组织培养与植物转基因.ppt

1,植物组织培养,第九章植物遗传转化,2,植物基因工程是指把不同生物有机体的DNA（或基因）分离提取出来，在体外进行酶切和连接，构成重组DNA（RecombinantDNA）分子，然后转化到受体细胞（大肠杆菌）使外源基因在受体细胞中复制增殖，然后借助生物的或理化的方法将外源基因导入到植物细胞，进行转译或表达。也称为植物遗传转化、植物转基因等。,1植物基因工程的概念,3,植物基因工程是80年代开始兴起和发展起来的一门新技术，它是在分子遗传学的理论基础上，综合采用了分子生物学、微生物学和植物组织培养的现代方法和技术建立起来的。转移的目的基因可从动物、人、植物或微生物中获取。植物基因工程首先是随原核生物的基因工程的发展而得以发展。大肠杆菌，酵母，动植物细胞。,4,植物基因工程发展迅速。自从1983年首例转基因植物（烟草）诞生以来，现在已有100多种植物通过基因工程技术获得了转基因植株，包括番茄、辣椒、茄子、马铃薯、胡萝卜、芹菜、莴苣、甜瓜、黄瓜、白菜、甘蓝、花椰菜、芥菜、石刁柏、洋葱、柑橘、柿、杨树、桉树等。,5,2植物基因工程的载体,Ti载体其它载体RNAi,6,根癌农杆菌（Agrobacteriumtumefaciens）的Ti质粒（Tumor-inducingplasmid）的改建与利用，从而开创了植物基因工程的新纪元。,根癌农杆菌,7,8,9,10,TDNA,11,植物基因工程中，我们把接受外源(目的)基因的生命体系称为“受体”。受体包括：叶圆片(盘)、胚性愈伤、胚状体、愈伤组织、悬浮细胞、原生质体等不同的形态。其基本形态还是细胞。叶圆片与农杆菌共培养是最简单的转化方法；愈伤组织的转化效率高、生长速度快，是快速检测外源基因表达的最好受体；原生质体则是单克隆转化的最佳材料。,3植物基因转化的受体,12,转化植株,（未）受精卵细胞,花粉,胚,胚轴,子叶,叶片,茎段,萌发种子,子房,原生质体,悬浮培养细胞,花器官,根,创伤植株,块茎,茎尖,植物基因转化的外植体,13,被转化的受体细胞是单个独立的细胞，为选择遗传均一性的转基因植株提供了可能性。以悬浮细胞作受体的转化方法包括：农杆菌介导法、基因枪法、PEG介导法、电激法和显微注射法等。,3.1悬浮细胞,14,原生质体是无细胞壁的细胞。与悬浮细胞一样，被转化的受体细胞是单个独立的细胞，为选择遗传均一性的转基因植株提供了可能性。,3.2原生质体,15,愈伤组织容易大量制备愈伤组织的转化已在玉米、甘蔗、芹菜等植物上获得成功。用农杆菌介导法最适合。,3.3胚性愈伤组织,16,胚状体是由愈伤组织经过改造后分化而来的，其转化方法与愈伤组织相同。,3.4胚状体,17,叶圆片是农杆菌转化的主要受体。也称为叶盘法。用打孔器或解剖刀切取直径35mm的叶圆片；在液体培养瓶中与农杆菌共培养20-30min；将叶圆片在滤纸上吸干；转移到非选择性培养基上培养3d；再移入含抗生素的选择培养基上培养；诱导植株再生；获得转基因植株。叶盘法常见于双子叶植物的遗传转化。,3.5叶圆片,18,如子叶、胚轴、茎段、根、体细胞胚、花粉等,3.6其他受体,19,农杆菌介导法(Agrobacterium-mediatedtransformation)基因枪转化法(Microprojectilebombardment)聚乙二醇-介导法(PEG-mediatedtransfomation)电激法(Electroporation)花粉管通道法(Pollen-tubepathway)显微注射法(Microinjection)脂质体转化(Liposomestransformation)激光微束转化法(Lasermicrobeampuncture),4植物基因转化的方法,20,根癌农杆菌(Agrobacteriumtumefacience)介导法是植物基因转化中使用最普遍的一种方法。其Ti质粒(Tumor-inducingplasmid)具有将DNA整合到植物染色体上，并使之与植物内源基因同步表达的能力。每个Ti质粒都有3个功能区域。一是T-DNA区，即转化DNA区，与病症发生有关的基因位于这个区，决定着肿瘤形态和冠瘿碱的合成；二是Vir区，是T-DNA区以外的与感染肿瘤有关的区域；三是分解和利用冠瘿碱的区域，分布着冠瘿碱分解酶基因。,4.1农杆菌介导法,21,4.2微弹轰击法,原理：金属微粒在外力作用下达到一定速度后，可以进入植物细胞，但又不引起细胞致命伤害，仍能维持正常的生命活动。也称为基因枪法。利用这一特性，先将含目的基因的外源DNA同钨、金等金属微粒混匀，使DNA吸附在金属微粒表面，随后用基因枪轰击，使DNA随高速金属微粒进入植物细胞。此方法可直接处理植物某器官或某组织，是当今普遍使用的植物转基因方法。,22,23,聚乙二醇介导法与PEG诱导原生质体融合的机理相似，不同的是后者发生在原生质体之间，而前者发生在原生质体与DNA之间。在高浓度的二价钙离子(Ca2+)和高pH值的条件下，略带负电的高分子PEG可能促进DNA向原生质体膜沉淀，或参与原生质体的内吞作用下，使外源DNA分子进入原生质体和细胞核，并整合到染色体上。,4.3聚乙二醇-介导法,24,4.4电激法,原理：细胞膜的基本组成是磷脂，在适当的外加脉冲电场作用下，细胞膜被击穿，但还达不到细胞致命伤害。所以当移去外加电场后，被击穿的膜孔可自行复原。也称为电穿孔法。根据这一性质，植物原生质体同外源DNA分子混合，置于电击仪的样品室中，按预定的参数进行直流电脉冲处理，再通过常规的再分化培养和筛选，可获得转基因植株。为避免制备原生质体和原生质体再生植株的困难，近来用此技术直接处理具有完整细胞壁的植物细胞、愈伤组织和花粉粒，均取得一定的效果。,25,2019/11/18,26,可编辑,27,28,4.5花粉管通道法,原理：将重组DNA涂于授粉的柱头上，使DNA沿花粉管通道或传递组织通过珠心进入胚囊，转化尚不具有正常细胞壁的卵、合子和早期的胚胎细胞，在活体内产生转基因种子。,29,花粉管通道法,30,4.6显微注射法,原理：利用显微注射仪将外源DNA直接注入受体的细胞质或细胞核中。重要问题：必须把受体细胞进行固定。动物细胞具有独特的贴壁生长待性，因此不存在固定细胞的问题。植物细胞的显微注射必须建立固定细胞技术。目前有三种方法：琼脂糖（低熔点）包埋法；多聚-L-赖氨酸粘连法；吸管（毛细管）支持法。,31,4.7脂质体介导法,原理：脂质体是由人工构建的磷脂双分子层组成的膜状结构，把用来转染的DNA分子包在其中，通过脂质体与细胞接触，将外源DNA导人受体细胞。包装成脂质体的DNA的转染串比裸露的DNA的转染率高出100倍。如先用PEG处理培养的受体细胞，使其易吸收培养基中的脂质体，可提高转染率1020倍。在正常情况下，每个细胞平均可吸收1000个左右的脂质体。这是哺乳动物转基因研究中常用的方法之一。,32,4.8激光微束穿孔法,原理：利用直径很小（纳米级）、能量很高的激光微束可引起细胞膜可逆性穿孔的原理，在荧光显微镜下用激光处理细胞，处于细胞周围的重组DNA随之进入细胞。此方法最适用于活细胞中线粒体和叶绿体等细胞器的基因转移。,33,34,植株再生是基因转移的关键步骤，直接决定能否获得转基因植株。两种形式：一种是愈伤组织再生另一种是直接再生，从外植体直接诱导出芽而不经过愈伤组织的分化。转墓因植株再生的方式与一般植株再生的方式相同，主要区别是转基因植株的再生受外源基因、载体系统、抗生素、转化过程的影响。,5转基因植株的再生及其检测方法,5.1转基因植株再生,35,常采用报告基因作为标记，以便快速检测。主要采用分子生物学方法检测，包括：聚合酶链式反应(PCR)、SouthernBlot、NorthernBlot和WesternBlot等方法。进行分子生物学检测以后还要进行生物学鉴定，以确定基因是否可以正常地表达性状，并稳定地遗传给后代。如果一些有价值的目的基因被转入，还必须鉴定基因的功能及其表型。,5.2转基因植株的检测,36,如转化抗病毒基因：要对转基因植物进行病毒接种，以鉴定抗病毒能力。若转化的基因为抗除草剂基因：还要对植物喷洒除草剂进行检测。若转基因植物是食用粮食作物或油料：还要通过转基因植物的安全性检测，以免对人类和环境造成危害。如果转化的是花色素合成酶基因：则凭肉眼就可直观鉴定花色变化。,37,38,6植物转基因产品的安全性国际大讨论,39,斑蝶事件：1999年5月，康奈尔大学的一个研究组在Nature杂志上发表文章，声称转基因抗虫玉米的花粉飘到一种名叫“马利筋”的杂草上，用马利筋叶片饲喂美国大斑蝶，导致44的幼虫死亡。现在这个事件也有了科学的结论：第一，玉米的花粉非常重，扩散不远，在玉米地以外米，每一平方厘米马利筋叶片上只找到一个玉米花粉。第二，2000年开始在美国三个州和加拿大进行的田间试验都证明，抗虫玉米花粉对斑蝶并不构成威胁，实验室试验中用10倍于田间的花粉量来喂大斑蝶的幼虫，也没有发现对其生长发育有影响。斑蝶减少的真正原因，一是农药的过度使用，二是墨西哥生态环境的破坏。,40,加拿大“超级杂草”事件：由于基因漂流，在加拿大的油菜地里发现了个别油菜植株可以抗一种、两种或三种除草剂，因而有人称此为“超级杂草”。事实上，这种油菜在喷施另一种除草剂2，4-后即被全部杀死。应当指出的是，“超级杂草”并不是一个科学术语，而只是一个形象化的比喻，目前并没有证据证明已经有“超级杂草”的存在。同时，基因漂流并不是从转基因作物开始，而是历来都有。如果没有基因漂流，就不会有进化，世界上也就不会有这么多种的植物和现在的作物栽培品种。,41,墨西哥玉米事件：2001年11月，美国加州大学伯克莱分校的两位研究人员在Nature上发表文章，声称在墨西哥南部Oacaca地区采集的个玉米地方品种样本中，发现有CaMV35S启动子及NovartisBtll抗虫玉米中的adh1基因相似序列。绿色和平组织借此大肆渲染，说墨西哥玉米已经受到了“基因污染”，甚至指责墨西哥小麦玉米改良中心的基因库也可能受到了“基因污染”。文章发表后受到很多科学家的批评，。所谓测出的35S启动子，经复查证明是假阳性。所称玉米中的adh1基因已经转到了墨西哥玉米的地方品种，也是假的。转入玉米中的基因序列是adh1-S基因，而作者测出的是玉米中本来就存在的adh1-IF基因，两者的基因序列完全不同，是两码事。显然作者没有比较这两个序列，审稿人和Nature编辑部也没有核实。墨西哥小麦玉米改良中心（CIMMYT）也发表声明指出，经对种质资源库和新近从田间收集的152份材料的检测，在墨西哥任何地区都没有发现35S启动子。,42,中国抗虫棉破坏环境事件：2003年月日，南京环科所与绿色和平组织在北京召开会议，月日ChinaDaily上发表了题为“GMCottonDamageEnvironment”的文章，亦即“转基因抗虫棉破坏了环境”。绿色和平组织也于当天在其网站上刊登了南京环科所、绿色和平组织顾问薛达元先生长达26页的英文报告，从而再次引发国际争论，在欧、美产生巨大反响，成为国际上争论转基因作物安全性的重大事件之一。,43,6月5日德国农业报发表了题为“ChineseResearch:largeEnvironmentDamagebyBtCotton”的文章，即：“中国研究：Bt棉破坏环境巨大”。绿色和平组织的“中国项目主管”卢思聘声称：棉农“将面对不受控制的超级害虫”（这里他又全无科学根据地提出了“超级害虫”的新名词！），“声称可以减少农药使用的转基因抗虫棉，不但没有解决问题，反而制造了更多的问题”，“（棉农）将被迫使用更多、更毒的化学农药”。抗虫棉在中国实践多年，深受广大棉农的欢迎，相信不会同意他的这些结论。中国、美国、德国、加拿大、比利时、印度等国的科学家已在网上纷纷发表评论，反驳绿色和平组织的观点。,44,（1）国际转基因作物争论的实质并不纯粹是科学问题，而是经济和贸易问题。现在转基因作物的安全性已经成了国际贸易的技术壁垒。（2）争论应该以科学为基础，目前批准商业化的转基因作物及其产品还没有发现环境和食品安全性问题。长期效应需要跟踪，包括非预期效应，但非预期效应的分析必须与安全性评价相结合。（3）归结到一点，今天与反生物技术组织的争论，是要不要转基因作物及其产品、要不要科学和社会文明进步的问题。他们的根本出发点是要禁止一切生物技术！而我们则是在保证环境和人类健康的同时促进生物技术的发展，这是两者的根本区别所在。,争论的实质,45,7植物转基因的成果,一、植物新品种的培养（1）利用DNA重组技术将目的基因转入蔬菜中，培育成的蔬菜称为转基因蔬菜，它主要是用来选育具有特殊优良性状的(如抗虫、抗病、抗除草剂等)蔬菜新品种。（2）通过基因工程手段，培育出高抗、优质林、草新品种。,46,利用转基因植物作为反应器，把外源基因引入植物体内以生产医用多肽和医用疫苗正成为继转基因动物以后又一新兴的研究领域。生物学家把机体的免疫机理与植物DNA重组技术相结合，将激发机体免疫反应的病原体基因分离出来，重组到植物体中，生产出能够使人体获得特异抗病能力的食用疫苗。人体摄食含该种疫苗的植物后，由于疫苗不被酶类所破坏，通过肠道粘膜作用，激发特异性免疫应答。大量的转基因蔬菜获得成功，为利用蔬菜