生物工程下游技术复习重点.doc

本文档系作者精心整理编辑，实用价值高。生物工程下游技术复习重点名词解释部分生物工程下游技术：各种生物工业生产过程获得的生物原料，经过提取、分离、加工、精制等方法得到其目的成分，最终制得产品。批式培养：指的是营养物质和菌种一次性加入反应器进行培养，直到结束才放出，期间除了空气进入和尾气排出，与外界无其他物料交换。生物反应器的放大：是以中试反应设备的实验数据为依据，设计制造大规模反应系统以进行工业化规模生产。动物细胞培养：所谓动物细胞培养是将动物组织或细胞从机体取出，分散成单个细胞，给予必要的生长条件，模拟体内生长环境，使其在体外继续生长和繁殖。固定化培养：是将动物细胞与水不溶性载体结合起来，再进行培养。吸附：指用固体吸附剂将细胞吸附在其表面而使细胞固定化的方法。共价贴附：利用共价键将动物细胞与 结合的固定化方法 离子/共价交联法：如果对细胞用交联剂处理，则在细胞之间形成交联桥，使之絮结。包埋法：将细胞包埋在多孔载体内部制成固定化细胞的方法半连续式培养：在细胞增长和产物形成过程中，每间隔一段时间，从中取出部分培养物，再用新的培养液补足到原有体积，使反应器内的总体积不变。灌注式培养：把细胞和培养基一起加入反应器后，在细胞增长和产物形成过程中，不断地将部分条件培养基取出，同时又连续不断地灌注新的培养基微载体：指直径60-250微米，能适用于贴壁细胞生长的微珠吸附平衡：溶液中的溶质被吸附剂表面俘获的同时，一部分被吸附的溶质会脱离吸附剂回到溶液，即解吸附，当吸附的速率与解吸附的速率达到相等时，吸附剂上的溶质量不再改变即为吸附平衡。基线：在实验条件下，色谱柱后仅有纯流动相进入检测器时流出的曲线成为基线。保留时间：试样从进样到出现峰极大值时的时间，它包括组分随流动相通过柱子的时间t0和组分在固定相中滞留的时间调整保留时间：某组分的保留时间扣除死时间后的保留时间，它是组分在固定相中的滞留时间。死体积：色谱柱管内固定相颗粒间空隙、色谱仪管路和连接头间空隙和检测器间隙的综合。保留体积：指从进样到待测物在柱后出现浓度极大点时所通过的流动相的体积。调整保留体积：某组分的保留体积扣除死体积后的体积。蛋白质复性：包涵体蛋白质溶解于变性剂溶液中，呈变性状态，所有的氢键、疏水键全部被破坏，疏水侧链完全暴露，但一级结构和共价键不被破坏，当除去变性剂后，一部分蛋白质可以自动折叠成具有活性的正确构型，这一折叠过程称为蛋白质复性。膜：在流体相之间有一层薄的凝聚相物质，把流体相分隔开来成为两部分，这一薄层物质称为膜。截流曲线：测定分子量不同的球形蛋白质或水溶性聚合物的截留率，所得到的膜的截留率与溶质分子量之间关系的曲线。全交换容量：每克干介质或每毫升湿介质具有的功能基含量工作容量：每克干介质或每毫升湿介质在一定的操作条件下的交换吸附蛋白质的实际容量。电泳：指带电粒子在电场的作用下，向着与其电性相反的电极移动的现象2.填空题（1）细胞生长所需条件为（）和（）。良好的物理环境和合适的化学环境（2）细胞生长是一个（）、（）、（）的体系。多相，多组分，非线性（3）生物反应器的类型按其结构可分为（）和（）。按操作方式可分为（）、（）和（）。机械搅拌发酵罐和气升式发酵罐；批式、连续、半连续（4）机械搅拌发酵罐主要有（）、（）、（）、（）、（）、（）、（）等七个部分组成。壳体、控温部分、搅拌部分、进气孔、进料口、监测系统、附属系统（5）机械搅拌发酵罐和气升式发酵罐的主要分别是其（）和（）不同。结构和混合方式（6）生物反应器放大的核心问题是（），放大的目的是（）。传质过程、维持中试所得到的最佳细胞生长速率，产物的生成速率。（7）生物反应过程参数检测方法可分为（）和（）。在线监测和离线检测（8）动物细胞培养有三种类型，分别是（）、（）和（）。贴壁培养、悬浮培养和固定化培养（9）细胞贴壁的步骤是（）、（）、（）、（）。贴壁因子吸附于培养表面、细胞与表面接触、细胞贴壁于培养表面、贴壁细胞在培养表面上扩展。（10）常用的细胞固定化方法主要有（）、（）、（）、（）和（）。吸附、共价贴附、离子/共价交联、包埋和微囊化（11）无论是贴壁细胞还是悬浮细胞，就操作方式而言，深层培养可分为（）、（）、（）、（）和（）。分批式、流加式、半连续式、连续式和灌注式（12）流加式操作的总体原则是维持细胞生长相对稳定的培养环境，营养成分既不（）也不（）。过剩、缺乏（13）动物细胞培养时培养基中需添加血清，血清的主要作用是（）和（）。提供营养、对细胞有一定的保护作用。（14）色谱技术按照其分离机理可分为（）、（）、（）和（）。吸附色谱、分配色谱、离子交换色谱和凝胶过滤色谱（15）色谱技术按照固定相形状可分为（）、（）和（）。纸色谱、柱色谱和薄层色谱（16）生物反应器按其细胞培养的方式不同，可分为（）、（）和（）。悬浮培养用反应器、贴壁培养用反应器和包埋培养用反应器。（17）细胞在微载体表面的（）和（）是细胞生长的关键。贴附和铺展（18）贴壁细胞在微载体表面上增殖，要经历（）、（）和（）三个阶段。粘附贴壁，生长，扩展成单层（19）细胞能否在微载体表面贴附，一是取决于（），二是取决于（）。细胞与微载体接触的几率，细胞与微载体的相容性（20）控制细胞贴壁的速度的基本因素是（），而不是（）。微载体表面的电荷密度，表面极性。（21）色谱技术按照其操作压力可分为（）、（）和（）。压力分别是（）、（）、（）。低压色谱、中压色谱和高压色谱；小于0.5兆帕，0.5-5兆帕，5-50兆帕（22）色谱技术按照分离时一次进样量的多少可分为（）、（）、（）和（）。一次进样量分别是（）、（）、（）、（）。分析色谱、半制备色谱、制备色谱和工业生产规模色谱；小于10mg，10-50mg，1-10g，大于20g每天。（23）分配色谱由（）、（）和（）构成，其中（）为惰性物质，优先吸附（）而对（）无吸附能力。载体、附着在载体表面的固定相和流动相；载体；固定相、溶质（24）专门用于纯化生物大分子的色谱分离技术是（），它是基于固定相的（）与生物分子间的（）的不同来进行相互分离的。亲和色谱；配基；特殊生物亲和力（25）柱色谱的装置由（）、（）和（）构成。进样及流动相供给装置，色谱柱，检测器与流分收集器（26）柱色谱展开操作可分为（）、（）和（）。洗脱展开、前沿分析、置换展开（27）离心沉降法是根据固体与液体之间的（），利用离心机提供的（）实现固液分离。密度差、离心力（28）衡量离心力大小的主要指标是（）。分离因数（29）微孔膜过滤是根据流体各组分（）的不同，利用（），过滤分离微米级的（）、（）和（）的过程。尺寸大小、高分子聚合膜、细胞、细胞碎片、生物大分子（30）膜的用途有（）、（）、（）和（）。浓缩、纯化、分离、反应促进（31）防止或减轻膜污染 措施有（）、（）和（）。对料液进行预处理，对对膜进行预处理，改变操作条件（32）凝胶过滤的用途有（）、（）和（）。分组分离、分级分离、分子量测定（33）常用的离子交换剂有（）和（）两种类型。通用型离子交换树脂功能基，生化专用离子交换介质（34）在电泳技术中，表面活性剂（SDS等）强烈破坏蛋白质分子间的（），使蛋白质分子为表面溶剂分子所包围，阻止了（），同时消除了不同蛋白质固有的（）。非共价作用，蛋白质之间的相互作用，电荷差异。（35）控制电泳介质的有效黏度，包括（）和（）。选择适当的凝胶孔径；添加能增加介质黏度的物质。（36）在电泳技术中，指示剂前沿呈两边向上的曲线形，称为（）现象，这说明凝胶的（）。如果指示剂前沿呈现两边向下的曲线形，称为（）现象。此现象常常是由于（）引起的。微笑、不均匀冷却、皱眉、垂直电泳时电泳槽的装置不合适3.简答题部分（1）简述机械搅拌发酵罐的优缺点答：优点：适应性好，从小型到中型、大型的细胞培养过程都可以用，放大容易其缺点：罐内的接卸搅拌剪切力容易损伤细胞，造成细胞培养过程的减产。（2）动物细胞无细胞壁，比较娇嫩，所以对培养的要求更高一些。在设计动物细胞培养的装置时需注意考虑哪些方面？答。1.降低电搅拌造成的机械剪切力 2.在通气时要防止气泡与细胞接触，因为气泡可损伤细胞 3.在进行ph调整时避免化学环境的剧变，不能直接加入酸碱，对细胞造成损伤，应通过改变co2,o2,n2的比例进行调整。（3）请简述生物反应器在线监测的过程。答：将能够感应检测参数变化的传感器直接放到生物反应器中的测量点上，传感器将测量点的待测参数变化转化为电信号，经放大，送到显示系统和控制单元。（4）简述能够在生物反应器上有效使用的传感器应满足的条件。答： （1）反应灵敏快速。（2）传感器结构应简单整洁，不能有清洗死角以免带菌产生污染。（3）传感器应当有很高的可靠性和长时间的稳定性。（4）传感器应当能够耐受消毒蒸汽的温度和压力。（5）简述流加式培养的操作方法：答：细胞初始接种的培养基体积一般为终体积的1/2-1/3，在培养过程中根据细胞对营养物质的不断消耗和需求，流加浓缩的营养物或培养基，通常在细胞进入衰退期或衰退期后进行终止回收整个反应体系，分离细胞和细胞碎片，浓缩、纯化目标蛋白。（6）简述无血清动物细胞培养技术研究成为了热点的原因有哪些？（1） 答：血清中除营养因子外，还有其他多种复杂的成分，对其作用尚未作出充分确定（2） 血清的存在对产物纯化形成主要障碍，甚至使产物难以成为药物产品（3） 血清中常污染有病毒，虽然有的细胞培养看不出明显影响，但毕竟增加了未知因素，使操作者无法控制 （4）可降低成本。（7）简述优良的微载体应具备的特性1） 答：不含能毒害细胞的成分2） 微载体须与细胞有良好的相容性目的是让细胞更容易贴壁3） 密度应略大于培养基：轻度搅拌微载体能悬浮在培养基中，停止搅拌又能较快地沉降下来-容易分离。一般要求在1.03-1.05之间，最大不宜超过1.1。4） 干态的微载体粒径在40-120微米范围，生理盐水溶胀后增大到60-250微米，粒度分布地均匀，径差不大于20-25微米，表面光滑以利于细胞铺展。5） 良好的光学透明性，便于显微镜观察细胞生长情况。6） 能在PBS中耐120-125，20-30min高温灭菌7） 基质应是非刚性材料：避免在培养过程中相互碰撞而损伤细胞。8） 不吸收培养基中的营养成分，特别是血清。9） 收获细胞或细胞制品容易，不影响蛋白质分离纯化10） 价廉，能重复使用。（8）简述制备动物细胞微囊化的简单过程。答：动物细胞与海藻酸溶液混合搅拌，经过微囊发生器将微球滴入氯化钙溶液中，形成凝胶，然后再用聚赖氨酸处理，使微球表面成膜，最后用柠檬酸处理去除球内的钙离子，以便球内的海藻酸成液态，动物细胞得以悬浮在其中。（9）请简述色谱分离的基本原理。答：使用外力使含有样品的流动相（气体、液体或超临界流体）通过一固定于柱或平板上，与流动相互不相容的固定相表面。由于处于柱起始端样品中各组分与两相（固定相与流动相）的作用程度不同，因此，与固定相作用强的组分随流动相流出的速度较慢，而与固定相作用弱得组分随流动相流出的速度较快。由于流出的速度的差异，使得混合组分最终形成各个单组份的“”带其或“区”，从而达到分离的目的。（10）简述色谱分离的基本特点。答：（1）分离效率高 （2）应用范围广 （3）操作参数多 （4）高灵敏度在线监测 （5）快速分离 （6）过程自动化操作（11）请简述亲和色谱的基本过程答：把具有特异亲和力的一对分子的任何一方作为配基，在不伤害其生物功能情况下，与不溶性载体结合，使之固定化，装入色谱柱，然后把含有目的物质的混合液作为流动相，在有利于固定相配基和目的物质形成络合物的条件下进入色谱柱。目的物质被吸附，杂质直接流出。变换过柱溶液，使配基与其亲和物分离，获纯化的目的产物。（12）非线性色谱与线性色谱中样品色谱行为的根本不同表现在哪些方面。书中第八章有答案。（13）产物提纯过程分为哪两个阶段？每个阶段的目的都是什么？答：初级分离：分离细胞和培养液，破碎细胞释放产物，溶解包涵体，复原蛋白质，浓缩产物，去除大部分杂质等。主要决定产物的得率纯化精制：在初级分离的基础上，用各种高选择性手段，主要是各种层析技术，将目标产物和干扰杂质尽可能分开，使产物的纯度达到有关要求。主要决定产物的纯度（14）请简述化学渗透法的作用机理，并说明与机械破碎法相比有哪些优缺点。答：作用机理：某些有机溶剂，抗生素，表面活性剂，金属螯合剂，变性剂等化学药品都可以改变细胞壁或膜的通透性，从而使内容物有选择地渗透出来，这种处理方法叫渗透法。优点（相对机械破碎）对产物释放有一定选择性，如可以释放分子量小的，分子量大的（如核酸）阻滞在胞内，又如可以释放不同部位，核酸释放量少，粘度低，便于进一步提取。细胞外形保持完整，碎片少，利于进一步分离 缺陷 时间长，效率低。 化学试剂具有毒性，对产物有毒害作用通用性差，某种试剂只能用于某些特定的细胞。（15）简述微波加热法破碎细胞的作用机理。答：微波加热导致细胞内极性物质，尤其是水分子吸收微波能产生大量热量，使胞内温度迅速上升，液态水汽化产生的压力将细胞膜和细胞壁冲裂，形成微小孔洞，进一步加热可导致细胞内部和细胞壁水分减少，细胞收缩，表面出现裂纹。（16）减少包涵体的形成，都有哪些策略。答：1)降低重组菌的生长温度：2)添加可促进重组蛋白质可溶性表达的生长添加剂3)供给丰富的培养基，创造最佳培养条件如供氧，ph等。（17）简述膜过滤操作的优缺点。答：优点： 容易做到封闭式操作，不受环境污染 设备投资少，操作安全； 加工量可大可小，十分方便； 有利于分离密度差小而难以离心的固体，可直接用于下游的层析过程。 缺点： 技术难以掌握，影响因素多； 稳定性和重复性不好； 膜堵塞问题难以解决！（18）膜材料的基本要求有哪些？答：（1）耐压：（2）耐高温:（3）耐酸碱（4）化学相容性：（6）成本低。（5）生物相容性：（19）生化用离子交换剂的特点有哪些？答：1、具有亲水性及生物相容性2、孔结构主要有3种：凝胶孔（溶胀时孔变大）、大孔树脂（孔在干、湿态都存在）和琼脂糖介质的孔（孔径大小与琼脂糖浓度有关）。3、电荷密度：电荷密度要适当。4、粒度：粒径小，分布均匀则分离效果好。5、纯度有四个等级，分别是分工业级，分析级，生物技术级，分子生物级。（20）简述电泳过程发热会造成哪些后果？应如何解决？答：电泳过程发热会造成蛋白质变性，蛋白质区带扩散，分辨率下降对策：1）减少发热：降低电流，提高电压；提高传热表面积；提高材质的传热系数；提高冷却系统的温差2）减少扩散：增加缓冲系统或介质的黏度可以减少扩散；在微重力作用下进行电泳；4.论述题部分（1）生物反应器的主要控制参数有哪些？如何进行控制的？1） 答：温度的控制：温度是影响发酵过程的一个重要参数，不仅因为生物本身对温度敏感，而且生物生长和产物合成的所必需的酶在一定的温度下才能发挥较高的活性。温度控制器使用温度探头感应反应器内的温度，当温度大于设定值时，将电加热器关闭，通入的冷水很快使温度降低。当温度低于设定值时，控制仪打开电加热器，使温度升高。控制仪使用开、关控制的办法，配合冷水将温度控制在一定范围。2） 溶氧的控制：溶氧的浓度取决于氧气进入培养液的速度和生物消耗氧气的速度，如果前者大于后者，氧气浓度增加，否则降低，而在这两者中，我们能够控制的只有氧气进入培养液的速度。氧气进入培养液的速度取决于四个因素：搅拌速度、鼓入的空气速度、鼓入的气体中氧气的含量和反应器内氧气的分压。增加氧气的浓度和增加反应器内氧气的分压具有类似的效果，都能够提高氧气进入液相的推动力。3） pH的控制：有效的pH对于工艺过程的成功非常重要。pH的控制依靠向反应器内滴加酸或碱溶液完成（当然是对于微生物而言）。当pH探头测得反应器内pH高于设定值时，pH放大控制仪向酸泵发出信号滴加酸溶液，否则，向碱泵发出信号滴加碱溶液。（2） 论述常用的固定化方法主要有哪些？它们都有哪些优缺点？答：常用的细胞固定化的方法主要有吸附、共价贴附、离子/共价交联、包埋和微囊化。吸附：定义：是指用固体吸附剂将细胞吸附在其表面而使细胞固定化的方法。优点：操作简便、条件温和，是动物细胞固定化中最早研究使用的方法。 缺点：载体的负荷能力低，细胞容易脱落，由于细胞吸附于支持物表面，因此容易受到机械剪切力的作用。共价贴附定义：利用共价键将动物细胞与 结合的固定化方法 优点：此法可减少细胞的泄露，缺点：须引入化学试剂，对细胞活性有影响，且因贴附而导致扩散限制小，细胞得不到保护。离子/共价交联法 定义：如果对细胞用交联剂处理，则在细胞之间形成交联桥，使之絮结。缺点：交联试剂会使一些细胞死亡，也会产生扩散限制。包埋法定义：将细胞包埋在多孔载体内部制成固定化细胞的方法优点：步骤简单，条件温和，负荷量大，细胞泄露少，抗机械剪切缺点：扩散限制，并非所有细胞都处于最佳基质浓度，且大分子机制不能渗透到高聚物网格内部。一般适用于非贴壁依赖性细胞的固定化。微囊法 是用一层亲水的半透膜将细胞包围在珠状的微囊里，细胞不能逸出，但小分子物质及营养物质可自由出入半透膜；囊内是种微小培养环境，与液体培养相似，能保护细胞少受损伤，故细胞生长好，密度高。（3） 请举两个机械破碎细胞的方法，并从设备、作用机理、温控、优缺点等方面进行比较。1） 答：高压匀浆法（1）设备：高压匀浆器：由高压泵和匀浆阀组成。（2）作用机理：高压泵将电机的旋转运动转变成匀浆阀柱杆的直线运动，从高压室（几十兆帕）压出细胞悬浮液，经过碰撞环的撞击后改变方向从出口管喷出，使细胞经历较高的流速下的剪切碰撞发生较大的变形，从而达到破碎细胞的目的。也就是细胞经历了高流速下的剪切、碰撞、高压到常压。细胞悬浮也经历一次高压匀浆后。只有一部分细胞破碎，不能达到100%的细胞破碎率。（3）温控和能耗如何控制浓度：匀浆过程中产生的热会导致蛋白质和酶的失活。温度在35以下，失活问题可以忽略。因此低温操作是必须的。高压匀浆一般需多级操作，每次循环前往往进行级间冷却能耗：能耗主要来自提供动力（如压力）消耗的能量和控制低温操作耗费的能量。提高压力可以增加细胞的破碎率，但是同时增加了能耗。将破碎过程中产生的热量移走也需要付出代价。（4）存在的问题不适合团块状或丝状真菌（导致堵塞）以及较小的革兰氏阳性菌， 质地坚硬者如包涵体易损伤匀浆阀，也不适用（但是也有很多人在实验室中用此方法来研究含有包涵体的大肠杆菌的破碎。） 温度高易失活，能耗大 一次操作不能达到100%的细胞破碎率。因此需一次操作后回收破碎液进行第二次，第三次或更多次。2） 高速珠磨法（1）设备：珠磨机（2）作用机理：细胞和级细的研磨剂（一般为无铅玻璃珠）在搅拌桨作用下充分混合，珠子之间及珠子与细胞之间相互剪切、碰撞，促使细胞壁破裂，释放内含物。在珠液分离器的协助下，珠子滞留在破碎室内，浆液流出。从而实现连续操作。（3）温控和能耗：控制温度：采用夹套冷却的方式实现温控，效果较好，能耗：能耗与细胞破碎率成正比。珠磨机提高细胞破碎率需要增加装珠量或延长破碎时间或提高转速。这些操作不仅导致电能消耗的增加，而且产生了较多的热量。为了控制温度，需增加制冷费。（4）优点和缺点：优点所有细胞都适用，包涵体也可以。因为包涵体质地坚硬，可以充当研磨剂。 兼具破碎和冷却的双重功能，减少失活的可能性 适当条件下，一次操作就能达到较高的破碎率。 缺点：参数多，转速，珠子的直径和用量，细胞浓度等等。确定起来比较困难，一般凭经验估计。（4） 从细胞破碎到蛋白质复性可以走不同的工艺路线。此工艺路线主要有哪三种？分别有哪些特点？1）机械破碎（高压匀浆、高速珠磨法）-离心法提取出包涵体-加变性剂溶解-除去变性剂 此路线利用了包涵体与细胞碎片的密度差，用离心法将包涵体与细胞碎片和可溶性蛋白质分开，获得了干净的包涵体，在对包涵体溶解复性。 这样首先就摆脱了大量的杂蛋白、核酸、热原、内毒素等杂质，使后面的分离纯化简单化了。 缺点：要经过几次离心才能除去大部分细胞碎片，加工时间较长2）机械破碎-膜分离除可溶性蛋白-变性剂溶解包涵体-除变性剂复性 此路线应用了膜分离技术，用微孔膜除去可溶性蛋白质，但细胞碎片却和包涵体一起被膜挡住，难以分开；而且膜的堵塞和浓差极化常常导致可溶性蛋白质的直流，因此这条路线的问题较多。 优点：膜分离是封闭式操作，不污染环境也不受环境污染，能量消耗也比离心法少3）化学破碎（加变性剂），离心除细胞碎片-除变性剂复性。 此路线是用化学法破菌，所采用的试剂既可以破菌有可以溶解包涵体，将两道工序合为一道，节省了设备和时间，比前两者更适合于实