硕士学位论文-青海地区藏族类风湿关节炎患者IL-6-572 C／G单核苷酸多态性的相关研究

青海大学医学院2010级攻读临床医学硕士学位研究生毕业论文 分类号： 密 级： U D C： 编 号: 攻读硕士学位研究生毕业论文青海地区藏族类风湿关节炎患者IL-6-572 CG单核苷酸多态性的相关研究指 导 教 师： 学 生 姓 名： 论 文 类 型： 理论研究 学科专业名称： 外科学（骨外） 研 究 方 向： 骨外基础与临床 学院(系、部)： 医学院 论文起止时间：2011.122013.03.24目录摘要1英文摘要2前言3临床资料与方法5结果8讨论.10结论.12参考文献.13附录.15致谢.16综述.17攻读硕士期间发表的文章.22学术论文独创性声明.23学术论文知识产权权属声明.24青海地区藏族类风湿关节炎患者IL-6-572 CG单核苷酸多态性的相关研究中文摘要目的 了解中国青海地区藏族人群白细胞介素6（IL-6）基因启动子-572 CG单核苷酸多态性对类风湿关节炎（RA）的影响。方法 采用SNaPshot技术检测了青海藏族人群中87例散发RA 患者和65例健康对照者IL-6基因启动子-572位点的基因型。统计方法：采用SPSS 13.0 统计软件进行统计学分析，以（xs）表示样本的均数，两样本均数的比较采用t 检验，两独立样本率的比较采用2，P005 为差异有统计学意义。结果1. IL-6-572 CG基因型结果：该位点存在CC、GC、GG三种基因型。类风湿组： CC为39例(44.83%)，GC为36例(41.38%)，GG为12例(13.79%)。对照组：CC为15例(23.08%)，GC为34例(52.30%)，GG为16例(24.62%)。三种基因型在两组中的分布经X2检验有显著性差异（X2=8.29，P=0.02）2. IL-6-572 CG等位基因频率结果：类风湿组：C为114(65.52%)，G为60(34.48%)。对照组：C为64(49.23%)，G为66(50.77%)。在两组中C和G的等位基因频率分布经X2检验有显著性差异（X2=8.13，P=0.00）3. IL-6-572 CG的G等位基因频率分布在类风湿组中低于对照组(OR=0.51, 95%CI: 0.32-0.81)结论 1. 青海地区藏族人群IL-6的基因启动子存在-572 CG的单核苷酸多态性。2. 青海地区藏族人群IL-6-572 CG 基因多态性与RA发病有相关性。3. 青海地区藏族人群IL-6-572位点的G等位基因可能对RA有保护作用。 关键词 藏族 类风湿关节炎 白细胞介素6 基因多态性 中图分类号 文献标识码 论文类型：应用研究IL-6-572 CG single nucleotide polymorphisms research in Tibetan rheumatoid arthritis patients of Qinghai, China AbstractObjectiveThis research is to investigate the relationships between the promoter region-572 CG of interleukin-6(IL-6) gene polymorphism and incidences of rheumatoid arthritis (RA) in Tibetan population of Qinghai province, China.Methods87 cases of sporadic RA patients in Tibetan population of Qinghai and 65 cases of healthy individuals were analyzed by SNaPshot technology at IL-6-572 genotypes . Results were statistically analyzed using the SPSS 13.0 software. Average of two samples were compared by T test while the independence of two samples was examined using 2 test. The significant level was defined as p 0.05）,均符合HardyWeinberg平衡定律。1.2 主要试剂与仪器1.2.1 试剂1） ABI PRISM SNaPshot Mltiplex Kit（ABI公司）2） Taq酶：KAPATaq HotStart DNA Polymerase（kapabiosystems公司）3） SAP酶（Fermentas公司）、ExoI酶和CIP酶（NEB公司）1.2.2 仪器4） NAS-99分光光度计（ACTGene公司）；5） BC-subMIDI电泳仪（北京六一仪器厂），电泳槽（北京君意东方电泳设备有限公司）；6） BioSens SC 810B凝胶成像仪（上海山富科学仪器有限公司），7） Centrifuge 5415D离心机（德国ppendorf公司）；8） GeneAmp 9600 PCR仪（ABI公司）；9） 3730XL DNA analyzer（ABI公司）1.3 实验步骤1.3.1样本收集收集所有研究对象清晨空腹静脉血5 mL, 贮于EDTA抗凝的试管中,-20保存， 用于基因组DNA的提取。1.3.2基因组DNA的抽提:采用AxyPrep血基因组DNA小量试剂盒(赛泰克生物科技有限公司),利用其独特的细胞裂解和血红素/蛋白沉淀技术, 结合DNA制备膜选择性地吸附DNA的方法,从抗凝全血中得到并纯化基因组DNA, DNA样本保存在-20备用。1.3.3基因多态性检测1.3.3.1引物设计合成：根据SNP位点序列信息，使用Primer5软件进行引物设计, 由上海生物芯片有限公司合成。PCR扩增引物序列见附表1，SNaPshot反应过程中SNaPshot引物序列见附表2。 表1 PCR扩增引物序列位点引物序列产物长度rs1800796FAACCTCCTCTAAGTGGGCTGA243bpRAGTTTCCTCTGACTCCATCGC 表2 SNaPshot引物序列引物方向引物长度rs1800796E-FttttttttttttttttttttttttttttttttttttCCAGGCAGTTCTACAACAGCC211.3.3.2预扩增1） PCR反应体系：PCR反应组分10 l体系10Buffer 1.0dNT（2.5mM each）0.2引物（10uM，F+R）0.2Taq（5U/l，kapa）0.1DNA(50-100ng/l)1.0ddH2O7.5Total10 l2） 扩增程序：95 5min；94 30s，60 30s，72 30s 32cycles；72 8min。3） 预扩增产物质检：取2l 上样，2%琼脂糖凝胶电泳。1.3.3.3预扩增产物消化：每个样本取每个预扩增产物3l，共15l混匀。取该混合产物用于消化。消化体系如下，37 1h，75 15min。组份加入量/反应PCR产物15 lSAP（1U/l）5 lExoI（20U/l） (0.1l)1.3.3.4延伸反应：1）延伸体系：组份加入量/反应消化后预扩增产物1 lPrimers Mix0.2uM eachReady Reaction Mix5 lH2Oup to 10 lTotal10 l2）延伸条件：96 10s，50 5s，60 30s， 27 cycles1.3.3.5延伸产物纯化：延伸反应产物6 l加入0.5l CIP；37 1.0h，75 15min1.3.3.6 3730XL测序仪检测1）96孔板中每孔加入分子量内标和甲酰胺混合液（0.5：8.5）9L， PCR产物1.0 L；2）95变性3min，上机检测；1.3.3.6 数据分析：将检测得到的原始数据文件导入到分析软件中进行分析。1.6 统计学分析全部数据采用SPSS 130 统计软件进行统计学分析，计量资料采用（xs）表示，两组的位点基因型频率用HardyWeinberg遗传平衡定律检验，各基因型和等位基因频率的分布差异采用2 检 ，P005 为差异有统计学意义。 结果表1 RA组和对照组IL-6-572 CG SNP的相关性分析组别例数（n）基因型频率等位基因频率CCGCGGCGRA8739（44.83）36（41.38）12（13.79）114（65.52）60(34.48)对照6515（23.08）34（52.30）16（24.62）64(49.23)66(50.77)值8.298.13P值0.020.00OR1.000.410.291.000.51OR95%CI0.19-0.870.11-0.750.32-0.81图1 两组不同基因型频率分布直条图图2 两组等位基因频率分布直条图讨 论类风湿性关节炎（rheumatoid arthritis, RA）是以对称性多关节炎为主要表现的一种全身性自身免疫性疾病，基本的病理改变是关节滑膜的炎症和关节外组织的血管炎。临床表现多样，从关节症状到关节外多系统受累的表现，疼痛、关节变形将会严重影响患者的日常生活。学者普遍认为RA是遗传易感因素、环境因素及免疫系统失调等各种因素综合作用的结果。近来对细胞因子(CK)在RA发病机制中，作用的研究成为热点。RA患者的滑膜组织中存在大量的单核巨噬细胞、淋巴细胞等，这些细胞可以产生大量的细胞因子和炎性物质9-10，上述分子在相互作用的过程中形成了一个庞杂的细胞因子网络，每一个环节步骤都可能对RA的病理过程产生一定的影响11。 作为内源性致热源的IL-6就是一种重要的细胞因子，具有多种生物学活性，如诱导IL-1，IL-2和TNF-等产生及释放，并增强细胞因子IL一1和TNF-的炎症破坏效应12。IL-6基因定位于人类第7号染色体7q15-21区, 有5个外显子和4个内含子. IL-6基因启动子区存在基因变异及基因多态性, 这种多态性与多种疾病存在密切相关性13-15。国内外研究表明,IL-6在RA患者血清中的水平明显升高,活动期高于稳定期，其水平高低也与ESR及CRP呈正相关，是反映病情活动变化的重要指标16-19。同时IL-6水平的高低受到IL一6基因启动子的调控，而IL-6基因启动子区域的基因多态性在不同种族和地区具有明显差异。本课题针对青海地区藏族RA患者IL-6-572 CG 单核苷酸多态性与RA发病的相关性进行探讨，采用SNaPshot技术对青海地区藏族RA患者以及藏族健康体检者的IL-6-572 CG基因位点进行了检测，RA组和对照组IL-6-572 CG SNP的相关性分析见表1及图1和图2。实验结果初步表明：中国青海地区藏族人群IL-6-572 CG位点存在二态性，即C和G，可表现为三种基因型：CC、GC和GG；其基因型和等位基因分布频率两组比较，差异明显有统计学意义(P005)，其中G等位基因在RA患者组中的分布频率明显低于对照组，G等位基因可能对我国青海地区藏族人群RA患者有保护作用。概括之，我国青海地区藏族人群IL-6基因启动子-572CG位点有单核苷酸多态性且与RA有相关性，IL-6-572CG位点等位基因G可能对RA有保护作用，这也与国内庄俊华，任燕歌等对广东地区汉族RA人群所做的研究报道基本一致。但RA的病因机制十分复杂，参与的因素很多, IL-6基因的转录调控并不是由单一的基因多态性决定的，而且研究单个基因多态性时, 还可能会受样本数量的不足、实验条件、地域差异、种族差异、及外界环境等多因素影响而致研究结果发生偏差。 在后续的研究中可采取增加样本数量及联合相关基因研究，补充同一地域的青海地区汉族RA患者IL-6-572 CG单核苷酸多态性的相关研究。结 论1. 青海地区藏族人群IL-6的基因启动子存在-572 CG的单核苷酸多态性。2. 青海地区藏族人群IL-6-572 CG 基因多态性与RA发病有相关性。3. 青海地区藏族人群IL-6-572位点的G等位基因可能对RA有保护作用。参考文献1MacGregor AJ,Snieder H,Rigby AS et al.Characterizing the quantitative genetic contribution to rheumatoid arthritis using data from twins.Arthritis Rheum 2000;43:30-7.2 Choy EClinical experience with inhibition of interleukin 6JRheum Dis Clin North Am，2004，30(2)：405-4l53Ota N，Nakajima T，Nakazawa I，et a1A nucleotide variant in the promoter region of the interleukin-6 gene associated with decreased bone mineral densityJ Hum Genet2001，46(5)：267724Terry CF，Loukaci V，Green FRCooperative influence of genetic poly-morphisms on interleukin-6 transcriptional regulationJJ Biol Chem，2000，275(24)itamura A,Hasegawa G，Obayashi H，el a1Interleukin-6 polymorphism(-634CG)in the promotor region and the progression of diabetic nephropathy in type 2 diabetesJDiabet Med，2002，19(12)：1000-10056庄俊华， 任燕歌， 黄宪章,等.我国广东地区汉族人群类风湿性关节炎患者IL-6启动子基因多态性的研究发现. J检验医学.2007,22(6):6977027Pascual M，Nieto A，Mataran L，et a1IL一6 promoter po1ymorphisms inrheumatoid arthritisGenes-Immun2000，1(5)：3383408Ogilvie EM，Fife MS，Thompson SD，et a1The一174G allele of the interleukin-6 gene confers susceptibility to systemic arthritis in children：a multicenter study using simplex and multiplex juvenile idiopathic arthritiS familiesArthritis-Rheum2003，48(11)：320269MIOSSEC PAn update on the cytokine network in rheumatoid atthritisJCurr Opin Rheumatol，2004，16(3)：21822210ISHIHARA K，SAWA S，IKUSHIMA H，et a1The point mutation of tyrosine 759 of the IL-6 family cytokine receptor gpl30 synergizes with HTLV-1 pX in promoting rheumatoid arthritis like arthritisJInt Immunol，2004，16(3)：455-46511DE A，BLOTYA H M，MAMONI R L，et a1Effects of dexamethasone on lymphecyte proliferation and cytokine production in rheumatoid arthritisJJ Rheumatol,2002，29(1)：46-5112CHOY EClinical experience with inhibition of interleukin-6 JRheum Dis Clin North Am，2004，30(2)：40541513 Fernandez-Real JM, Broch M, Vendrell J, Richart C, Ricart W. 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