缺血再灌注损伤与细胞凋亡.ppt

缺血再灌注损伤与细胞凋亡,(Apoptosis),美国科学情报研究所（ISI）1997年SCI（Science Citation Index）收录及引用论文检索，全世界自然科学研究中论文发表最集中的三个领域分别是： 细胞信号转导（signal transduction）； 细胞凋亡（cell apoptosis）； 基因组与后基因组学研究（genome and post-genomic analysis）。,内 容,细胞凋亡的概念及其生物学意义 细胞凋亡的形态学和生物化学特征 细胞凋亡的分子调控机理 细胞凋亡与疾病 缺血再灌注损伤 缺血再灌注损伤与细胞凋亡研究,细胞凋亡(Apoptosis),早在1972年Kerr等已发现从细胞形态、超微结构和生化变化等方面来分析，细胞有二种死亡形式,一种是早被熟知的细胞坏死（Necrosis），另一种是新提出的程序性细胞死亡（Programmed cell death, PCD）学说。但该学说到九十年代初才进入研究高潮，进展极快，现在普遍称之为细胞凋亡（Apoptosis） 细胞凋亡由体内外因素触发细胞内预存的死亡程序而导致的细胞死亡过程 是一个由基因调控的细胞主动结束生命的过程,细胞凋亡与细胞坏死的区别,坏死 凋亡,1.性质,2.诱导因素,强烈刺激，随机发生,较弱刺激，非随机发生,3.生化特点,4.形态变化,6.DNA电泳,5.炎症反应,7.凋亡小体,8.基因调控,被动过程，无新蛋白合成，不耗能,主动过程，有新蛋白合成，耗能,细胞结构全面溶解、破坏、细胞肿胀,胞膜及细胞器相对完整细胞皱缩，核固缩,弥散性降解，电泳呈均一DNA片状,DNA片段化（180-200bp），电泳呈“梯”状条带,溶酶体破裂，局部炎症反应,溶酶体相对完整，局部无炎症反应,有,病理性，非特异性,生理性或病理性，特异性,无,有,无,例如 蝌蚪尾的消失 脊椎动物的神经系统的发育 发育过程中手和足的成形过程,细胞凋亡的生理意义,确保正常发育、生长 维持内环境稳定 发挥积极的防御功能 细胞凋亡是正常的生理过程，但是凋亡可能会引起疾病发生。因此，近年来对于细胞凋亡的研究，已成为自然科学界的关注热点。,形态学特征,凋亡的起始：细胞器、染色质等开始变化 凋亡小体的形成：质膜包裹染色质和细胞器 凋亡小体的消化：被吞噬细胞消化,生物化学特征,胞浆内Ca2+浓度升高。 细胞内活性氧增多。 质膜通透性变大。 DNA内切酶活性被激活升高，双链DNA在核小体之间切断形成180200bp为基数的有序片段。 型谷氨酰胺转移酶和需钙蛋白酶（Calpain）活性升高。,典型凋亡细胞DNA琼脂糖凝胶电泳呈现梯状条带,细胞因子：IL-2，神经生长因子 某些激素 某些二价金属阳离子、药物,凋亡相关因素,诱导性因素：,激素和生长因子失衡 理化因素：高温、强酸、强碱、抗癌药物 免疫性因素 微生物学因素：细菌、病毒,抑制性因素,凋亡的基因调控,抑制凋亡基因：Bcl-2，EIB， IAP 促进凋亡基因：P53，Bax，ICE 双向调控基因：c-myc，Bcl-x,Caspase家族 凋亡的执行者 Caspase活性位点是半胱氨酸，裂解靶蛋白位点是天冬氨酸残基后的肽键，因此称为Cysteine aspartic acic specific protease，即Caspase 特点：前体形式存在, 级联反应 作用： 灭活凋亡抑制物 水解蛋白质结构，形成凋亡小体 水解凋亡相关活性蛋白,使抑制凋亡因子失活，如CAD/ICAD 破坏细胞结构，如Lamina 将调节区与催化区分离，使蛋白失活，如Gelsolin,Caspase 如何杀死细胞？,细胞凋亡的途径,细胞凋亡发生的时间过程,细胞凋亡不足： 肿瘤，自身免疫病 细胞凋亡过度： 心肌缺血，心力衰竭，神经元 退行性疾病，病毒感染,凋亡与疾病,NATURE CELL BIOLOGY VOL 4 JUNE 2002,细胞凋亡与肿瘤,细胞凋亡在疾病防治中的意义 可以通过不同的手段在不同的阶段进行干预而治疗疾病 合理利用凋亡相关因素 干预凋亡信号转导 调节凋亡相关基因 控制凋亡相关酶学机制,动脉粥样硬化与细胞凋亡,人AS冠状动脉和颈动脉病变内膜中TUNEL细胞数(346%)明显高于无病变的内膜(83%)；AS斑块中可检出核苷酸片段，而无AS的血管未检出此种片段。 Han等观察35例人AS冠状动脉标本，25例证实有细胞凋亡。 Isner等报道人原发性AS病变中细胞凋亡检出率：冠状动脉29%，周围动脉未为43% 动物实验也证明AS斑块中有细胞凋亡发生,Hegyi等研究提示AS发病中某些细胞的增殖和凋亡活性都是增高的 细胞凋亡可能是AS病变中细胞死亡的主要方式，SMC凋亡失调和凋亡小体消除不足可能是加剧AS发展的重要因素 AS病变中细胞凋亡发生率虽然较低，但可致细胞数减少并贯穿于整个病变发展过程中 纤维帽中细胞凋亡增加可降低斑块稳定性而致急性临床事件发生,高血压病,Hemet等报道，遗传性高血压病鼠的心、脑、肾组织中实质细胞凋亡增多 凋亡诱导剂对自发性高血压病大鼠主动脉SMC的作用明显强于正常血压鼠，提示原发性高血压病的发病和高血压所致靶器官损害的机制可能与细胞凋亡有关。 心脏压力符合增加可诱发心肌细胞凋亡增加，随后发生心肌肥大，说明凋亡可能参与高血压心室重构的发病过程。,心肌病和心肌炎,原发性心肌病终末期心衰患者心肌中脱氧核糖核酸酶水平升高 快速起搏心室导致的扩张型心肌病狗心肌中Fas表达增加，心肌细胞凋亡增加 上述研究提示，心肌细胞凋亡可能是心肌病中心肌细胞数减少的主要机制，病毒性心肌炎可能是通过激发心肌细胞凋亡进而发展成心肌病的,心律失常,James用电镜观察了从反复发作室性心率失常伴晕厥的长 QT综合症患者切除下来的窦房结，发现有典型的细胞凋亡，认为其心率失常反复发作可能是细胞凋亡反复发生所致 房室交界区组织的细胞凋亡在维持心电稳定方面起有益作用，但如果细胞凋亡过渡或不足则会引起有害作用,房室结的残存性胎块(persisting fetal pocket)退化清除不全可能使残留的肌细胞具有异常搞的兴奋性而产生自律性心率失常 胎儿出生后如果房室结组织退化消除过度，则会导致正常房室传导途径的中断 有人观察到，心率失常患者致心率失常的内膜下心肌有凋亡现象。故细胞凋亡失平衡可能是某些心率失常的发病基础,心力衰竭,心肌细胞凋亡参与心衰的心肌重构，是心衰发病学上的新观点。在扩张性心肌病和缺血性心脏病的充血性心衰患者和动物均已证实有心肌细胞凋亡。心肌细胞凋亡使心肌数目逐渐减少，纤维化进行性加重，从而心功能不全进行性发展,缺血再灌注损伤,缺血组织恢复血液灌注后反而引起损伤加重的现象。 1935年tennant和wiggers室颤与再灌注 1943年harris再灌注心率失常概念提出 1960年jennings心肌再灌注损伤概念提出 1980年以来再灌注损伤研究兴起,再灌注损伤与临床,冠脉解痉（心绞痛扩冠后） 心脑血管栓塞再通（介入治疗、溶栓治疗、自然再通） 心肺手术体外循环后心肺复苏 各种动脉搭桥术 断肢再植、器官移植,缺血再灌注损伤发生机制,自由基损伤 1979年fridovich 钙超载 1966年zimmerman和hulsmann 白细胞介导损伤 1984年mullane,什么是自由基,自由基是指外层轨道上具有一个或多个不配对电子的原子、原子团或分子的总称。 自由基主要包括：脂自由基、氧自由基 由氧衍生的自由基叫氧自由基。 氧自由基与多聚不饱和脂肪酸作用后生成的中间代谢产物烷自由基、烷氧自由基、烷过氧自由基等均属脂自由基,活性氧代谢物,是氧的一些代谢产物和其衍生的含氧物质，由于均含有氧，化学性质活泼，成为ROS,氧自由基的清除,生理情况下，仅有少量氧自由基生成，同时细胞内存在有SOD、谷胱甘肽过氧化物酶以及过氧化氢酶等抗氧化酶类可以及时清除它们 维生素E、C、半胱氨酸、谷胱甘肽等也有助于清除自由基 朝氧化物岐化酶的种类,缺血再灌注时自由基的来源,黄嘌呤氧化酶形成增多 中性粒细胞呼吸爆发 线粒体呼吸链电子传递异常 儿茶酚胺的自身氧化 花生四烯酸代谢,自由基的损伤作用,膜脂质损伤 蛋白质损伤 核酸损伤 细胞成分间的广泛交联 炎症介质产生,钙超载 1966年zimmerman,细胞内Ca2+大量聚集超过正常限量的现象叫钙超载。 钙超载发生机制： Na+- Ca2+交换增加 细胞膜通透性增高， Ca2+内流 线粒体受损，钙泵转运障碍,Na+- Ca2+交换增加,缺血缺氧时能量供应不足，钠泵转运障碍，胞内Na+浓度升高。 缺血期无氧代谢，酸性代谢产物积聚，细胞内pH降低(酸中毒)，再灌注时细胞外H+迅速带走，形成细胞内外H+浓度梯度，Na+-H+交换，使胞内Na+增加。 再灌注时随血液带来大量Ca2+，通过Na+- Ca2+交换机制使细胞外钙大量内流而造成细胞钙超载,细胞膜通透性增高， Ca2+内流,Na+- Ca2+交换使胞内钙增加，进而激活磷脂酶，降解膜磷脂，提高细胞膜通透性，形成恶性循环。 再灌注时氧自由基大量产生，引发细胞膜的脂质过氧化，膜受损，通透性增高。,线粒体受损，钙泵转运障碍,缺血时线粒体结构的功能障碍出现最早，再灌注损伤加重，ATP生成障碍。ATP减少使肌膜及肌浆网膜钙泵功能障碍。钙泵不能排出和摄取胞浆中过多的钙，胞浆中游离钙浓度增加而钙超载。胞浆中过多的钙最终形成磷酸盐沉积于线粒体，对线粒体结构及功能进一步破坏。,钙超载损伤的机制,导致线粒体功能障碍，ATP生成减少 Ca2+激活磷脂酶，促进膜磷脂水解，造成细胞膜及细胞器质膜受损 引起心率失常，通过Na+- Ca2+交换形成一过性内向离子流，在心肌动作电位后形成短暂除极（迟后除极）而引起心率失常。,4. 促进氧自由基生成：钙超负荷使钙敏蛋白水解酶活性增高，促使黄嘌呤脱氢酶转变为黄嘌呤氧化酶，使自由基生成增加。 5. 使肌原纤维挛缩、断裂：生物膜机械损伤，细胞骨架破坏,白细胞介导损伤 1984年mullane,中性粒细胞再灌注区增多的的机制,中性粒细胞再灌注区增多的的机制,心脏缺血期，血管内皮损伤，释放PAF、LTB4、补体等活性物质，对中性粒细胞起趋化作用。再灌注后，自由基可以引起内皮细胞膜磷脂降解，花生四烯酸代谢产物增多，起趋化作用。,中性粒细胞再灌注区增多的的机制,白细胞本身释放具有趋化作用的炎性介质，如PAF、LTB4等，使微循环中白细胞进一步增加。,中性粒细胞再灌注区增多的的机制,自由基和各种炎症介质诱导内皮细胞和白细胞表面粘附分子表达，促进二者相互作用。如imegrin，selectin、intracellular adhesion molecule，从而使中性粒细胞粘附、聚集、游离出血管进入组织，,白细胞与内皮细胞的相互作用,滚动（rolling）：在趋化因子作用下，白细胞大量随血流到达再灌注区，白细胞表面的L-selectin 与内皮细胞表面P-selectin、E-selectin作用，白细胞流动速度下降，在血管内皮表面发生滚动。,粘着（adherence）：白细胞表面imegrin CD11/CD18与内皮细胞表面intracellular adhesion molecule相互作用，使滚动停止，白细胞与内皮粘着固定。 白细胞通过内皮进入组织间。,白细胞在缺血-再灌注损伤中的作用,释放自由基 被激活的中性粒细胞脱颗粒，大量释放蛋白水解酶类如弹性蛋白酶、胶原酶、磷脂酶、脂氧酶等。,白细胞活化，产生PAF、LTB4、TNF-、IL-1、IL-8、IFN-等炎症介质 引起无复流现象（当缺血组织恢复血液供应后，部分缺血区组织并不能得到充分的血液灌流，成为无复流）。,各器官的再灌注损伤,心脏缺血再灌注损伤 脑缺血再灌注损伤 肠缺血再灌注损伤,心脏缺血再灌注损伤,代谢改变 超微结构变化 临床表现,代谢改变,ATP、CP大量分解，能量供应不足 ATP分解产物聚集、流失：AMP、肌苷、腺苷、次黄嘌呤 酸性代谢产物聚集，细胞内酸中毒 细胞内Na+、Ca2+增多，细胞水肿,超微结构改变,细胞肿胀，膜结构破坏 线粒体损伤：极度肿胀、嵴断裂、溶解，空泡形成、基质内致密物增多。 心肌挛缩，出现过度收缩带（肌纤维过度收缩，肌节明、暗带分界不清，粗细肌丝过度重合）甚至肌丝断裂、溶解，肌原纤维结构破坏,临床及大体表现,心脏功能下降-心肌顿抑 再灌注心率失常：室性心动过速、室颤 心肌细胞死亡-心肌梗塞 细胞坏死 细胞凋亡,心肌顿抑,指心肌短暂缺血后，当冠脉血流恢复正常或接近正常时，心肌形态和超微结构正常，但心功能和心肌代谢异常却长时间持续存在的状态。缺血后心室功能障碍“缺血心肌血流恢复与机械功能恢复不匹配”。,特点： 发生于短时缺血(2-20min)再灌注后 心功能障碍是可逆的 局部心肌血流正常或几乎正常 心肌局部能量物质储备降低,机制： 氧自由基损伤 钙超载 心肌能量(缺氧)利用障碍 冠脉内皮细胞功能失调 热休克蛋白释放,心肌冬眠,指由于冠状动脉血流减少或/心肌需氧量增加，引起静息时左室功能持久性减退，当心肌再灌注或氧需求减少，氧供求重新恢复平衡后，心肌功能可完全恢复正常的现象。 心肌血流与机械功能的低匹配。,特点： 持续性收缩功能障碍 心功能障碍是可逆的 降低的心肌血流尚足以维持组织存活 糖代谢正常甚至略有增高,机制 建立侧枝循环 心肌低代谢：心脏缺血后，心肌通过主动调节机制降低心功能，进而降低缺血心肌对代谢底物的需求量。此时残余血流所能提供的营养物甚至可以超过心肌对代谢底物的需求量，能量物质产生大于消耗，而防止心肌坏死。,多发生在冠脉搭桥手术前后，是一种心肌的保护性机制。 主要特征：血流减少不严重但持续时间长的供养量减少，心肌需要亦随之减少，在低水平维持一个脆弱得到心肌代谢平衡，即维持最低的功能状态。，继之则会引起缓慢的心肌功能失代偿表现。,当冠脉血供改善或心肌需氧量降低达到供需平衡时，心肌可能部分或全部恢复。 心肌顿抑需与心肌缺血或梗塞过程中的收缩功能异常相区别：顿抑的心肌在血流恢复后，功能可以恢复，但坏死的心肌不能恢复。,脑的缺血再灌注损伤,脑一旦缺血时间较长即可引起严重的不可逆损伤。 脑缺血时生物电发生改变，出现病理性慢波，缺血一定时间后再灌注，慢波持续并加重。,脑富含磷脂，缺血后游离脂肪酸明显增加。 大鼠断头1min后脑内游离脂肪酸含量增加2倍以上。 随缺血时间延长持续增加，增加最显著的是花生四烯酸及硬脂酸。,再灌注后游离脂肪酸的增加更为显著，恢复血流90min，反而有更多的游离脂肪酸贮留。 血流重新恢复时游离脂肪酸的增加，是由于来源于