《动物细胞制药pa》PPT课件.ppt

,动物细胞的培养条件,动物细胞培养,细胞培养是指离体细胞在无菌条件下分裂、生长，在整个培养过程中不出现分化，不再形成组织。组织培养是指动物体系的某种组织，在体外培养时细胞一直保持原来已分化的特征，该组织的结构和功能持续不发生明显变化。原代培养是指直接从有机体得到的组织或将其分散成细胞后开始的培养。传代培养或再培养是转移部分初代培养物到新鲜培养基中的培养。,动物细胞培养与微生物培养区别,动物细胞无细胞壁，且大多数哺乳动物附着在固体或半固体的表面才能生长。对营养的要求较高，往往需要多种氨基酸、维生素、辅酶、核酸、嘌呤、激素和生长因子等，其中很多成分系用血清、胚胎浸出液等提供，在很多情况下还需加入10%的胎牛或新生牛血清。动物细胞对环境敏感，包括pH、溶氧、温度、剪切应力都比微生物有更严的要求，一般须严格的检测和控制。动物细胞生长缓慢，对环境条件要求严格。不仅需要严格的防污染措施，同时还要用空气、氧、二氧化碳和氮的混合气体进行供养和调节pH。,原代培养：单个细胞十代左右传代培养：原代培养细胞4050代左右细胞株：10到40、50代的细胞遗传物质没发生改变细胞系：超过50代的细胞，遗传物质发生改变，可无限增值,注意界定原代培养和传代培养；细胞株和细胞系,已有商品市售无血清培养基主要游戏书3类：,基本合成培养基；基本合成培养基加生长因子；基本合成培养基加组织抽提物。,动物细胞培养方法和操作方式,一、动物细胞大规模培养方法依细胞种类：原代培养传代培养依培养基：液体培养基固体培养基,依培养器和方式：,静止培养、旋转培养搅拌培养、为载体培养中空纤维培养、固定床或流化床培养,从生产实际分为：,悬浮培养贴壁培养贴壁-悬浮培养,培养技术,动物细胞大规模培养与实验室培养相比，培养条件更严格，控制难度更大，其培养方法可概括为：悬浮培养固定化培养微载体（Microcarrier）培养法,培养技术,一、单层静置贴壁培养法：转管及转瓶培养和旋转圆柱管培养二、悬浮培养法：翻滚培养旋转培养电磁搅拌培养振荡培养振动器培养滋养器装置发酵罐培养（包括搅拌生物反应器和气动发酵器培养）三、固定化培养法：多层培养：1.多层繁殖期；2.多层托盘式装置；3Optical培养系统；4.塑料软片培养系统；5.Heli-cel薄膜卷带式培养微载体培养中空纤维灌注培养法玻璃珠床培养包被细胞培养（如图）,培养技术,细胞大量培养的类型和方法一、大规模培养系统的类型批量换液半连续批量培养系统用连续灌注法连续-流动培养系统（如图23-3）,培养技术,细胞大量培养的类型和方法二、大规模生产细胞的方法单层静置贴壁培养法：Roux瓶/方瓶转管及转瓶培养旋转圆柱管培养,培养技术,细胞大量培养的类型和方法二、大规模生产细胞的方法固定化培养法：将细胞限制或定位于特定空间位置的培养技术称为细胞固定化培养。多层培养法多层繁殖器在玻璃圆管中(大方缸）有多层玻璃隔板支持细胞贴附生长。钛碟装置多层圆柱状不锈钢（带有观察条件）罐内或玻璃瓶内装入钛碟圆盘支持细胞贴服生长。可改变位置和旋转。,培养技术,细胞悬浮培养法动物细胞在培养液中呈悬浮状态生长繁殖的培养方法谓之悬浮培养法。其培养方式有批量法半连续法连续法适用于培养确立细胞株、杂交瘤细胞、肿瘤细胞、血液细胞及淋巴组织细胞，用于大量生产疫苗、-干扰素、白介素等药品。此法不适于包括二倍体细胞在内的正常组织细胞的培养。,培养技术,细胞悬浮培养法的优点可连续收集部分细胞进行移植继代培养，传代时无需消化分散，免遭酶类、EDTA及机械损害。细胞收率高，并可连续测定细胞浓度，还有可能实现大规模直接克隆培养。,培养技术,细胞悬浮培养法的优点培养过程中，为确保细胞呈单颗粒均匀悬浮状态，需采用搅拌或气升式反应器，以较低搅拌速度及一定速度通入含5%的CO2无菌空气，保持细胞悬浮态并维持培养液溶解氧。此外不同细胞悬浮条件亦异，为使细胞不直凝集、成团或沉淀，在配制培养基的基盐溶液中不加钙和镁离子。间歇或连续更换部分培养液，可维持pH值，若使用HEPES缓冲盐溶液时尚可不必连续通入含5%的CO2空气。,培养技术,悬浮培养的反应器气升式反应器笼式通气搅拌罐中空纤维管陶质矩形通道峰窝状生物反应器,培养技术,2.固定化培养法动物细胞限制或定位于特定空间位置的培养技术谓之细胞固定化培养法。动物细胞几乎都可采用固定化方法培养。固定化方法有：吸附法（所用载体有陶瓷颗粒、玻璃珠及硅胶颗粒）包埋法（将细胞包埋于琼脂、琼脂糖、胶原及血纤维等海绵状基质中）,培养技术,固定化培养优点细胞可维持在较小体积培养液中生长；细胞损伤程度低；易于更换培养液；细胞和培养液易于分离培养液终产物浓度高，简化了产品分离纯化操作。,培养技术,固定化培养装置多层平板装置螺旋卷膜培养器多层托盘式培养器卷带式培养器中空纤维及流化床培养器,培养技术,中空纤维培养器优点细胞生长密度高，可达108个/毫升以上，细胞处于接近生理状态的理化梯度中；营养物质可有效分布，代谢废物可及时排除；细胞培养可达数月，易于实现连续培养：细胞分泌的蛋白质浓度高。产品纯度可高达60%-90%利于降低成本；反应器体积小并可用于培养多种细胞。,培养技术,3.微载体培养方法将动物细胞吸附于微载体表面，在培养液中进行悬浮培养，使细胞在微载体表面长成单层的培养方法称为微载体培养法或微珠培养法。制备微载体的材料主要有：葡聚糖（DEAE-SephadexA50及A25）塑料明胶玻璃纤维素,培养技术,微载体培养优点兼具单层培养和悬浮培养的优势，且是均相培养。细胞所处环境均一，放大容易。培养操作可系统化、自动化，降低了污染发生的机会。,动物细胞生物反应器及其检测控制系统,一、动物细胞生物反应器的类型及其基本结构搅拌式生物反应器气升式生物反应器中空纤维式生物反应器透析袋或膜式生物反应器固定床或流化床式生物反应器,动物细胞生物反应器及其检测控制系统,1.搅拌式生物反应器,动物细胞生物反应器及其检测控制系统,1.气升式生物反应器,动物细胞生物反应器及其检测控制系统,3.中空纤维式生物反应器,动物细胞生物反应器及其检测控制系统,4.平床式中空纤维式生物反应器,动物细胞生物反应器及其检测控制系统,5.透析袋或膜式生物反应器,动物细胞生物反应器及其检测控制系统,5.固定床或流化床时生物反应器,动物细胞生物反应器及其检测控制系统,6.CellGenplus生物反应器,培养条件控制,动物细胞生长缓慢，又具有锚地依赖性，培养时为防止污染，除反应器密封性能良好外，尚需添加抗生素，培养过程还要求培养器、管道及接头出所用材质不可释放出对细胞有毒害的物质。在分批培养时，随着细胞生长，营养消耗，必然产生乳酸等代谢物的积累，引起细胞衰退死亡，需更换培养液或移植继代培养。,培养条件控制,动物细胞培养过程亦应控制一定的环境条件，如培养温度、溶解氧、pH、罐压及搅拌速度等。动物细胞对环境变化适应能力较微生物小得多，故条件控制精密度要求更高。其中特别重要的是溶解氧和pH的控制。,Vero细胞和狂犬病毒的培养工艺,动物细胞培养存在的问题,细胞密度低，细胞生产率低，产物浓度也很低。细胞群体在大规模、长时间培养过程中分泌产物能力的丢失或产物活性的降低依然是细胞培养领域深感棘手的问题。动物细胞培养基，培养设备以及培养用微载体颇为昂贵，限制了细胞培养工程在发展中国家的开展。,动物细胞