本科毕业论文-金线莲总黄酮测定方法的研究.doc

中国药科大学本科生毕业论文（设计）金线莲总黄酮测定方法的研究目录摘要3前言5第一章 材料71.1 药物和试剂71.2 主要仪器71.3 供试品7第二章 HPLC分析黄酮苷成分82.1 色谱条件82.2 检测波长的选择82.3 对照品的制备92.4 供试品的制备92.5 线性关系考察9第三章 紫外法测定总黄酮含量113.1 对照品的确定113.2 测定波长的选择113.3 不同提取方法的考察123.4 对照品的制备173.5 供试品的制备173.6 标准曲线的制备17第四章 方法考察184.1 稳定性试验184.2 精密度试验204.3 重复性试验224.4 加样回收率23第五章 结果255.1 样品测255.2 正交试验结果和分析25第六章 讨论28参考文献29致谢30金线莲总黄酮测定方法的研究摘要：目的：探讨金线莲总黄酮实验室提取工艺的最佳方法，从而为金线莲的开发研究以及实验室提取金线莲总黄酮提供相关实验数据和实验思路。方法：首先，通过HPLC法对金线莲黄酮苷成分进行分析定量，再通过对金线莲单因素提取方法（索氏提取、回流法、超声提取、冷浸法、温浸法），乙醇和甲醇提取溶剂的差异，提取溶剂含量和体积的差异，不等的提取时间以及不同的提取温度的考察，从中选取重要影响因素（提取温度、提取时间、溶剂含量和料液比）和最优点，制定正交试验表。按照正交试验表所制定的实验条件，在375nm波长下进行UV法直接测定黄酮含量，获得数据，对数据进行处理，制作方差分析表和极差分析表。结果：提取温度、提取时间、溶剂含量和料液比对金线莲总黄酮含量影响显著，其中影响因素大小为溶剂含量提取时间料液比提取温度。结论：该法能准确地对金线莲黄酮类含量进行分析，准确快速。关键词：金线莲；总黄酮；提取方法；Study the determination method of totalFlavonoids from Anoectochilus roxburghiiAbstract：Objective:Toresearch the suitable for extraction method in Anoectochilus roxburghii(Wall) Lindl. in order to the development of Anoectochilus roxburghii(Wall) Lindl. research and tatol flavonoidsextraction of Anoectochilus roxburghii(Wall) Lindl. in the laboratory and provide the related experiment data and ideas. Methods: First, analyzing tatol flavonoidsingredients quantitative of Anoectochilus roxburghii(Wall) Lindl. by HPLC, through single factor extraction methods of Anoectochilus roxburghii(Wall) Lindl. (soxhlet extraction, reflux extraction, ultrasonic extraction, cold soakextraction, warm immersion extraction), the difference of ethanol and methanol extraction solvents, the content of the extraction solvent and the differences in volume, the exploration of extraction time and extraction temperature, choosing the important influence factors (extraction temperature, extraction time and solvent content and the ratio of material and liquidthe) and the most advantage,and formulating orthogonal test table. According to orthogonal test table of the experimental conditions, determinating direct the contents of tatol flavonoids under the 375 nm UV-Vis spectrophotometry,and getting the data and disposing of the data , analysising of variance table and extreming difference analysis table. Results: Extraction temperature, extraction time, solvent content, and the ratio of material and liquidthe on the total flavonoids of Anoectochilus roxburghii(Wall) Lindl. effect significantly, the factors affecting the size for the solvent content extraction time the ratio of material and liquidthe extraction temperature.Conclusion: The method can accurately analyze the content of tatol flavonoidsin lotus, fast. Key words: Anoectochilus roxburghii(Wall) Lindl.; Totalflavonoids ; Extraction method;前言金线莲（Wall.）Lindl.Anoectochilus roxburghii为兰科开唇兰属珍稀濒危药用植物，又名金线兰、花叶开唇兰等，民间素有“药王”、“金草”之美誉1，在我国福建、广西、广东、云南和台湾等省份都有分布，具有清热凉血、祛风利湿、降血压等功效。全国最大的金线莲产区是福建省，其产区规模正在逐渐扩大，已成为福建特色中草药之一。金线莲具有很好的药用价值，民间多用于治疗糖尿病、高血脂、乙型肝炎等疾病，由于繁殖率低、生长环境独特、鸟类嗜食等原因，野生金线莲资源日渐枯竭，随着其功效应用的扩大，需求量不断增大，人工培育的金线莲已日渐形成规模2。金线莲中主要成分有黄酮类化合物、甾体类化合物、三萜类化合物、生物碱、糖类、氨基酸、微量元素等，其中黄酮类化合物有槲皮素、异鼠李素、山奈酚，甾体类化合物有豆甾醇、开唇兰甾醇、麦角甾醇、菜油甾醇等，三萜类化合物有木栓酮、琥珀酸、阿魏酸、胡萝卜苷、香豆酸、熊果酸、棕榈酸、齐墩果酸等。自然界存在于金线莲中的总黄酮成分，大部分与葡萄糖或鼠李糖结合成糖苷，少量的为鞣质或游离态存在，所以简单的加乙醇并不能将黄酮类化合物提取出来，故在加提取溶剂的同时，加少量的盐酸，促进黄酮类化合物水解出峰。黄酮化合物一般具有基本骨架结构C6-C3-C6。目前，对黄酮类化合物的研究国内外已比较深入，其定量方法常用HPLC法和UV法，在生产和科研中，对黄酮单体定量常用HPLC法；HPLC法测黄酮含量，根据文献资料甲醇-水-磷酸（52:48:0.04）但峰间距小，不易画基线，对比例进行了调整，随着甲醇比例的减小，峰间距加大分离度加大3。而对于总黄酮的测定，因为UV法具有准确、重复性好、易掌握等优势，所以该法用于测定总黄酮含量最为普遍。UV法常用法有直接测定法和显色测定法。直接测定法是不使用显色剂，根据黄酮自身结构，直接在其特征吸收峰出测定，该方法对于单成分样品测定准确、简便、快速;但对于中草药来说，杂质干扰大，出现误差可能性大，常采用的是碱性条件显色测定法，一般认为直接测定弱于显色测定的结果，且皂苷、多糖对试验均无干扰，但对于此次的紫外测定金线莲则由于植物自身原因，而选择了直接测定法测定总黄酮含量。 对金线莲进行现代应用研究自1990年后才开始，主要集中在组织培养、人工种植、化学成分和药理作用的研究。中国药典中尚未对金线莲进行收载，故做此实验不仅完善金线莲的实验室提取工艺，而且对金线莲在药典中的收载做出些参考。第一章 材料1.1药物和试剂槲皮素（批号 100081-200907,含量96.5%）购自中国食品药品检定研究院；山奈酚（批号 110860-201109,含量99.0%）购自中国食品药品检定研究院；异鼠李素对照品（批号 110861-200808,含量95.9%）购自中国食品药品检定研究院；甲醇、乙醇、磷酸均为分析纯；水为超纯水；1.2 主要仪器Agilent 1100液相色谱仪(安捷伦公司)；HH-6恒温水浴锅(国华电器有限公司)；JY10002电子天平(梅特勒-托利多仪器上海有限公司)；UV-2450紫外分光光度计（日本岛津公司）；超纯水器（MiliQ Direct8）。1.3 供试品金线莲粉末（南平市人民医院提供）第二章 HPLC分析黄酮苷的成分2.1 色谱条件色谱柱为Grace VisionHT C18（250mm4.6mm,5m）,流动相为甲醇-0.04%盐酸（45：55），流速为1mL/min，检测波长为374nm，结果见图1。图1 对照品（A）、供试品（B）高效液相色谱图；1.槲皮素（Quercetin）；2.山柰酚（Kaempferol）；3.异鼠李素（Isorhamnetin）BA2.2检测波长的选择 取槲皮素、山柰酚、异鼠李素对照品在205nm600nm波长范围内进行扫描，结果显示槲皮素在256nm和375nm波长下有最大吸收波长，山柰酚在266nm和371nm波长下有最大吸收波长，异鼠李素在256nm和374nm下有最大吸收波长，见图2，由图2可知，三种物质在256nm-266nm,371nm-375nm波长范围内有最大吸收，371nm-375nm波长的吸收峰明显高于256nm-266nm波长，同时峰形好，且最大吸收波长相对较一致，故选择374nm作为测定波长。图2 对照品紫外扫描图谱1槲皮素；2山柰酚；3异鼠李素；2.3 对照品品溶液的制备精密称取槲皮素3.35mg,山柰酚4.41mg,异鼠李素7.33mg分别置25mL量瓶中，用60%乙醇溶解并定容，分别得对照品储备液（槲皮素129.3g/mL）、(山柰酚169.2g/mL)、(异鼠李素289.9g/mL)，分别精密吸取上述3种溶液各1mL，置于10mL量瓶中，加60%乙醇至刻度，即得混合对照品溶液（槲皮素12.93g/mL、山柰酚16.92g/mL、异鼠李素28.99g/mL）。2.4供试品溶液的制备取样品约0.5g，精密称定，置100mL锥形瓶中，精密加入甲醇25mL、盐酸1.5mL，于水浴中回流1.5小时，放冷，过滤，取续滤液，即得。2.5线性关系考察取混合对照品溶液，分别进样1L、2L、5L、10L、20L，以质量为横坐标（X）、峰面积为纵坐标（Y）绘制标准曲线，结果见图3。槲皮素、山柰酚、异鼠李素的线性范围分别为：12.95258.6ng; 16.92338.4ng； 28.99579.8ng。图3 混合对照品标准曲线第三章 紫外法测定总黄酮含量3.1对照品的确定对续滤液的NaNO2-Al(NO3)3-NAOH的显色处理后颜色比未显色续滤液浅，且发现金线莲相关文献内未有有芦丁的记载，故对槲皮素、山柰酚、异鼠李素进行紫外200nm-800nm的波长扫描，60%乙醇作为空白，三者波形相似，在256nm左右和375nm左右波长有最大吸收峰，处于易获得和低成本的考虑，选用槲皮素作为对照品。3.2测定波长的选择 精密称取适量的槲皮素对照品，60%乙醇溶解，作为对照品溶液；精密称取1.0g金线莲粉末，用60%乙醇50mL水浴回流3小时，在205550nm波长范围内进行扫描，并导出测定波长的选择，结果见图4、5。图4 对照品零阶（A）、一阶（B）、二阶（C）导数光谱图图5 供试品零阶（A）、一阶（B）、二阶（C）导数光谱图ACBB由图4可知，对照品在对照品在256nm和375nm处零阶图谱有最大值，一阶图谱过零点，二阶图谱分别有过零点和最小值，且振动有规律，得对照品在256nm和375nm处有最大吸收波长；由图5可知供试品在256nm和375nm处零阶导数图谱有最大吸收值，一阶导数图谱分别有过零点和最小值，二阶图谱都有最小值但256nm点无振动规律，375nm点振动有规律，且256nm波长处检测波不稳定，故选择375nm作为最佳吸收波长。3.3不同提取方法的考察3.3.1 不同提取方法对含量的影响精密称取金线莲粉末1.0g,加60%乙醇提取，结果见表1和图6。表1 不同提取方法对含量的影响方法索氏提取法回流法超声提取法温浸法冷浸渍法取样量/g1.00011.00171.00191.00201.0004WL3750.2251.2911.0421.1641.084WL2560.540.5190.3920.4370.404溶剂含量60%60%60%60%60%提取时间3小时3小时0.5小时6小时24小时料液比10050505050提取温度每秒2-3滴回流.95C每秒2-3滴回流,95C20C60C20C图6 不同提取方法的吸光度比较由表1和图3可知，在不同提取方法提取条件达到较好的情况下，回流法的提取效果最佳，且从提取时间实际情况考虑，可作为实验室提取金线莲黄酮类成分的首选方法。3.3.2 溶剂类型和溶剂含量对吸光度影响的考察 精密称取金线莲粉末0.2g，置锥形瓶中，加浓度不等的乙醇和甲醇95C水浴回流2小时，放冷过滤，取续滤液3mL在25mL容量瓶中，60%乙醇稀释至刻度线，在紫外375nm和256nm测定吸收值,结果见表2、图7和表3、图8。表2 乙醇浓度对吸光度影响测试结果乙醇浓度/%0%20%40%60%80%100%取样量/g0.20430.20730.20010.20170.20390.2047吸光值375nm0.0520.0740.0910.1170.2380.213吸光值256nm0.2190.2530.2680.2850.3320.218图7 乙醇浓度对吸光度影响测试结果图表3 甲醇浓度对吸光度影响测试结果甲醇浓度/%0%20%40%60%80%100%取样量/g0.19940.19950.19880.20210.20640.2030吸光度256nm0.2170.2760.5220.3180.3010.302吸光度375nm0.0430.0900.1610.1120.1110.243图8 甲醇浓度对吸光度影响测试结果图由表2、图4和表3、图5可知，甲醇、乙醇浓度对提取液吸光度影响较大，乙醇浓度0-60%和甲醇浓度60-100%供试品吸光值基本保持不变， 80%乙醇的最大吸收值和40%甲醇最大吸收值相近，而乙醇无毒易得，相比较下，乙醇比甲醇更适合作提取溶剂。3.3.3 料液比对含量影响的考察精密称取金线莲粉末0.2g，用80%乙醇25mL水浴95C回流2小时，放冷过滤，取续滤液3mL置25mL容量瓶中，80%乙醇定容至刻度线。375nm和256nm紫外分光光度法测定,结果见表4和图9。表4 料液比对含量影响的测试结果溶剂体积/mL102030405060取样量/g0.20360.20210.20050.20350.20170.2067吸光度375nm0.6510.470.3740.3080.2380.207吸光度256nm1.2780.7330.50.4020.3080.267图9料液比对含量影响的测试结果图由表4和图6可知，随着料液比的增大，吸光度也在增大。料液比在50-200之间，吸光度在逐渐上升，而其在200-300之间，吸光度保持基本不变。3.3.4 提取温度对含量的影响精密称取金线莲粉末0.25g，用80%乙醇25mL加热回流2小时，放冷过滤，取续滤液3mL置25mL容量瓶中，80%乙醇定容至刻度线。375nm和256nm紫外分光光度法测定，结果见表4和图10。表4提取温度对含量影响的测试结果提取温度/C70C80C90C100C取样量/g0.24650.25600.25450.2511吸光度375nm0.5690.4660.5050.555吸光度256nm0.7090.7160.7030.749图10 提取温度对含量影响的测试结果图由表4和图7可知，温度从70-80C呈现下降的趋势，而温度从80-100C呈现的是上升的趋势，因此温度在70C为四个值中的最佳提取温度。3.3.5 提取时间对含量的影响精密称取金线莲粉末0.25g，加80%乙醇25mL在100C水浴回流不等时间，在375nm和256nm紫外下检测吸光值，结果见表5和图11。表5提取时间对含量影响测试结果时间/h0.511.5234取样量/g0.25590.25610.25080.24760.25610.2495吸光度375nm0.5660.5810.3840.5100.560.629吸光度256nm0.7460.7350.6310.7120.7730.773图11 提取时间对含量影响测试结果图由表5和图8可知，随着时间的变化0.5-1.5小时吸光值在下降，1.5-4小时吸光值在逐渐上升，在1.5小时处，为提取值最低点，提取时间和吸光度并未成比例关系。从表看来，提取时间越久越好，但从实验室的效益和可行性来看，1小时为最佳提取时间。3.4 对照品的制备精密称取槲皮素对照品11.98mg置25mL量瓶中，用60%乙醇溶解并定容，得对照品储备液（槲皮素479.2g/mL），精密吸取上述溶液1mL，置于25mL量瓶中，加60%乙醇至刻度，即得对照品溶液（槲皮素19.17g/mL）。3.5 供试品的制备精密称取金线莲粉末约0.2g，置锥形瓶中，精密加入80%乙醇60mL于100C水浴回流1小时，冷却，过滤，精密量取续滤液3mL置25mL量瓶中，80%乙醇稀释至刻度线，另用80%乙醇做空白溶液,375nm波长测定总黄酮含量。3.6 标准曲线的制备减量称量法称取1.2mg槲皮素置25ml容量瓶中，60%乙醇溶解并定容，分别吸取0mL,1mL,2mL,3mL,4mL,5mL,6mL置于25ml容量瓶中，用同溶剂定溶，定溶液做为空白溶液。在375nm做标曲，结果见图12。图12 槲皮素标准曲线第四章 方法考察4.1 稳定性试验取混合对照品溶液和样品溶液分别在0、2、4、8、16、24小时后HPLC测定含量，结果见表6,7，表明对照品和样品在24h内稳定。表6 混合对照溶液稳定性试验结果组分时间/h峰面积/mAu平均值/mAuRSD/%槲皮素0545.76538.741.542541.754542.236540.148542.3116538.4124520.61山柰酚0613.98604.831.242611.354612.456601.328600.1116598.9824595.67异鼠李素0720.43710.501.132717.334712.456713.488709.3916703.1224697.29表7 供试品溶液稳定性试验结果组分时间/h峰面积/mAu平均值/mAuRSD/%槲皮素0249.36243.352.042245.134246.236245.398246.1216241.4424233.78山柰酚057.9855.82.84257.23456.11655.99855.191654.982453.12异鼠李素0495.29491.610.972494.114496.236493.998490.3616488.5524482.75取3.1项下对照品溶液和3.2项下供试品溶液于不同时间375nm波长测定黄酮含量，结果见表8、9。由表可知，黄酮含量随着放置时间延长，吸光值呈现上升趋势，在135min内RSD为2.297%,表明对照品溶液在135min内稳定，而供试品溶液在125min内RSD为4.643%,表明供试品溶液在125分钟内稳定。表8 对照品稳定性试验结果放置时间（min）吸光值（mAu）浓度（g/mL）RSD(%)00.88120.6362.29750.87920.589100.8820.612150.87920.589250.87920.589350.8820.612550.88420.706750.89721.011950.91121.3391150.92421.6441350.93521.901表9 供试品稳定性试验结果放置时间（min）吸光值（mAu）浓度（g/mL）RSD(%)00.1493.4824.64350.1473.435100.1483.459150.1473.435250.1473.435350.1483.459450.1503.506650.1533.717850.1573.9981050.1624.3021250.1684.6304.2 精密度试验将混合对照品溶液重复进样5次，每次10L，结果见表10，说明HPLC仪器精密度良好。表10 HPLC精密度试验结果组分峰面积/mAu平均值/mAuRSD/%槲皮素540.69549.79541.98539.91545.23543.520.75山柰酚615.78612.45604.13619.23614.67612.6521.12异鼠李素713.97707.45718.24701.01720.13712.161.11 将3.9项下供试品溶液重复测定5次，结果见表11。说明UV仪器精密度良好。表11 UV精密度测试结果NO吸光值/mAu平均值/mAuRSD/%10.1800.1810.4620.18130.18240.18150.1804.3 重复性试验 取同一样品5份，每份约0.5g，精密称定，按2.4项下方法制备，按2.1项下色谱条件测定，结果见表12，表明重复性良好。表12 供试品溶液重复性试验结果组分取样量/g含量（g/g）平均含量（g/g）RSD/%槲皮素0.5029139.24138.110.760.4978136.420.5063138.330.5034137.980.5073138.56山柰酚0.502943698436.770.530.4978432.790.5063438.220.5034437.390.5073438.49异鼠李素0.502937.9637.562.420.497836.230.506338.120.503437.030.507338.45取同一样品5份，每份约0.2g，精密称定，按3.2项下方法制备，结果见表13，表明重复性良好。表13 重复性试验测定结果NO取样量（g）总黄酮含量（mg/g）平均含量（mg/g）RSD(%)1O.20192.1732.1682.620.20452.18530.20552.19440.19482.07350.20682.2174.4 加样回收率精密称取样品5份，每份约0.25g，精密加入照品储备液（山奈酚）稀释2倍后1mL, 照品储备液（山奈酚）稀释10倍后1mL,对照品储备液（异鼠李素）1mL，按2.4项下方法制备，按2.1色谱条件测，结果见表14。表14林下金线莲黄酮类成分回收率组分取样量/g样品含量/g加入量/g测得量/g回收率/%平均回收率/%RSD/%槲皮素0.25780.24970.25630.24770.253471.57169.32271.15468.76770.34964.6564.6564.6564.6564.65135.984133.649134.922131.783133.92599.6399.5098.6497.4798.3498.720.90异鼠李素0.25780.24970.25630.24770.2534225.176218.101223.866216.354221.333289.9289.9289.9289.9289.9510.336507.02508.876500.589507.25698.3699.6698.3198.0498.6398.600.64山柰酚0.25780.24970.25630.24770.253419.39718.78819.28418.63719.06616.9216.9216.9216.9216.9236.02435.39636.01235.10835.56498.2798.1698.8797.3597.5198.030.63精密称取样品5份，每份约0.2g，精密加入对照品储备液5mL，按3.2项下方法制备，375nm波长测定含量，结果见表15。表15 回收率试验结果NO取样量（g）测得量（mg）样品含量（mg）槲皮素加入量（mg）回收率（%）平均回收率（%）RSD(%)10.20194.4742.1692.39696.202 96.327 1.6220.20334.4982.1872.39696.452 30.20584.5012.2212.39695.159 40.19884.5112.1422.39698.873 50.20634.4892.2142.39694.950 第五章 结果5.1样品测定不同生长环境的金线莲按2.3的方法制备供试品溶液，进行HPLC含量测定，每份样品取平行对照，含量按外标法进行测定，数据见表16。表16 不同生长环境金线莲样品含量生长环境含量（g/g）总量（g/g）槲皮素山柰酚异鼠李素林下种植277.128.8773.812.23859.1024.741210.03大棚种植440.478.40109.350.851434.9745.401984.79组织培养109.202.7317.730.54167.580.74294.51野生232.896.2133.671.42367.6619.63634.225.2 正交试验结果和分析通过预实验考察了提取方法、提取溶剂、提取溶剂含量、料液比、提取时间、提取温度等单因素的影响，从2项下选取了考察点，制定了4因素4水平的正交试验表，结果见表17、表18、表19。表17 金线莲正交试验表提取温度/C料液比/mL提取时间/h乙醇比例/%误差e含量(mg/g)ABCDE11(70)1(30)1(1.0)1(60)15.619 21(70)2(40)2(1.5)2(70)27.608 31(70)3(50)3(2.0)3(80)39.769 41(70)4(60)4(2.5)4(90)411.801 52(80)1(30)2(1.5)3(80)411.532 62(80)2(40)1(1.0)4(90)312.574 72(80)3(50)4(2.5)1(60)26.683 82(80)4(60)3(2.0)2(70)110.556 93(90)1(30)3(2.0)4(90)211.883 103(90)2(40)4(2.5)3(80)111.345 113(90)3(50)1(1.0)2(70)410.758 123(90)4(60)2(1.5)1(60)36.528 134(100)1(30)4(2.5)2(70)36.272 144(100)2(40)3(2.0)1(60)45.567 154(100)3(50)2(1.5)4(90)112.233 164(100)4(60)1(1.0)3(80)210.774 表18 正交方差分析表方差来源偏差平方和Si自由度fi方差ViF值Fa显著性A9.41433.1382.505F0.05(3,3)=9.28*B3.21331.0710.855F0.01(3,3)=29.46*C1.64430.5480.437D83.077327.69222.101误差e3.75931.253表19 正交试验极差分析表提取温度A料液比B提取时间C乙醇比例Dk18.6998.8279.9316.099k210.3369.2739.4758.799k310.1289.8619.44410.855k48.7129.9159.02512.123优水平A2B4C1D4Rj1.6371.0880.9066.024主次顺序DABC由表6、7、8可知，四个因素对总黄酮含量影响显著，极差Rj最大为提取温度的影响，金线莲的最佳提取工艺为:D4 A2 B4 C1,即90%乙醇60mL在80C水浴回流1个小时。四个因素的重要顺序为DABC。第六章 讨论HPLC法测定福建南平来自不同生长环境金线莲黄酮类成分含量，数据分析表明，大棚种植林下种植野生组织培养。在不同环境下生长的金线莲，野生和组织培养的山奈酚含量较林下种植和大棚种植少，而且林下种植和大棚种植黄酮类成分普遍高很多，林下种植-大棚种植-组织培养-野生，山奈酚而言比例约为8:11:20:30，槲皮素比例