毕业设计（论文）-急性髓系白血病PMLRARA融合基因芯片检测方法的研究.doc

北京师范大学珠海分校本科生毕业论文论文题目：急性髓系白血病PML/RARA融合基因芯片检测方法的研究学 院 工程技术学院 专 业 生物技术专业 学 号 学 生 姓 名 指导教师姓名 指导教师职称 副教授 指导教师单位 北师大珠海分校工程技术学院 200 年 月 日北京师范大学珠海分校学位论文写作声明和使用授权说明学位论文写作声明本人郑重声明： 所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独立进行研究工作所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本论文不含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的作品或成果。对本文的研究做出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本声明的法律结果由本人承担。 论文作者签名： 日期： 年 月 日学位论文使用授权说明本人完全了解北京师范大学珠海分校关于收集、保存、使用学位论文的规定，即：按照学校要求提交学位论文的印刷本和电子版本；学校有权保存学位论文的印刷本和电子版，并提供目录检索与阅览服务；学校可以采用影印、缩印、数字化或其它复制手段保存论文；在不以赢利为目的的前提下，学校可以将学位论文编入有关数据库,提供网上服务。（保密论文在解密后遵守此规定）论文作者签名： 导师签名： 日期： 年 月 日急性髓系白血病PML/RARA融合基因芯片检测方法的研究摘 要目的 本论文建立荧光实时定量聚合酶链反应（RT-PCR）方法并检测初诊急性早幼粒细胞白血病（）患者甲幼粒细胞白血病维甲酸受体（PML/RARA）融合基因含量，评价检测结果的临床意义。方法采用“欧洲抗癌计划”推荐的引物和探针建立RT-PCR方法，检测例初诊患者的PML/RARA融合基因含量，并分析其临床意义。探讨双色双融合荧光原位杂交技术(RT-PCR)在成人急性白血病(AcuteLeukemia，AL)中的应用价值。方法应用RT-PCR检测我院26例AL患者相应的AML1/ETO、MLL、PML/RARA融合基因，并与常规R-显带技术进行比较。RT-PCR技术是检测成人急性白血病PML/RARA、MLL、AML1/ETO基因重排的可靠方法，适用于AL的诊断、疗效判定及微小残留病灶的检测。急性早幼粒白血病（APL）是一种时常伴发严重出血的急性白血病PML/RARA融合基因是APL的标志性基因，在APL早期诊断和预后监测中具有重要意义目前PML/RARA融合基因检测的方法主要有染色体分析、实时定量RT-PCR等结论 RT-PCR方法敏感、可靠，可以对初诊患者进行诊断和分型。巢式RT-PCR对APL的诊断有高灵敏度和高特异性; 对APL的疗效及预后判断有重要临床意义。关键词：急性早幼粒细胞白血病;巢式RT-PCR;PML/RAR融合基因;Detection of Acute Myeloid Leukemia PML / RARA by Gene Chip MethodABSTRACTXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXxKeywords:目录第1章、文献综述和研究背景6第2章、材料与方法10第3章、结果及分析23第4章 讨论24第1章、文献综述和研究背景1.1 引言95%以上的急性早幼粒细胞白血病( acute promyelocytic leukem ia, APL)患者具有特异性染色体易位, 形成PML /RARA融合基因转录本。本研究主要针对上述最特异、常见的恶性克隆基因片段, 采用巢式RT-PCR 检测APL 患者靶融合基因转录本mRNA 的表达及动态变化, 探讨其在APL患者诊断、疗效及预后评估中的临床意义。为了研究PML/RARA融合基因检测芯片在白血病诊断、分型、治疗方案选择及预后判断中的应用价值,设计了融合基因检测探针,制成寡核苷酸芯片;采用逆转录方法、荧光标记白血病细胞cDNA 并进行杂交,以检测白血病细胞中PML/RARA基因。1.2 急性髓系白血病PML/RARA基因的研究背景急性早幼粒细胞白血病（）约占所有急性髓系白血病（）患者的。该型白血病易并发弥漫性血管内凝血，预后较为凶险。以上的患者有（；）（；），该易位使号染色体上的早幼粒细胞白血病（）基因与号染色体上的维甲酸受体（A）基因融合，形成甲幼粒细胞白血病维甲酸受体（PML/RARA）融合基因，编码PML/RARA融合蛋白，该蛋白具有不同于正常A等位基因编码的野生型A的功能，阻断了粒细胞的分化成熟，导致的发生。既往检测PML/RARA融合基因的逆转录聚合酶链反应（）无法定量，且需要行扩增后产物处理。而实时定量聚合酶链反应（）方法快速、特异、敏感度高、可定量，已经在临床上得到越来越广泛的应用。本文根据“欧洲抗癌计划”建立了 方法，对 例 初诊患者PML/RARA融合基因的表达类型及表达水平进行了检测，并探讨其临床意义。急性早幼粒细胞白血病( APL)是急性白血病的一种特殊类型,所以, APL早期诊断及早治疗至关重要。现已明确, t ( 15; 17) 是APL特征性染色体异常, 并在分子水平上导致PML/RARA融合基因形成。染色体异常广泛存在于白血病细胞中，大约50%-80% 的急性髓系白血病(AML) 患者可检出克隆性染色体畸变，其中大部分为特异性染色体易位重排，具有较强的规律性。目前研究较深入且临床意义也较肯定的有AML1/ETO 基因、PML/RARA 基因及MLL 基因，这三种基因已被WHO归为特殊类型的白血病。我们应用RT-PCR进行了PML/RARA、MLL、AML1/ETO 基因检测，并与传统R- 显带进行比较，以探讨RT-PCR 技术在APL的细胞遗传学诊断中的应用价值。实时定量RTPCR检测急性早幼粒细胞白血病PML-RARa融合基因，急性早幼粒细胞白血病（APL）具有特异性的染色体易位t（15;17）易位，使17号染色体上的RARa基因与15号染色体上PML基因融合，产生融合基因PMLRARa。 实时定量逆转录聚合酶链反应（RTPCR）技术实现了从定性到定量的飞跃，自动化程度高，因而其应用也越来越广泛。我们应用这一方法检测PML-RARa融合基因作为APL临床诊断、评估微小残留病（MRD）和判断其预后的手段。 1.3 基因芯片技术基因芯片(genechip)（又称DNA芯片、生物芯片）的原型是80年代中期提出的。基因芯片的测序原理是杂交测序方法，即通过与一组已知序列的核酸探针杂交进行核酸序列测定的方法，在一块基片表面固定了序列已知的八核苷酸的探针。当溶液中带有荧光标记的核酸序列TATGCAATCTAG，与基因芯片上对应位置的核酸探针产生互补匹配时，通过确定荧光强度最强的探针位置，获得一组序列完全互补的探针序列。据此可重组出靶核酸的序列。图1用图1来说明。在一块基片表面固定了序列已知的八核苷酸的探针。当溶液中带有荧光标记的核酸序列TATGCAATCTAG，与基因芯片上对应位置的核酸探针产生互补匹配时，通过确定荧光强度最强的探针位置，获得一组序列完全互补的探针序列。据此可重组出靶核酸的序列。基因芯片又称为DNA微阵列(DNA microarray)，可分为三种主要类型：1）固定在聚合物基片（尼龙膜，硝酸纤维膜等）表面上的核酸探针或cDNA片段，通常用同位素标记的靶基因与其杂交，通过放射显影技术进行检测。这种方法的优点是所需检测设备与目前分子生物学所用的放射显影技术相一致,相对比较成熟。但芯片上探针密度不高，样品和试剂的需求量大，定量检测存在较多问题。2）用点样法固定在玻璃板上的DNA探针阵列，通过与荧光标记的靶基因杂交进行检测。这种方法点阵密度可有较大的提高，各个探针在表面上的结合量也比较一致，但在标准化和批量化生产方面仍有不易克服的困难。3）在玻璃等硬质表面上直接合成的寡核苷酸探针阵列,与荧光标记的靶基因杂交进行检测。该方法把微电子光刻技术与DNA化学合成技术相结合，可以使基因芯片的探针密度大大提高，减少试剂的用量，实现标准化和批量化大规模生产，有着十分重要的发展潜力。它是在基因探针的基础上研制出的，所谓基因探针只是一段人工合成的碱基序列，在探针上连接一些 基因芯片可检测的物质，根据碱基互补的原理，利用基因探针到基因混合物中识别特定基因。它将大量探针分子固定于支持物上，然后与标记的样品进行杂交，通过检测杂交信号的强度及分布来进行分析。基因芯片通过应用平面微细加工技术和超分子自组装技术，把大量分子检测单元集成在一个微小的固体基片表面，可同时对大量的核酸和蛋白质等生物分子实现高效、快速、低成本的检测和分析。基因芯片技术的出现为白血病基因的检测提供了新的手段。基因芯片或称DNA 微阵列将大量特定序列的核酸片段有序地固定在载体上,再与核酸分子杂交,通过检测杂交信号的强弱来判断样品中靶分子的组成和数量。目前已广泛应用于疾病病因、发病机制、基因诊断、基因表达、基因突变和发现新基因、基因组研究、药物筛选及各种病原体的诊断等诸多生物医学领域,具有广阔的应用前景8 。本研究拟设计制备寡核苷酸芯片以检测白血病融合基因中的典型基因PML-RARA ,并对用cDNA 特异的寡核苷酸芯片的融合基因检测进行初步的方法学上的探索。1.4 研究的目的意义和技术路线在实际应用方面，生物芯片技术可广泛应用于疾病诊断和治疗、药物筛选、农作物的优育优选、司法鉴定、食品卫生监督、环境检测、国防、航天等许多领域。它将为人类认识生命的起源、遗传、发育与进化、为人类疾病的诊断、治疗和防治开辟全新的途径，为生物大分子的全新设计和药物开发中先导化合物的快速筛选和药物基因组学研究提供技术支撑平台。疾病诊断基因芯片作为一种先进的、大规模、高通量检测技术，应用于疾病的诊断，其优点有以下几个方面：一是高度的灵敏性和准确性；二是快速简便；三是可同时检测多种疾病。如应用于产前遗传性疾病检查，抽取少许羊水就可以检测出胎儿是否患有遗传性疾病，同时鉴别的疾病可以达到数十种甚至数百种，这是其他方法所无法替代的，非常有助于“优生优育”这一国策的实施。又如对病原微生物感染诊断，目前的实验室诊断技术所需的时间比较长，检查也不全面，医生往往只能根据临床经验做出诊断，降低了诊断的准确率，如果在检查中应用基因芯片技术，医生在短时间内就能知道病人是哪种病原微生物感染；而且能测定病原体是否产生耐药性、对哪种抗生素产生耐药性、对哪种抗生素敏感等等，这样医生就能有的放矢地制定科学的治疗方案；再如对具有高血压、糖尿病等疾病家族史的高危人群普查、接触毒化物质人群恶性肿瘤普查等等，如采用了基因芯片技术，立即就能得到可靠的结果，其他对心血管疾病、神经系统疾病、内分泌系统疾病、免疫性疾病、代谢性疾病等，如采用了基因芯片技术，其早期诊断率将大大提高，而误诊率会大大降低，同时有利于医生综合地了解各个系统的疾病状况。技术路线1. 先从NCBI基因库中寻找PML和RARA基因，了解各自基因染色体位置，长度，外显子等信息。2. 再利用BLAST软件，对比两个基因，寻找断裂位点，要求其与其他基因的同源性较小，以保证特异性。确保后面设计的引物包含两个基因的断裂位点，并尽量居中。3. 利用PRIMER软件设计引物，并根据引物的配对率，TM值，有无二聚体结构来对引物进行评价与筛选，并最终确定。4. 利用引物进行RT-PCR实验，对模板基因进行扩增。5. 设计基因芯片第2章、材料与方法2.1 仪器和耗材1.生物净化工作台2.低速自动平衡离心机3.PCR扩增仪4.双稳电泳仪5.台式高速离心机6.低温离心机7.快速混匀器8.凝胶成像系统9.电泳槽10.负20低温冰箱:11.37C02孵箱:12双目显微镜13.其他:构椽酸钠抗凝管、吸管、EP管等。2.2 病例和阴性对照共收集了58份PML-RARA标本，来自2008年7月2010年7月在厦门大学附属中山医院住院的病例。全部病例经过骨髓形态学和免疫分型分析，符合AML的诊断标准。染色体核型分析采用标准的G显带方法。阴性对照包括5份健康人外周血和HL-60细胞（美国ATCC）。2.3 RNA提取和逆转录采用RNAprep pure Blood Kit（北京天根生化科技有限公司产品）提取病人标本或阴性对照的总RNA，用ND-1000 UV-VIS波长紫外/可见光扫描分光光度计（Nanodrop，美国）测吸光值。对于RNA，1 OD260吸光值相当于40 ng/l，据此算出RNA浓度，另外根据OD260/OD280判断纯度。逆转录：以总RNA（1 g）为模板，采用随机引物（Toyobo，日本）和MMLV逆转录酶（生工生物工程技术服务有限公司，上海）进行逆转录，将所得到的 cDNA（20L）用ddH2O（80L）进行稀释（相当于10 ng/LRNA），冻存于-20 C 备用。2.4 引物及探针设计2.4.1 从NCBI及文献中查得PML/RARA基因DNA全序列，在GENEBANK的资料中寻找到CDS（cDNA）。并运用软件VECTOR进行全序列的查找，外显子的标识。NCBI简介：美国国立生物技术信息中心简称，在1992年10月，NCBI承担起对GenBank DNA序列数据库的责任。NCBI受过分子生物学高级训练的工作人员通过来自各个实验室递交的序列和同国际核酸序列数据库（EMBL和DDBJ）交换数据建立起数据库。同美国专利和商标局的安排使得专利的序列信息也被整合。GenBank是NIH遗传序列数据库，一个所有可以公开获得的DNA序列的注释过的收集。GenBank同日本和欧洲分子生物学实验室的DNA数据库共同构成了国际核酸序列数据库合作。这三个组织每天交换数据。GenBank以指数形式增长，核酸碱基数目大概每14个月就翻一个倍。最近，GenBank拥有来自47,000个物种的30亿个碱基。孟德尔人类遗传（OMIM），三维蛋白质结构的分子模型数据库（MMDB），唯一人类基因序列集合（UniGene），人类基因组基因图谱，分类学浏览器，同国立癌症研究所合作的癌症基因组剖析计划（CGAP）。PML基因NCBI文库截图：图2如图所示，PML基因是位于15号染色体上长度为53147bp的线性DNA。CDS截图：图3RARA基因NCBI文库截图：图4如图所示，RARA基因是位于17号染色体上长度为48473bp的线性DNA。CDS截图：图5运用VECTOR软件，对PML,RARA两个基因分别进行全系列分析，并根据NCBI提供的CDS（cDNA）的位置，在软件中予以标识。PML基因在VECTOR软件中标识出来的外显子截图：图6RARA基因在VECTOR软件中标识出来的外显子截图：图72.4.2 运用NCBI网站提供的BLAST功能对2个基因和逆转录出来的cDNA进行BLAST比对，分析其同源性，应使其保证较低水平，以保证其特异性，防止在PCR扩增过程中，引起错配，非特异性扩增等等问题。BLAST简介：BLAST是一个NCBI开发的序列相似搜索程序，还可作为鉴别基因和遗传特点的手段。BLAST能够在小于15秒的时间内对整个DNA数据库执行序列搜索。NCBI提供的附加的软件工具有：开放阅读框寻觅器（ORF Finder），电子PCR，和序列提交工具，Sequin和BankIt。所有的NCBI数据库和软件工具可以从WWW或FTP来获得。NCBI还有E-mail服务器，提供用文本搜索或序列相似搜索访问数据库一种可选方法。BLAST相似性检索BLAST(Basic Local Alignment Search Tool）是用于序列相似性检索的一个重要数据库，是区分基因和基因特征的工具。BLAST对一条或多条序列(可以是任何形式的序列)在一个或多个核酸或蛋白序列库中进行比对。BLAST还能发现具有缺口的能比对上的序列。BLAST记录的相关度有明确的统计学解释，以便更容易地将相关记录与随机的数据库记录相区分。在NCBI主页的左工具条中，点击BLAST图标，即进入BLAST主页。BLAST 主页提供了几种BLAST检索软件。BLASTN是核酸序列到核酸库中的一种查询。库中存在的每条已知序列都将同所查序列作一对一地核酸序列比对。本实验中，我们主要运用BLASTN进行核酸之间的同源性分析。PML和RARA基因的同源性色带图示图8所对比的2段基因，分别是PML和RARA图9BLAST对比的具体情况图102.4.5 根据BLAST实验所对比的情况，找出融合位点。运用PRIMER软件，进行引物设计，要求引物包含融合基因的融合位点。PRIMER PREMIER 是一种用来帮助研究人员设计最适合引物的应用软件利用它的高级引物搜索引物数据库巢式引物设计引物编辑和分析等功能可以设计出有高效扩增能力的理想引物也可以设计出用于扩增长达50kb以上的PCR产物的引物序列。引物设计有3条基本原则：首先引物与模板的序列要紧密互补，其次引物与引物之间避免形成稳定的二聚体或发夹结构，再次引物不能在模板的非目的位点引发DNA聚合反应(即错配)。1. 引物的长度一般为15-30 bp，常用的是18-27 bp，但不应大于38，因为过长会导致其延伸温度大于74，不适于Taq DNA聚合酶进行反应。2. 引物序列在模板内应当没有相似性较高，尤其是3端相似性较高的序列，否则容易导致错配。引物3端出现3个以上的连续碱基，如GGG或CCC，也会使错误引发机率增加。3. 引物3端的末位碱基对Taq酶的DNA合成效率有较大的影响。不同的末位碱基在错配位置导致不同的扩增效率，末位碱基为A的错配效率明显高于其他3个碱基，因此应当避免在引物的3端使用碱基A。另外，引物二聚体或发夹结构也可能导致PCR反应失败。5端序列对PCR影响不太大，因此常用来引进修饰位点或标记物。4. 引物序列的GC含量一般为40-60%，过高或过低都不利于引发反应。上下游引物的GC含量不能相差太大。5. 引物所对应模板位置序列的Tm值在72左右可使复性条件最佳。Tm值的计算有多种方法，如按公式Tm4(G+C)2(A+T)。6. G值是指DNA双链形成所需的自由能，该值反映了双链结构内部碱基对的相对稳定性。应当选用3端G值较低（绝对值不超过9），而5端和中间G值相对较高的引物。引物的3端的G值过高，容易在错配位点形成双链结构并引发DNA聚合反应。7. 引物二聚体及发夹结构的能值过高（超过4.5kcal/mol）易导致产生引物二聚体带，并且降低引物有效浓度而使PCR反应不能正常进行。8. 对引物的修饰一般是在5端增加酶切位点，应根据下一步实验中要插入PCR产物的载体的相应序列而确定。2.4.6 运用PRIMER软件，根据引物设计原则，进行引物设计，结果如下该图分三部分，最上面是图示PCR模板及产物位置，中间是所选的上下游引物的一些性质，最下面是四种重要指标的分析，包括发夹结构（Hairpin），二聚体（Dimer），错误引发情况（False Priming），及上下游引物之间二聚体形成情况（Cross Dimer）。当所分析的引物有这四种结构的形成可能时，按钮由NONE变成FOUND，点击该按钮，在左下角的窗口中就会出现该结构的形成情况。一对理想的引物应当不存在任何一种上述结构，因此最好的情况是最下面的分析栏没有FOUND，只有NONE。值得注意的是中间一栏的末尾给出该引物的最佳退火温度可参考应用。2.4.7根据用PRIMER软件所设计的引物为模板，进行RT-PCR实验，对模板进行扩增。RT-PCR简介：RT-PCR 为反转录RCR（reverse transcription PCR）和实时PCR（real time PCR）共同的缩写。逆转录PCR，或者称反转录PCR(reverse transcription-PCR, RT-PCR)，是聚合酶链式反应(PCR)的一种广泛应用的变形。在RT-PCR中，一条RNA链被逆转录成为互补DNA，再以此为模板通过PCR进行DNA扩增。 由一条RNA单链转录为互补DNA(cDNA)称作“逆转录”，由依赖RNA的DNA聚合酶（逆转录酶）来完成。随后，DNA的另一条链通过脱氧核苷酸引物和依赖DNA的DNA聚合酶完成，随每个循环倍增，即通常的PCR。原先的RNA模板被RNA酶 H降解，留下互补DNA。RT-PCR的指数扩增是一种很灵敏的技术，可以检测很低拷贝数的RNA。RT-PCR广泛应用于遗传病的诊断，并且可以用于定量监测某种RNA的含量。（检测基因表达的方法，参见Northern Blot法。RT-PCR的关键步骤在是RNA的反转录，要求RNA模版为完整的且不含DNA、蛋白质等杂质。常用的反转录酶有两种，即鸟类成髓细胞性白细胞病毒（avian myeloblastosis virus,AMV）反转录酶和莫罗尼鼠类白血病病毒（moloney murine leukemia vrius,MMLV）反转录酶。RT-PCR有时候也会指代实时PCR(real-time PCR)。为了与逆转录PCR相区别，通常被写作“定量PCR”(quantitative PCR)或者RTQ-PCR(real-time quantitative PCR)。实时定量PCR实时PCR(real-time PCR)，属于定量PCR（Q-PCR）的一种，以一定时间内DNA的增幅量为基础进行DNA的定量分析。real time PCR 的定量使用荧光色素，目前有二种方法。一种是在ds DNA中插入特异的荧光色素，例如SYBR Green荧光染料；另一种使用一种能与增幅DNA序列中特定寡核酸序列相结合的一种荧光探针（probe），如Taqman探针。两种方法原理不同。SYBR Green荧光染料游离时不发光，当反应体系中存在双链DNA时，SYBR Green与双链DNA结合，此时才发光。Taqman探针带有一个荧光基团和一个淬灭基团，荧光基团连接在探针的5末端，而淬灭基团则在3末端。PCR扩增时在加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针，探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；PCR扩增时，Taq酶的53外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，此时荧光基团发出的荧光信号可以被检测到。real time PCR 与 reverse transcription PCR 相结合，能用微量的RNA来找出特定时间、细胞、组织内的特别表达的遗传基因。这两种RT PCR的组合又被称之为“定量RT-PCR（quantitative RT-PCR）。PCR各步骤的目的（一）预变性：破坏DNA中可能存在的较难破坏的二级结构。使DNA充分变性，减少DNA 复杂结构对扩增的影响，以利于引物更好的和模板结合，特别是对于基因组来源的DNA模板，最好不要吝啬这个步骤。此外，在一些使用热启动Taq酶的反应中，还可激活Taq酶，从而使PCR反应得以顺利进行。（二）变性-退火-延伸循环：模板DNA的变性：模板DNA经加热至93左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；模板DNA与引物的退火(复性)：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；引物的延伸：DNA模板-引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA 链互补的半保留复制链。（三）PCR仪扩增循环后72度延伸10分钟用PCR仪扩增时,(变性.退火,延伸)循环完成后,继续72度延伸了10分钟的原因：1.延伸时间取决于待扩增DNA片段的长度。（当然是在反应体系一定的条件下）例如，使用TaqDNA聚合酶，72度时的碱基掺入率为35-100bp/s，因此延伸速率为1kb/min。2.根据延伸速率推得，扩增1kb以内的DNA片段1min即可，而3-4kb则需要3-4min，依次照推。通常在最后一轮要适当的将延伸时间延长至4-10min，这样做是使PCR反应完全以提高扩增产量。3.继续72度延伸了10分钟除了可以使PCR反应完全以提高扩增产量外，还有一个作用是：在用普通Taq酶进行PCR扩增时在产物末端加A尾的作用，可以直接用于TA克隆的进行。（四）PCR引物的选择对靶序列中潜在的引物位点进行分析， 这些位点应该不会形成同源多聚体机构，也没有明显的形成二级结构的趋势，不会自身互补，与基因组中的其他序列无显著的同源性。（1）依据寡核苷酸引物与其靶序列形成杂合分子的熔解度的计算中提供的公式计算各引物的熔解温度。（2）选择一对匹配完好的正向和反向引物。两条引物的G+C含量相似，将产生一种大小和碱基组成合适的产物。两条引物与所扩增片段的GC含量都应在40%-60%之间。（3）对寡核苷酸的长度和/或位置进行细调。使得引物的3末端核苷酸为G或C。检查两条寡核苷酸之间有无明显的互补性。作为一条经验性的规律，一条引物上不该含有三个连续的与另一条引物互补的核苷酸。（五）设计PCR反应的注意事项(1)双链DNA的变性温度是由双链中C+G的含量决定的，C+G含量越高，模板DNA的溶解温度就越高。在选择的变性温度下，模板链越长变性所需时间就越长。如果变性温度过低或变性时间过短，会使仅仅富含A+T区域变性。当模板DNA的G+C含量超过55%的时需要更高的变性温度。(2) 复性过程采用的温度至关重要如果复性温度太高，寡核苷酸引物不能与模板很好的复性，扩增效率将会降低。如果复性温度太低，引物将产生非特异性复性，从而导致非特异性的DNA片段的扩增。复性通常在比理论计算的引物和模板的溶解温度低35的条件下进行。（3）PCR扩增所需的循环数目决定于反应体系中起始的模板拷贝数以及引物延伸和扩增的效率。一旦PCR反应进入几何级数的增长期，反应会一直持续下去，直至某一成分成为限制因素。从这一点上来说，扩增产物中绝大多数应该是特异性的扩增产物，而非特异性的扩增产物应该低到难以检测到的程度。用TaqDNA聚合酶（效率为0.7）在一个含有10的5次方个拷贝的靶序列的反应体系中进行30个循环后往往可以做到上述的理想情况。PCR反应过程:第一轮PCR:在上述含l伽l逆转录产物DcNA的EP管中继续加入试剂，置于PCR仪上扩增。反应条件:94变性2分钟，9430秒，5530秒，721分钟35个循环，再进行下一轮扩增;第二轮PCR:以第一轮产物(如D为模板，加入表3所示试剂，置于PRC仪上扩增，反应条件如第一轮扩增。(4)琼脂糖凝胶电泳:琼脂糖凝胶的制备:用琼脂糖和电泳缓冲液配制成2%的琼脂糖液体，煮至液体气泡消失，澄清透明，加入l%滨化乙锭(EB)，摇匀后缓慢倒入插好梳子的制胶版上，室温下放置30分钟至凝固，将梳子拔出，凝胶放置于充满电泳缓冲液的电泳槽中，备电泳用;PCR产物和澳酚蓝指示剂按5:1混匀，取单l混和物加样至%2琼脂糖凝胶梳孔中电泳50分钟，紫外光下凝胶成像观察。4、阳性质粒的构建和梯度稀释以PML-RARA cDNA为模板，利用重叠延伸法15获得融合基因的片段。产物经电泳分离并切胶回收后，连接到pMD18-T载体（宝生物工程有限公司，大连），转化大肠杆菌（DH5）感受态细胞。挑选4个菌液PCR为阳性的单克隆进行测序。对于序列正确的单克隆，在扩大培养后采用质粒提取试剂盒（Omega公司，美国）获取阳性质粒。5、基因芯片点样、杂交、显色1.2.3.待检样品的预扩增 按照东盛生物Taq Mix说明书配制PCR反应液，样品管中反应液中除加入PML-RARA阳性克隆质粒的标准品（本实验使用了e14a2融合类型样品）外还应额外加有ARF8阳性质控模板。在PCR仪上进行PCR反应，PCR条件按照说明书要求要求设置。需要特别指出因为所进行的是多重PCR，所以只进行25个热循环防止dNTP耗竭。1.2.4.基因芯片点样与杂交将探针使用TE缓冲液稀释至20 mM，按照DR.Chip DIYTM Kit（Poly substrate and colorimetric reagents for microarray）说明书要求将探针点至基片表面，并进行封闭。点样完成后，按照DR.Chip DIYTM Kit说明书要求，将PCR预扩增产物沸水浴变形后冰浴速冷，然后准确吸取20ml PCR产物与180ml杂交液混合加入芯片杂交舱内于45恒温箱内杂交1h，此过程中要对芯片进行温和的水平振摇，使变形PCR产物与探针充分接触。杂交结束后使用配套洗液对芯片进行严格的清洗，去除非特异结合序列片段。第3章、结果及分析显色与结果判读如表二所示，本实验中所使用的PCR下游引物均标记有生物素（Biotin）,这就将生物素引入了PCR产物之中。在芯片上进行杂交之后，成功与PCR产物结合的探针也就将生物素固定在了芯片表面。此时向检测体系中加入链霉亲和素-碱性磷酸酶（Streptavidin alkaline phosphatase），链霉亲和素是一种从链霉菌属细菌 Streptomyces avidinii 中纯化获得的蛋白，一分子链霉亲和素可以高度特异性地与四分子生物素结合，两者之间的亲和力极为强烈12。由于链霉亲和素与生物素结合最终使成功杂交的探针被标记上了碱性磷酸酶，当加入碱性磷酸酶的作用底物（BCIP/NBT）时，底物就会在酶的作用下形成蓝紫色或浓紫色的不溶性产物沉积在杂交位点周围形成肉眼可见的蓝紫色斑点，而在未捕获到目标序列的探针位点处不会出现这种现象。实验结果图 实验结果第4章 讨论 (1)检测全面性。CBFB-MYH11融合基因至少有11种融合类型（A-K型），其中A型最为常见（约88%）17,18。如图1所示，CBFB的断裂点有3种，主要在外显子4和外显子5最后一个碱基，偶有报道在外显子5中；MYH11的断裂点较多，目前发现的有8种，跨越外显子29-35大约1.5kb区域。为了避免扩增产物太长而引起扩增失败或扩增效率低，我们采用“一探针多引物”的检测模式，设计的检测方案如下（图1）：在MYH11基因的外显子31、33和36上各放一条下游引物，在CBFB基因外显子3上放一条上游引物，并在每个引物位置上设计3条引物用于筛选；由于CBFB基因断裂点较集中，因此把探针放在CBFB基因上（FAM标