chromatography，GC）虽然有分离率高、检测灵敏度高、分析速度快、样品用量小等多种优点，但由于磺酰脲类除草剂具有强极性、低挥发性以及热不稳定性等特点，对磺酰脲类除草剂进行分析时需要对其进行衍生化，故气相色谱并不适合磺酰脲类除草剂的检测分析33。高效液相色谱法是磺酰脲类除草剂残留分析中常用的检测方法。高效液相色谱法（High Performance Liquid Chromatography，HPLC）是以液体为流动相，采用高压输液系统，将具有不同极性的单一溶剂或不同比例的混合溶剂、缓冲液等流动相泵入装有固定相的色谱柱，在柱内各成分被分离后，进入检测器进行检测，从而实现对试样的分离分析的方法。该法具有高速、高效、高灵敏度、应用范围广和分析速度快等特点，其色谱柱可反复使用，样品不易被破坏，易回收。与气相色谱相比，高效液相色谱更适宜于分离、分析高沸点、热稳定性差、有生理活性及相对分子量比较大的物质，且试样不需气化，故不受试样挥发性的限制。高效液相色谱比气相色谱的范围更广，GC仅适用于20%的样品,而HPLC可以对80%的有机物进行分离，因此HPLC有着更广阔的发展前景34。2.2 色谱条件的选择 为保证实验顺利进行，我们进行了前期的色谱条件的探索。2.2.1 固定相的选择高效液相色谱常用的固定相可分为液固色谱固定相、液液色谱固定相和化学键合固定相。液固色谱固定相通过液体和固体两相之间的吸附-解吸平衡对各组分进行分离，它对具有中等相对分子质量的油溶性样品（如油品、脂肪、芳烃等）有最佳的分离，而对强极性或离子型样品有时会发生不可逆吸附，分离效果欠佳。液液色谱固定相亦称为固定液，指的是在很细惰性载体或硅胶上表面涂渍不同的极性固定液。它利用各组分在固定液中的分配系数不同而达到分离的效果。由于可涂渍的固定液的种类繁多，因此分离范围很广，能有效分离极性和非极性化合物、离子型和非离子型化合物、水溶性和油溶性化合物等。但随着使用时间的增加，固定液会在流动相中产生微量的溶解，从而会有一定的损失。化学键合固定相适用于将固定相共价结合在载体颗粒上，能有效分配色谱中由于固定相在流动中有微量溶解，及流动相通过色谱柱时的机械冲击，固定相不断损失，色谱柱的性质逐渐改变等缺点。化学键合固定相几乎对各种类型的有机化合物都呈现良好的选择性，至今已经逐渐取代液液分配色谱法35。考虑到磺酰脲类除草剂具有强极性、低挥发性以及热不稳定性的特点，本实验的色谱柱固定相为C18的不锈钢柱（250mm4.6mm)。2.2.2 最佳检测波长的选择将待测的几种磺酰脲类除草剂甲醇溶液在200400nm的波长范围内进行扫描，其吸收光谱如（图2.1）所示。图2.1 待测磺酰脲类除草剂甲醇溶液的紫外吸收光谱图Fig.2.1 Ultraviolet-visible absorption spectra of the sulfonylurea herbicides由图可以看出，几种化合物的最大吸收峰在220250nm范围内。吸收面积虽检测波长的增加而减少，当检测波长较小时，虽然峰面积很大，但是杂质和溶剂也有很多的吸收，样品、溶剂和杂质等分开不完全；而检测波长较大时，杂质的干扰会少，但是同样浓度下响应值过小而达到残留分析要求。本实验研究选择235nm作为检测波长，在该波长处样品响应值高，杂质干扰较小，符合农药残留分析的基本要求。2.2.3 流动相的选择 一般来说，流动相的有机相是甲醇或乙腈，以甲醇和水或乙腈和水为流动相进行考察分离度。结果显示它们的分离度都可达农药残留分析基本要求。但乙腈毒性大，成本高，因此使用毒性较小，成本较低的甲醇。此外，磺酰脲类除草剂呈弱酸性，流动相需进行酸化。实验条件探索过程中，分别考察了流动相为甲醇和水、甲醇和水（水用磷酸调节PH=3）、甲醇和水（水用磷酸调节PH=2）的分离效果。结果表明，流动相为甲醇和水时，目标物色谱峰不能分离，流动相为甲醇和水（水用磷酸调节PH=3）时，分离效果较好，目标物色谱峰型达到理想状态。这是因为磺酰脲类除草剂的弱酸性，当流动相为弱酸性时可抑制待测组分的解离，各组分更好地保留在固定相，同时改善色谱峰型36。但当磷酸浓度较大时，基线不稳，而且会缩短色谱柱的寿命。因此，本实验选用的流动相为甲醇和水（水用磷酸调节PH=3）。2.2.4 流动相比例的选择甲醇是极性溶剂，若甲醇比例过高，则出峰过早，保留时间太小；若甲醇比例过高，则出峰过晚，保留时间太大。为此，我们进行了一系列的实验，以选择最佳的流动相比例。考察项目流动相甲醇与水的比例（V:V）55:4560:4065:35保留时间（min）氯嘧磺隆（A）18.89（太久）11.678.78（峰型好）新型除草剂（D）14.43（峰太宽）10.14（较好）9.38（峰型好）新型除草剂（E）9.82（峰分开较好）9.794.91（峰型不好）由上表可知，甲醇与水的比例在65:35时，氯嘧磺隆（A）和新型除草剂（D）的色谱峰型好，且保留时间分别为8.78min、9.38min ;甲醇与水的的比例在55:45时，新型除草剂（E）的色谱峰分开较好，保留时间为9.82min。三者的保留时间都在8min以上，能有效地区分保留时间较小的杂质峰。综上所述，本实验选择（65:35）的甲醇与水作为供试除草剂A、D的流动相比例；选择（55:45）的甲醇与水作为供试除草剂E的流动相比例。2.2.5 流速的选择实验条件探索过程中，分别考察了0.5mL/min、1.0mL/min、1.5mL/min时色谱峰的分离情况。结果显示，流速较小时，分离度增大，保留时间延长；流速较大时，出峰时间提前，分离度增大。因此，本实验选用的流速为1.0mL/min。第三章 实验方法和步骤3.1.1 实验原料与试剂表3.1 原料与试剂Table 3.1 Raw materials and reagents名称规格生产商氯嘧磺隆-Aladdin新型除草剂-自主研发甲醇色谱级（99.9%）Aladdin乙腈色谱级（99.9%）Aladdin乙酸钠AR（99.0%）Aladdin冰乙酸优级纯（99.8%）天津津科精细化工厂磷酸AR天津富宇精细化工有限公司3.1.2 主要设备与仪器表3.2 实验仪器Table 3.2 The experimentalinstruments名称规格生产商高效液相色谱仪（HPLC）Agilent 1100安捷伦科技有限公司100L进样针100L安捷伦科技有限公司紫外分光光度计UV-2501PC岛津公司电子分析天平BSA224S-CW赛多利斯科学仪器有限公司精密PH计FE20-FiveEasy PlusMettler Toledo真空干燥箱WGL-125B天津木泰斯特仪器有限公司恒温箱-上海浦东荣丰科学仪器有限公司超声仪KQ3200B昆山市超声仪器有限公司干燥箱BSA224S-CW赛多利斯科学仪器有限公司电冰箱BCD86(ME)合肥美的荣事达电冰箱有限公司3.2实验研究对象代号化合物结构化合物名称A 氯嘧磺隆B3-(4,6-二甲氧基嘧啶-2-基)-1-(2-甲氧羰基-4-氨基苯基)C3-(4,6-二甲氧基嘧啶-2-基)-1-(2-甲氧羰基-4-硝基苯基)D3-(4-氯-6-甲氧基嘧啶-2-基)-1-(2-甲氧羰基-4-硝基苯基)E3-(4-氯-6-甲氧基嘧啶-2-基)-1-(2-甲氧羰基-4-氨基苯基)3.3 液相色谱测定条件（1）色谱柱：C18不锈钢柱（250mm4.6mm）（2）检测波长： 235nm（3）流动相：甲醇/水（磷酸调节PH=3.00）（4）进样量：20L（5）流速：1.0mL/min（6）柱温：30 3.4 缓冲溶液的配制 （1）将干净的烧杯置于分析天平上，归零，准确称取16.4g乙酸钠，加入适量的超纯水，用玻璃棒搅拌溶解，后置于超声仪中超声，充分溶解后，定容至1000mL容量瓶。 （2）将干净的烧杯置于分析天平上，归零，准确称取6g冰乙酸，加入适量的超纯水，后置于超声仪中超声，充分溶解后，定容至500mL容量瓶。 （3）混合乙酸钠溶液和乙酸溶液（84:36），用精密PH计调节pH=5.00（0.02）制得PH=5.00的缓冲溶液，密封保存，待用。 3.5 标准工作曲线的制备 （1） 准确称取20mg试验样品（精确至0.0001g）于烧杯中，加入30-50mL乙腈，用玻璃棒搅拌溶解，后置于超声仪中超声充分溶解，用乙腈定容至100mL容量瓶,制得标准母液。 （2） 用移液管依次准确量取1.0、2.0、3.0、4.0、5.0mL母液，置于100mL容量瓶中，用配制好的PH=5.00的缓冲溶液定容，制得浓度依次为2、4、6、8、10(mg/L)的标准溶液。 （3） 以上的标准溶液，在给定的色谱条件下进样检测，以试样色谱峰面积对浓度进行回归分析，作图得到标准曲线。3.6样品的水解动力学测试 （1） 分别用4.5m的微孔滤膜过滤浓度为8mg/L、10mg/L的溶液做样品溶液，测定它们的起始浓度。（2） 将样品溶液置于恒温箱中25下避光保存（排除化合物发生光化学分解对测定结果的影响），每隔一段时间，测定样品溶液的残留量，每次重复测定23次取其平均值。（3） 根据标准曲线，以及样品溶液的色谱峰面积，即可计算不同时间下的样品残留量，以残留量对取样时间作图，得到水解特性曲线，可计算化合物在pH=5.00的缓冲溶液下的水解半衰期。3.7 定性定量方法按供试化合物的保留时间及吸收峰图定性，外标峰面积法进行定量。残留量的计算公式为：R=S样C标V终S标WR：样品中农药残留量（mg/kg）； S样：注入样品溶液的峰面积； C标：标准溶液浓度（mg/L）； V终：样品溶液最终定容体积（mL）； S标：注入标准溶液的峰面积； W：样品重量（g）。第四章 实验数据记录、结果与讨论4.1 实验数据记录4.1.1 （A）、(D)、（E）在不同浓度下的峰面积将氯嘧磺隆（A）和供试磺酰脲类除草剂(D)和（E）稀释成一定浓度梯度的溶液，在3.3所述的色谱条件下注入样品测定，以峰面积定量，不同浓度下的峰面积分别如表所示。表4.1氯嘧磺隆在不同浓度下的峰面积Table.4.1 The peak area of chlorimuron ethyl at different concentrations化合物名称氯嘧磺隆(A)浓度（mg/L）246810峰面积（mVs）115.3205.0315.9421.9547.7111.7212.5324.9435.8535.2平均值（mVs）113.5208.75320.4428.85541.45表4.2 供试除草剂D在不同浓度下的峰面积Table.4.2 The peak area of the tested herbicide D at different concentrations化合物名称3-(4-氯-6-甲氧基嘧啶-2-基)-1-(2-甲氧羰基-4-硝基苯基) （D）浓度（mg/L）246810峰面积（mVs）94.5202.9327.0434.2548.496.4206.7332.3436.5548.3平均值（mVs）95.45204.8329.65435.35548.35表4.3 供试除草剂E在不同浓度下的峰面积Table.4.2 The peak area of the tested herbicide E at different concentrations化合物名称3-(4-氯-6-甲氧基嘧啶-2-基)-1-(2-甲氧羰基-4-氨基苯基) （E）浓度（mg/L）246810峰面积（mVs）72.4166.7258.2357.3438.872.5176.0250.2360.1437.1平均值（mVs）72.45171.35254.2358.7437.954.1.2 （A）、(D)、（E）样品溶液的残留量选择浓度为10mg/L、8mg/L的供试除草剂（A）、（D）、(E)溶液作为样品溶液,分别记做A10、A8，D10、D8，E10、E8。将样品溶液置于恒温箱中25下避光保存（排除化合物发生光化学分解对测定结果的影响），每隔一段时间，测定样品溶液的残留量，每次重复测定23次取其平均值样品供试除草剂的残留量随着时间的递增逐渐水解而降低。表4.4 除草剂A的残留量与时间的关系The relationship between theresidu