克隆测序要点.doc

克隆测序克隆测序就是将要测序的片段插入到克隆载体中，获取含有待测片段的质粒，然后进行测序。PCR产物为什么要克隆测序答：应该是确认-下，你所扩的条带是不是你想要的序列。因为PCR扩增中可能会有错配。 测序反应开始和结束的-些序列不够准确，所以最好将待测序克隆到载体上测序。另外用载体测效率较高，模扳量大，纯度高。 技术路线：样品的采集 基因组DNA提取与检测 引物合成与稀释 PCR 扩增、PCR产物的回收纯化、连接和转化 测序主要原理:蓝白斑筛选 蓝白斑筛选蓝白斑筛选是-种基因工程常用的重组菌筛选方法。 野生型大肠杆菌产生的-半乳糖苷酶可以将无色化合物X-gal(5-溴-4-氯-3-吲哚-D-半乳糖苷)切割成半乳糖和深蓝色的物质5-溴-4-靛蓝。有色物质可以使整个培养菌落产生颜色变化，而颜色变化是鉴定和筛选的最直观有效的方法。 设计适用于蓝白斑筛选的基因工程菌为-半乳糖苷酶缺陷型菌株。这种宿主菌的染色体基因组中编码-半乳糖苷酶的基因突变，造成其编码的-半乳糖苷酶失去正常N段-个146个氨基酸的短肽（即肽链），从而不具有生物活性，即无法作用于X-gal产生蓝色物质。用于蓝白斑筛选的载体具有-段称为lacz的基因，lacz中包括：-段-半乳糖苷酶的启动子；编码肽链的区段；-个多克隆位点(MCS)。MCS位于编码肽链的区段中，是外源DNA的选择性插入位点，但其本身不影响载体编码肽链的功能活性。虽然上述缺陷株基因组无法单独编码有活性的-半乳糖苷酶，但当菌体中含有带lacz的质粒后，质粒lacz基因编码的肽链和菌株基因组表达的端缺陷的-半乳糖苷酶突变体互补，具有与完整-半乳糖苷酶相同的作用X-gal生成蓝色物质的能力，这种现象即-互补。 操作中，添加IPTG(异丙基硫代-半乳糖苷)以激活lacz中的-半乳糖苷酶的启动子，在含有X-gal的固体平板培养基中菌落呈现蓝色。以上是携带空载体的菌株产生的表型。当外源DNA（即目的片段）与含lacz的载体连接时，会插入进MCS，使肽链读码框破坏，这种重组质粒不再表达肽链，将它导入宿主缺陷菌株则无互补作用，不产生活性-半乳糖苷酶，即不可分解培养基中的X-gal产生蓝色，培养表型即呈现白色菌落。 实验中，通常蓝白筛选是与抗性筛选-同使用的。含X-gal的平板培养基中同时含有-种或多种载体所携带抗性相对应的抗生素，这样，-次筛选可以判断出：未转化的菌不具有抗性，不生长；转化了空载体，即未重组质粒的菌，长成蓝色菌落；转化了重组质粒的菌，即目的重组菌，长成白色菌落。T-A克隆TA克隆方法（Original TA Cloning Kit）把PCR片断与-个具有3-T突出的载体DNA连接起来的方法。因为PCR反应中所适用的聚合酶具有末端转移的活性，通常在3加上A。例如：Taq聚合酶同时具有的末端连接酶的功能，PCR反应时在每条PCR扩增产物的3端自动添加-个3-A突出端。只有用经过特殊处理的具有3-T突出末端的DNA片断才能通过T/A配对进行连接。所以TA克隆不需使用含限制酶序列的引物，不需将PCR产物进行优化，不需把PCR产物做平端处理,不需在PCR扩增产物上加接头，即可直接进行克隆。 主要试验仪器PCR仪（MJ Research）；DNA/RNA浓度测定仪；多功能电泳系统；计算机凝胶成像系统；DK-98-I电子恒温水浴锅；DYY-III型水平电泳槽(北京)； JY600稳压稳流电泳仪(江苏)；微波炉，摇床；TCL16高速台式离心机(上海)；紫外分光光度仪；荧光显微镜(日本OLYMPUS)等。主要的试验试剂10、LB培养液体基：胰化蛋白陈10g，酵母提取物5g，NaCl 10g，定容至1000ml。11、LB培养固体基：液体培养基加15g琼脂/1000ml。12、X-gal-IPTG LB固体培养基：在含有氨苄青霉素的LB培养基琼脂平板上加40 lX-gal贮存液和4l IPTG溶液，用涂菌棒涂匀。13、氨苄青霉素贮存液：100mg/ml, -20保存。14、X-gal：5-溴-4-氯-3吲哚-半乳（毗喃）糖苷。用二甲基甲酞胺溶解，配制成20mg/ml的贮存液。保存在-玻璃管里，用铝箔封裹，-20保存。15、IPTG：为异丙基硫代-半乳糖苷，在8ml蒸馏水中溶解2g IPTG后，再用蒸馏水定容至10ml，过滤除菌后分装1ml的小管，-20保存。1.1菌株和质粒载体常见的菌株：EcoliJMl0常见的载体：pGEM T载体 PMD-18载体 PUCm-T载体 pMD18-T Vector(T载体) 可购自大连宝(TakaRa)生物工程有限公司.1.2 试验方法1.2.1 基因组DNA的制备与检测将裂解的冻全血加入蛋白酶K至终浓度为100g/ml，混匀，55水浴消化。在消化好的血液中加入等体积Tris饱和酚，缓慢颠倒后离心，收集上清，重复-次。于上清中加入等体积的酚和氯仿：异戊醇(24：1)混合液，缓慢颠倒后离心，收集上清液于新管，重复-次。在收集的上清液中加入1/10体积的3MNaAC(pH5.2)和2.5倍体积的冰乙醇沉淀DNA。然后用70乙醇洗涤沉淀2次。最后将DNA晾干后加入适量TE，于-20储存。用琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度法双重检测DNA的纯度和浓度，然后稀释成50 ng/L备用。1.2.2 引物合成设计原则：.引物最好在模板cDNA的保守区内设计。DNA序列的保守区是通过物种间相似序列的比较确定的。在NCBI上搜索不同物种的同一基因，通过序列分析软件（比如DNAman）比对（Alignment），各基因相同的序列就是该基因的保守区。.引物长度一般在1530碱基之间。引物长度（primerlength）常用的是18-27bp，但不应大于38，因为过长会导致其延伸温度大于74，不适于TaqDNA聚合酶进行反应。.引物GC含量在40%60%之间，Tm值最好接近72。GC含量（composition）过高或过低都不利于引发反应。上下游引物的GC含量不能相差太大。另外，上下游引物的Tm值是寡核苷酸的解链温度，即在一定盐浓度条件下，50%寡核苷酸双链解链的温度。有效启动温度，一般高于Tm值510。若按公式Tm=4（G+C）+2（A+T）估计引物的Tm值，则有效引物的Tm为5580，其Tm值最好接近72以使复性条件最佳。.引物3端要避开密码子的第3位。如扩增编码区域，引物3端不要终止于密码子的第3位，因密码子的第3位易发生简并，会影响扩增的特异性与效率。（生物学上，简并是指遗传密码子的简并性，即同一种氨基酸具有两个或更多个密码子的现象。许多氨基酸的密码子的第1和第2个碱基相同，只有第3个碱基不同。）.引物3端不能选择A，最好选择T。引物3端错配时，不同碱基引发效率存在着很大的差异，当末位的碱基为A时，即使在错配的情况下，也能有引发链的合成，而当末位链为T时，错配的引发效率大大降低，G、C错配的引发效率介于A、T之间，所以3端最好选择T。（其实都存在争议，无关紧要）.碱基要随机分布。引物序列在模板内应当没有相似性较高，尤其是3端相似性较高的序列，否则容易导致错误引发。降低引物与模板相似性的一种方法是，引物中四种碱基的分布最好是随机的，不要有聚嘌呤或聚嘧啶的存在。尤其3端不应超过3个连续的G或C，因这样会使引物在GC富集序列区错误引发。引物自身及引物之间不应存在互补序列。引物自身不应存在互补序列，否则引物自身会折叠成发夹结构（Hairpin）使引物本身复性。这种二级结构会因空间位阻而影响引物与模板的复性结合。引物自身不能有连续4个碱基的互补。两引物之间也不应具有互补性，尤其应避免3端的互补重叠以防止引物二聚体（Dimer与的形成。引物之间不能有连续4个碱基的互补。引物二聚体及发夹结构如果不可避免的话，应尽量使其G值不要过高（应小于4.5kcal/mol）。.引物5端和中间G值应该相对较高，而3端G值较低。G值是指DNA双链形成所需的自由能，G值越大，则双链越稳定。应当选用5端和中间G值相对较高，而3端G值较低（绝对值不超过9）的引物。引物3端的G值过高，容易在错配位点形成双链结构并引发DNA聚合反应。.引物的5端可以修饰，而3端不可修饰。引物的5端决定着PCR产物的长度，它对扩增特异性影响不大。因此，可以被修饰而不影响扩增的特异性。引物5端修饰包括：加酶切位点；标记生物素、荧光、地高辛、Eu3+等；引入蛋白质结合DNA序列；引入点突变、插入突变、缺失突变序列；引入启动子序列等。引物的延伸是从3端开始的，不能进行任何修饰。3端也不能有形成任何二级结构可能。.扩增产物的单链不能形成二级结构。某些引物无效的主要原因是扩增产物单链二级结构的影响，选择扩增片段时最好避开二级结构区域。用有关软件（比如RNAstructure）可以预测估计mRNA的稳定二级结构，有助于选择模板。实验表明，待扩区域自由能（G）小于58.6lkJ/mol时，扩增往往不能成功。若不能避开这一区域时，用7-deaza-2-脱氧GTP取代dGTP对扩增的成功是有帮助的。.引物应具有特异性。引物设计完成以后，应对其进行BLAST检测。如果与其它基因不具有互补性，就可以进行下一步的实验了。值得一提的是，各种模板的引物设计难度不一。有的模板本身条件比较困难，例如GC含量偏高或偏低，导致找不到各种指标都十分合适的引物；用作克隆目的的PCR，因为产物序列相对固定，引物设计的选择自由度较低。在这种情况只能退而求其次，尽量去满足条件。做RealTime时,用于SYBRGreenI法时的一对引物与一般PCR的引物,在引物设计上所要求的参数是不同的。引物设计的要求：1)避免重复碱基，尤其是G.2)Tm=58-60度。3）GC=30-80%.4)3端最后5个碱基内不能有多于2个的G或C.5)正向引物与探针离得越近越好，但不能重叠。6)PCR扩增产物长度：引物的产物大小不要太大，一般在80-250bp之间都可；80150bp最为合适（可以延长至300bp）。7)引物的退火温度要高，一般要在60度以上；引物的处理干粉状的oligo DNA引物再稀释之前，用微型离心机12000rpm离心30秒，或4000rmp 离心1min然后慢慢的打开管盖，加入适量的双蒸去离子水，使引物浓度为100M，充分振荡10min，室温溶解1h，制成引物储存液。再从引物贮存液中吸出适量稀释成10M的使用液，于-20保存备用。1.2.3 PCR 扩增体系组成成分加入量终浓度10La PCR Buffer（含Mg2+）5l1dNTP（10mM）4l800uMPermierI（10M）2l0.4 uMPermierII（10M）2l0.4 uMLa Taq（5u/l）0.5l模板DNA1lDDH2Oup to 50l PCR扩增程序：94 预变性3 min；94 变性30 s，63 退火1 min，72 延伸90 s，30个循环；最后72总延伸5 min，4保存。电泳及观察分析取5uL扩增产物于1.2琼脂糖凝胶上120 V电泳30 min，经溴乙锭染色后在U、 凝胶成像系统上观察并记录结果。1.3 质粒的提取1）接种单菌落于3ml含Amp的LB培养基中，37剧烈震荡过夜。2）取过夜培养物lml至1.5ml离心管中，4、12000g离心50秒。3）吸去上层培养液，使细菌沉淀干燥。4）加人100l冰预冷的溶液I，剧烈震荡使细菌细胞充分悬浮。5）加入200l新配置的溶液，盖紧管口，缓慢颠倒离心管数次，以 混合内容物。6）加入150l冰预冷的溶液，盖紧管口，将管温和地倒置数秒，使 溶液皿在粘稠的混合液中分散均匀，冰上放置35分钟。7）用离心机4、12000g离心10分钟，将上清转移到另-离心管中。8）加入等体积的酚：氯仿，震荡混匀，4 12000g离心5分钟，将上清转移到另-离心管中。9）加入等体积的氯仿震荡混匀，4 12000g离心5分钟，将上清转移到另-离心管中。10）加入1/10体积的 3M NaAC（PH=5.2）和两倍体积的乙醇于室温沉淀 双链DNA震荡混匀后于-20放置30分钟。11）4、 2000g离心10分钟。12）小心弃上清液，将离心管倒置于-张纸巾上使液体流失干狰。13）加入lml70的乙醇于4洗涤双链DNA沉淀，除去上清，干燥DNA，用20 l不含DNA酶的TE重新溶解核酸，混匀贮存于-20。1.4 PCR产物的回收纯化、连接和转化将PCR产物按照X.Gene小量胶回收试剂盒说明书进行回收纯化后，与PMD18-T载体充分混匀，在恒温金属浴中16连接20 h，再将连接产物加入到Ecoli JM109感受态细胞中，涂布于含有XGal底物、IPTG诱导物和Amp 的固体LB平板上，放入37恒温培养箱中培养过夜(1216 h)，利用蓝白斑遗传学筛选法筛选阳性克隆。重组质粒的提取及酶切鉴定重组质粒的提取参照分子克隆实验指南中的方法进行。将重组质粒用Kpn I限制性内切酶在37酶切4 h，琼脂糖凝胶电泳检测。1.5 DH5感受态细胞的制备1） 受体菌的培养制备新的大肠杆菌（E.coli）DH5菌落平板；从LB平板上挑出新活化的E.coli DH5单菌落，接种于100ml LB培养基中，37培养3小时左右，至OD600=0.5左右。2）感受态细胞的制备将培养液转入10ml离心管中，冰上放置10分钟；于4下4000g离心10分钟；弃去上清液，用预冷的0.1mol/L的CaCl2溶液10ml轻轻悬浮细胞，冰上放置15-30分钟；4下4000g离心10分钟；弃去上清液，加入4ml预冷的含15%甘油的0.05mol/L的CaCl2溶液，轻轻悬浮细胞，冰上放置数分钟，即成感受态细胞悬液；感受态细胞分装成200l的小份，贮存于-70备