BIORAD-双向电泳中文手册.doc

ProteomicsBio-Rad蛋白质组双向电泳实验操作手册ProteomeWorksTM System双向电泳实验流程l 样品制备（Sample preparation）l 固相预制胶条的水化（IPG strip rehydration）l 第一向等电聚焦（IEF）l 胶条的平衡（IPG strip equilibration）l 第二向SDS-PAGE电泳（SDS-PAGE electrophresis）l 凝胶的染色及检测（Detection/Staining）l PDQuest软件分析（Software analysis）l 质谱鉴定（Protein identification）目录第一章 实验材料11 IPG预制胶条及载体两性电解质12 蛋白质定量试剂盒及其试剂13 试剂盒及其试剂14 化学试剂15 蛋白质Marker16 染色试剂17 注意事项第二章SDS-PAGE聚丙烯酰胺凝胶电泳2. 1 溶液的配制2. 2 SDS-PAGE凝胶的配制2. 3 操作方法2. 4 注意事项第三章双向电泳3. 1 溶液配制3. 2 操作步骤3. 3 注意事项附录1双向电泳完整的操作步骤附录2聚丙烯酰胺凝胶电泳凝胶的配置附录3细胞样品的一般处理步骤附录4组织样品的一般处理步骤第一章 实验材料11 IPG预制胶条及载体两性电解质（一）IPG预制胶条（美国Bio-Rad公司），-20冰箱保存ReadyStrip IPG Strips, pH 310, 7 cm, 163-2000ReadyStrip IPG Strips, pH 47, 7 cm, 163-2001ReadyStrip IPG Strips, pH 310 nonlinear, 7 cm, 163-2002ReadyStrip IPG Strips, pH 36, 7 cm, 163-2003ReadyStrip IPG Strips, pH 58, 7 cm, 163-2004ReadyStrip IPG Strips, pH 710, 7 cm, 163-2005ReadyStrip IPG Strips, pH 310, 17 cm, 163-2007ReadyStrip IPG Strips, pH 47, 17 cm, 163-2008ReadyStrip IPG Strips, pH 310 nonlinear, 17 cm, 163-2009ReadyStrip IPG Strips, pH 36, 17 cm, 163-2010ReadyStrip IPG Strips, pH 58, 17 cm, 163-2011ReadyStrip IPG Strips, pH 710, 17 cm, 163-2012ReadyStrip IPG Strips, pH 310, 11 cm, 163-2014ReadyStrip IPG Strips, pH 47, 11 cm, 163-2015ReadyStrip IPG Strips, pH 310 nonlinear, 11 cm, 163-2016ReadyStrip IPG Strips, pH 36, 11 cm, 163-2017ReadyStrip IPG Strips, pH 58, 11 cm, 163-2018ReadyStrip IPG Strips, pH 710, 11 cm, 163-2019ReadyStrip IPG Strips, pH 3.95.1, 17 cm, 163-2020ReadyStrip IPG Strips, pH 4.75.9, 17 cm, 163-2021ReadyStrip IPG Strips, pH 5.56.7, 17 cm, 163-2022 ReadyStrip IPG Strips, pH 6.38.3, 17 cm 163-2023ReadyStrip IPG Strips, pH 3.95.1, 11 cm, 163-2024ReadyStrip IPG Strips, pH 4.75.9, 11 cm, 163-2025ReadyStrip IPG Strips, pH 5.56.7, 11 cm, 163-2026ReadyStrip IPG Strips, pH 6.38.3, 11 cm, 163-2027ReadyStrip IPG Strips, pH 3.95.1, 7 cm, 163-2028ReadyStrip IPG Strips, pH 4.75.9, 7 cm, 163-2029ReadyStrip IPG Strips, pH 5.56.7, 7 cm, 163-2030ReadyStrip IPG Strips, pH 6.38.3, 7 cm, 163-2031ReadyStrip IPG Strips, pH 310, 18 cm, 163-2032ReadyStrip IPG Strips, pH 310 nonlinear, 18 cm, 163-2033ReadyStrip IPG Strips, pH 47, 18 cm, 163-2034ReadyStrip IPG Strips, pH 36, 18 cm, 163-2035ReadyStrip IPG Strips, pH 58, 18 cm, 163-2036ReadyStrip IPG Strips, pH 710, 18 cm 163-2037ReadyStrip IPG Strips, pH 3.95.1, 18 cm, 163-2038ReadyStrip IPG Strips, pH 4.75.9, 18 cm, 163-2039ReadyStrip IPG Strips, pH 5.56.7, 18 cm, 163-2040ReadyStrip IPG Strips, pH 6.38.3, 18 cm, 163-2041ReadyStrip IPG Strips, pH 310, 24 cm, 163-2042ReadyStrip IPG Strips, pH 310 nonlinear, 24 cm, 163-2043ReadyStrip IPG Strips, pH 47, 24 cm, 163-2044ReadyStrip IPG Strips, pH 36, 24 cm, 163-2045ReadyStrip IPG Strips, pH 58, 24 cm, 163-2046ReadyStrip IPG Strips, pH 710, 24 cm, 163-2047（二）载体两性电解质（美国Bio-Rad公司），4冰箱保存Bio-Lyte 3/10 Ampholyte，40%，10ml 163-1112Bio-Lyte 3/10 Ampholyte，40%，25ml 163-1113Bio-Lyte 3/5 Ampholyte，20%，10ml 163-1132Bio-Lyte 4/6 Ampholyte，40%，10ml 163-1142Bio-Lyte 4/6 Ampholyte，40%，25ml 163-1143Bio-Lyte 5/7 Ampholyte，40%，10ml 163-1152Bio-Lyte 5/7 Ampholyte，40%，25ml 163-1153Bio-Lyte 6/8 Ampholyte，40%，10ml 163-1162Bio-Lyte 6/8 Ampholyte，40%，25ml 163-1163Bio-Lyte 7/9 Ampholyte，40%，10ml 163-1172Bio-Lyte 8/10 Ampholyte，20%，10ml 163-1182Bio-Lyte 5/8 Ampholyte，40%，10ml 163-1192Bio-Lyte 5/8 Ampholyte，40%，25ml 163-1193（三）等电聚焦上样缓冲液（美国Bio-Rad公司），4冰箱保存100ReadyStrip Buffer，for pH 7-10 IPG Strips，1ml163-2093Bio-Lyte 3/10 Ampholyte，100，1ml163-2094100ReadyStrip Buffer，for pH 6.8-8.3 IPG Strips，1ml163-2095100ReadyStrip Buffer，for pH 5.5-6.7 IPG Strips，1ml163-2096100ReadyStrip Buffer，for pH 4.7-5.9 IPG Strips，1ml163-2097100ReadyStrip Buffer，for pH 3.5-5.1 IPG Strips，1ml163-209812 蛋白质定量试剂盒及其试剂Protein Assay Kit I，bovine -globulin standard500-0001Protein Assay Kit II，BSA standard 500-0002Protein Standard I，bovine -globulin，1 bottle500-0005Protein Assay Dye Reagent Concentrate，450ml500-0006Protein Standard II，bovine serum albumin，1 bottle500-0007RC DC Protein Assay Kit I，bovine -globulin standard 500-0121RC DC Protein Assay Kit II，BSA standard500-012213 试剂盒及其试剂ReadyPrep Sequential Extraction Kit 163-2100Tributylphosphine（TBP），200mM，0.6ml163-2101ReadyPrep Sequential Extraction Kit Reagent 1，1vial163-2102ReadyPrep Sequential Extraction Kit Reagent 2，1vial163-2103ReadyPrep Sequential Extraction Kit Reagent 3，1vial163-2104ReadyPrep 2-D Starter Kit 163-2105ReadyPrep 2-D Starter Kit Rehydration/Sample Buffer163-2106ReadyPrep Starter Kit Equilibration Buffer I，with DTT 163-2107ReadyPrep Starter Kit Equilibration BufferII163-2108Iodoacetamide，30g 163-2109E.coli Protein Sample，lyophilized，2.7mg163-2110ReadyPrep Overlay Agarose，50ml 163-211114 化学试剂尿素Urea，250g161-0730尿素Urea，1kg161-0731AG 501-X8（D）Mixed Bed Resin 142-6425CHAPS，1g161-0460CHAPSO，1g161-0465Triton X-100，500ml161-0407DTT（Dithiothreitol），1g161-0610DTT（Dithiothreitol），5g161-0611Tributylphosphine（TBP），200mM，0.6ml163-2101溴酚蓝（Bromophenol Blue），10g 161-0404矿物油（Mineral Oil），500ml 163-2129SDS，25g 161-0300SDS，100g161-0301SDS，1kg 161-0302Tris，100g161-0715Tris，500g161-0716Tris，1kg161-0719Iodoacetamide，30g 163-2109低熔点琼脂糖，25g 161-3111甘氨酸，250g161-0717甘氨酸，1kg161-0718甘氨酸，2kg161-0724丙烯酰胺（Acrylamide），99.9%，100g 161-0100丙烯酰胺（Acrylamide），99.9%，500g 161-0101丙烯酰胺（Acrylamide），99.9%，2kg161-0103丙烯酰胺（Acrylamide），99.9%，1kg161-0107丙烯酰胺（Acrylamide），99.9%，5kg161-0108甲叉双丙烯酰胺（Bis），5g161-0200甲叉双丙烯酰胺（Bis），50g161-0201PDA（Piperazine Diacrylamide），10g161-0202PDA（Piperazine Diacrylamide），50g161-0203过硫酸氨（Ammonium Persulfate），10g 161-0700过硫酸氨（Ammonium Persulfate），100g161-0754TEMED，5ml161-0800TEMED，50ml 161-0801甘油国产或Sigma硫脲Sigma15 蛋白质Marker2-D SDS-PAGE Standards，500ml161-0320SDS-PAGE Standards，high range，200ml161-0303SDS-PAGE Standards，low range，200ml161-0304SDS-PAGE Standards，broad range，200ml161-0317Polypeptide SDS-PAGE Standards，200ml161-0326Precision Protein Standards，unstained，1500ml，150 applications161-0362Precision Protein Standards，prestained，500ml，50 applications161-0372Kaleidoscope Polypeptide Standards，500ml161-0325Kaleidoscope Prestained Standards，broad range，500ml 161-0324Prestained SDS-PAGE Standards，high range，500ml161-0309Prestained SDS-PAGE Standards，low range，500ml161-0305Prestained SDS-PAGE Standards，broad range，500ml 161-0318IEF Standards，pI range 4.45-9.6，250ml 161-031016 染色试剂Coomassie Brilliant Blue R-250，10g161-0400Coomassie Brilliant Blue G-250，10g161-0406IEF Gel Staining Solution，1L 161-0434Coomassie Brilliant Blue R-250 Staining Solutions Kit161-0435Coomassie Brilliant Blue R-250 Staining Solutions，1L 161-0436Coomassie Brilliant Blue R-250 Staining Solutions，41L161-0437Coomassie Brilliant Blue R-250 Destaining Solutions，1L161-0438Coomassie Brilliant Blue R-250 Destaining Solutions，41L 161-0439Bio-Safe Coomassie Stain，1L 161-0786Bio-Safe Coomassie Stain，5L 161-0787SYPRO Ruby Protein Gel Stain，200ml 170-3126SYPRO Ruby Protein Gel Stain，1L 170-3125SYPRO Ruby Protein Gel Stain，5L 170-3138Silver Stain Kit161-0443Silver Stain Plus Kit161-045017 注意事项1.双向电泳中所用的化学试剂纯度要高，至少为分析级。尽量选用进口试剂。2.双向电泳中使用MilliQ水（电导小于1mS）。3.所有包含尿素的溶液加热温度不超过30，否则会发生蛋白氨甲酰化。详细订货信息请参考BIO-RAD中英文目录组织和细胞蛋白样品的制备在进行双向电泳研究前，对于来源于组织或细胞的蛋白必须通过有效的裂解方法使蛋白进入到溶液中，样品制备的成功是保证双向电泳成功的第一步。由于样品的复杂性，有时很难给出一个通用的方法。根据研究者的研究目的的不同，可以采取不同的方法。在某些情况下，可能研究者需要用少量的样品来摸索一种最好的裂解方法。我们在下面给出了比较常用的两种蛋白裂解液的配方，同时伯乐公司也有现成的试剂盒来帮助研究者根据不同的研究目的更好的进行样品的制备。这些试剂盒主要有对样品进行纯化的试剂盒，如去除盐分及其他杂质的ReadyPrep 2D Clean-up Kit和能显著提高碱性蛋白分辨率的ReadyPrep Reduction-Alkylation Kit。总蛋白提取您可以选用ReadyPrep Protein Extraction Kit (Total Protein)；如果您希望能得到更多的蛋白，分步提取蛋白的ReadyPrep Sequence Extraction Kit可能更能满足您的研究目的；如果您进行的是膜蛋白方面的研究，您可以选用ReadyPrep Extraction Kit (Membrane I)和ReadyPrep Extraction Kit (Membrane II)，如果您进行的是信号转导方面的研究，您还可以选用ReadyPrep Extraction Kit (Signal)，如果您研究的蛋白是定位在细胞核或细胞浆中时，您可以选用ReadyPrep Extraction Kit(Cytoplasmic/Nuclear)等。具体的产品信息请您参阅伯乐的生命科学产品目录。ReadyPrep 2-D Kits1 材料和方法如果您没有选用Bio-Rad的ReadyPrep 2-D Kits，我们为您推荐一些蛋白提取的方法，供您参考。1.1 材料1.1.1 组织和细胞的来源：1.1.2 仪器设备机械组织匀浆器低温高速离心机 (40,000 g)超速离心机超生细胞破碎仪超纯水装置1.1. 3 试剂三氯醋酸 (TCA)丙酮二硫苏糖醇 (DTT)尿素CHAPS PMSF（phenylmethylsulfonyl fluoride） EDTA 乙醇磷酸考马斯亮蓝R250 抑肽素A 亮肽素试剂纯度均应是分析纯或以上。1.1.4 溶液配制(1) PBS：NaCl 8 g, KCl 0.2 g, Na2HPO4 1.44 g, KH2PO4，溶800 ml水中，用HCl调pH至7.4，用纯水定容至1 L；(2) EDTA 储存液：18.61 g Na2EDTA2H2O，溶于70 ml纯水中，用10 mol/L NaOH调节pH值至8.0 (约需2 g NaOH颗粒)，定容为100 ml。可高压灭菌后分装备用；(3) 亮肽素（Leupeptin）储存液 (50 g/ml，100) 10 mg/ml溶于水，-75保存；使用时配成50 g/ml储液，-20保存；(4) 抑肽素（Pepstatin A）储存液 (70 g/ml，100) 1 mg/ml溶于甲醇，-75保存；使用时配成70 g/ml储液，-20保存；(5) PMSF（phenylmethylsulfonyl fluoride）储存液 (10 mM, 100):17.4 mg PMSF，溶于1ml异丙醇中，-20 保存。(6) DTT 储存液 (1 M):0.31 g DTT溶于2 ml H2O中，-20 保存 (DTT或含有DTT的溶液不能进行高压处理，可过滤除菌)。(7) 裂解液: 通用蛋白裂解方法Lysis buffer A(9 M urea, 4% w/v CHAPS, 1% w/v DTT, 0.5% CA and a cocktail of protease inhibitors)Final concentrationAmountUrea (FW 60.06, Bio-rad, 99.5%)9 M10.8 gCHAPS (FW 614.89, Bio-rad, 98%4% (w/v)0.8 gUltrapure H2Oto 20 mlprepare fresh or store in aliquots at 20 A cocktail of protease inhibitorsDTT(FW 154.25,Bio-rad)1%13 L/200 L Lysis buffer (15.5stock), -20Lysis buffer B(7 M urea, 2 M thiourea, 4% w/v CHAPS, 1% w/v DTT, 0.5% Ampholyte and a cocktail of protease inhibitors)载体两性电解质（Ampholyte）、蛋白酶抑制剂混合物和DTT在临用前加入。(8) 蛋白酶抑制剂混合物成分终浓度蛋白酶抑制剂混合物PMSF35 g/ml or 1 mMEDTA0.3 mg/ml (1 mM) 抑肽素0.7 g/ml亮肽素0.5 g/ml1.2 方法1.2. 1组织蛋白提取方法（仅供参考）1.3.1.2.1.1 三氯醋酸/丙酮沉淀法 1(1) 冰上取材，称湿重，置液氮中冻存或直接进行下一步；(2) 在液氮中研碎样品或使用机械匀浆器磨碎组织；(3) 将粉末悬浮于含DTT (0.2% w/v)的10%三氯醋酸（w/v）的丙酮溶液中；(4) 蛋白20沉淀过夜；(5) 35 000g (6) 离心30 min；(6) 将沉淀重悬于含0.2% DTT的预冷丙酮中；(7) -20放置1 h；(8) 35 000g (6) 离心30 min；(9) 在通风橱中让丙酮充分挥发，得到干燥的沉淀；(10) 在裂解液中重新溶解沉淀（50-100 mg 组织需要1 ml裂解液）；(11) 15, 40 000g，离心1hr；(12) 用Bradford法测定上清的蛋白浓度，分装后置75保存。注意：通过本法进行样品制备时，蛋白损失会较多，但杂质较少。适合于样品量大，但对2D要求较高的研究人员。1.2.1.2 超速离心法(1) 取材；(2) 用研钵在液氮冷冻条件下将样品研成粉末，每1 g样品加入0.5 ml裂解液，使用组织匀浆器匀浆30 s；(3) 组织悬液15，10 000g离心10 min；(4) 上清液4，150 000g超速离心45 min；(5) 小心避开上层漂浮的脂质层，吸取离心上清6 40,000g再次离心50 min；(6) 取离心上清。Bradford法定量，分装后置75保存。1.2.2 培养细胞蛋白提取1.2.2.1循环冻融法(1) 吸出培养液弃去，0.01 mol/L PBS洗一次；(2) 加入PBS，用细胞刮收集细胞于10 ml离心管中；(3) 500g，离心5 min；(4) 弃上清，PBS洗三次（室温,500 g，5 min），(5) 在离心管中加入1ml PBS，重悬细胞，用1 ml 微量加液器移入Eppendorf管中；(6) 500g 5 min离心；(7) 用200 l 微量加液器吸出PBS，弃去；(8) 吸干残留的PBS，估计样品体积，加入5倍体积裂解液，巴氏滴管混匀，液氮中反复冻融三次(每次置液氮中3 s， 室温融化)，DTT在第一次冻融后加入；(9) 15，40 000g，离心1hr (Biofuge)；(10) 上清Bradford法定量，沉淀-75保存备用。注意：如果培养的细胞量较少时，采用此法能得到较多的蛋白样品。1.2.2.2 超声破碎法(1) 取对数生长期的细胞，吸出培养液弃去，0.01 mol/L PBS洗一次；(2) 加入PBS，用橡胶刮收集细胞于10 ml离心管中；(3) 室温，500 g，离心5 min；(4) 弃上清，PBS洗3次（室温,500 g，5 min）；(5) 在离心管中加入1ml PBS，重悬细胞，用1 ml 微量加液器移入Eppendorf管中，500 g离心5 min；(6) 吸干残留的PBS，估计样品体积，加入5倍体积裂解液，混匀，移入1.5 ml Eppendorf管中，冰浴中以最大功率超声破碎细胞（310 s）；(7) 15, 40 000g，离心1hr (Biofuge)；(8) 上清Bradford法定量，沉淀-75保存备用。2讨论蛋白质提取的基本步骤包括清洗组织或细胞、裂解细胞、离心除去膜组分等获得溶解的蛋白质上清。我们破碎细胞采用循环冻融法和超声波法；破碎组织采用液氮研磨法和机械匀浆法。循环冻融法操作简便，比较适合提取培养细胞的稳定蛋白，我们后期实验对培养细胞主要采取这种破碎方式。使用超声破碎必须注意的是控制强度在一定限度，即刚好低于溶液产生泡沫的水平。因为产生泡沫会导致蛋白质变性，同时要注意散热。匀浆是机体软组织破碎最常用的方法之一。由于匀浆过程中蛋白质被蛋白酶降解的可能性较小，所以匀浆是简便、迅速和风险小的组织破碎方法。需要注意脊髓组织，中枢神经组织富含脂类，采用沉淀法和高速离心法可以使蛋白和脂类干扰物质有效分离，但沉淀法的缺点是再溶解时蛋白损失严重。高速离心的缺点是需要样品量大，如Beckman L7- 65超速离心机的离心管容量为8 ml，不适用小量样品的制备。在众多的裂解液配方中，我们主要采用9 M 尿素, 4% w/v CHAPS, 1% w/v DTT, 0.2% 两性电解质加蛋白酶抑制剂混合物，原因是这一配方经长期使用很稳定，裂解效率也较高，非常适合小量细胞蛋白提取要求。针对富脂的中枢神经组织中脂类物质与蛋白相互作用，高浓度的尿素可以造成强变性条件(但如果再提高尿素浓度，尿素就容易析出，影响蛋白的溶解)，过量的去污剂也可以减少脂类的污染，两性电解质可以提高蛋白的溶解度，同时有利于等电聚焦。早期我们加入Tris碱以防止蛋白的水解，但是由于盐离子的引入，导致IEF电压过低，影响聚焦。为了防止蛋白的酶解，我们使用了一种广谱的蛋白酶抑制剂混合物，成分见本实验1.1.4。2蛋白定量采用比较蛋白质组学方法进行研究，有一个重要的前提是要保证各实验组间的实验条件的一致。因此在实验前应对蛋白进行定量，以保证蛋白上样量一致。考虑到在定量的同时蛋白的降解也在进行，因此需要采用一种快速和相对准确的蛋白定量方法。用于蛋白的快速定量方法主要有A280法、Bradford法、Lowry 法三种方法，其中A280法灵敏度为0.2-2 mg/ml，但核酸可引起强干扰作用；Lowry 法灵敏度为5-100 g/ml，虽相对准确，但干扰物质多且反应速度慢，而且含DTT溶液不宜用此法；Bradford法灵敏度为25-200 g /ml，由于相对干扰物质较少，且反应时间仅需2分钟，故适合用于大多数研究的蛋白定量。21 测量方法测量前，用2.5 g/l-15 g/l之间的BSA标准溶液按下述同样的步骤进行测量，并制作标准曲线。每个样品及标准溶液均测量三次，取其平均值。1 取适量样品溶液，以裂解液稀释至合适浓度；2 取上述已稀释的蛋白样品100 l，加入1 ml Bradford工作液并震荡混匀；3 2分钟后测A595值。根据制作的标准曲线和A595值计算样品的蛋白浓度。一般来说，在每次定量前都应该进行标准曲线的制作，才能保证有可靠的结果。Bio-Rad有专门用于蛋白测定的试剂盒，其中Quick Start Bradford Assay Kit可以和SmartSpec Plus Spectrophotometer进行蛋白的准确定量。如果您有Bio-Rad的酶标仪，还有一种简单的测定总蛋白浓度的比色测定方法，即可以采用Bio-Rad Protein Assay Kit进行蛋白定量。Bio-rad另有对一种适用于去垢剂增溶蛋白样品的比色测定的试剂盒DC Protein Assay Kit，该方法类似于常规的Lowry方法，但经过改良后，节省了操作时间。DC蛋白测定只需要15分钟的温育时间，而且吸收值读数保持2小时的稳定。RC DC Protein Assay Kit蛋白测定是一种适用于含还原剂和去垢剂的蛋白测定，具有原来DC蛋白测定的特点，并能与更多的试剂兼容，简化了复杂蛋白样品溶液的定量测定。具体商品信息，也请您参阅生命科学产品目录。 Quick Start Bradford Protein Assay Kit Bio-Rad Protein Assay Kit SmartSpec Plus Spectrophotometer DC Protein Assay Kit RC DC Protein Assay Kit第二章 SDS-PAGE聚丙烯酰胺凝胶电泳2. 1 溶液的配制30% 聚丙烯酰胺贮液丙烯酰胺150g甲叉双丙烯酰胺4gMilliQ水500ml滤纸过滤后，棕色瓶4冰箱保存。1.5mol/L Tris碱 pH8.8Tris碱90.75gMilliQ水400ml用1mol/L HCl调pH至8.8，加MilliQ水定容至500ml。4冰箱保存。0.5mol/L Tris碱 pH6.8Tris碱12gMilliQ水120ml用1mol/L HCl调pH至6.8，加MilliQ水定容至200ml。4冰箱保存。10% SDSSDS10gMilliQ水100ml混匀后，室温保存。10% ApAp0.1gMilliQ水1ml（用时加水溶解）溶解后，4冰箱保存。10电泳缓冲液（1= 25mM Tris，192mM glycine，0.1% SDS，pH8.3）Tris碱30g甘氨酸144gSDS10gMilliQ水1L混匀后，室温保存。2SDS-PAGE上样缓冲液0.5M pH6.8 Tris碱2.0ml10% SDS4.0ml甘油2.0ml1% 溴酚蓝0.05mlMilliQ水定容至10mlDTT0.154g（用时现加）改进的考染：磷酸：100ML/100ML水硫酸胺100G12G G250加水到800ML加甲醇200ML2. 2 SDS-PAGE凝胶的配制参见附录1。2. 3 操作方法1. 将玻璃板洗净、晾干、固定。2. 按照实验要求，配制不同浓度的分离胶。将分离胶注入玻璃板夹层中，上部用MilliQ水、乙醇或水饱和正丁醇封面，保持胶面平整，待分离胶聚合后，配制浓缩胶。3. 配制好浓缩胶后，倒去分离胶表面的少量水分，然后灌入浓缩胶，插入点样梳。4. 将待分析鉴定的蛋白质样品，加入等体积2SDS-PAGE上样缓冲液，100水浴3-5分钟（插入冰浴冷却后加样）。5. 在电泳槽加入电泳缓冲液后，小心拔去上样梳，然后用注射器洗干净加样孔，检查一下电路连通状况（注意正负及），然后关闭电源。用微量加样器分别吸取待分析样品，根据蛋白质浓度和加样孔体积决定加样量。6. 加样完毕后，接通电源，起始时用的低电流或低电压，待样品在浓缩胶部分浓缩成一条线后，再加大电流（或电压），待溴酚蓝指示剂达到底部边缘时即可停止电泳。7. 电泳结束后，轻轻撬开两层玻璃，取出凝胶，并切角以作记号（戴手套，防止污染胶面）。8. 染色。2. 4 注意事项1. 玻璃板一定要清洗干净，否则在染色时会有不必要的凝胶背景。2. 过硫酸铵（Ap）要新鲜配制。40%的过硫酸铵储存于冰箱中只能使用2-3天，低浓度的过硫酸铵溶液只能当天使用。3. 蛋白质从浓缩胶部分到分离胶部分转移为避免点脱尾和损失高分子量蛋白，应缓慢进行（场强小于10V/cm）。4. 用Mini Protein 3电泳槽时，以电流为标准，开始进样的低电流为5mA/gel，待样品在浓缩胶部分浓缩成一条线后，再加大电流到10-15mA/gel；以电压为标准，开始进样的低电压为50-75V/gel，待样品在浓缩胶部分浓缩成一条线后，再加大电压到150-200V /gel。用Protein II电泳槽时，以电流为标准，开始进样的低电流为10mA/gel，待样品在浓缩胶部分浓缩成一条线后，再加大电流到20-30mA/gel；以电压为标准，开始进样的低