工业微生物与育种学实验实验二微生物的分离纯化

工业微生物与育种学实验,Part实验基本操作技能实验二微生物的分离纯化,分离纯化形态观察,内容提要,半固体培养基：穿刺接种液体培养基接种普通琼脂培养基：涂布平板，平板划线接种，斜面划线接种浅盘固体接种,（1）接种,无菌操作：,在无菌箱或操作室内无菌的环境下进行,划线分离,划线接种注意要点,划线时接种环与平皿约成30-40度角,轻轻接触,以腕力在琼脂表面轻快滑动,不能划破琼脂.第一次划线应占平皿面积的1/10,以后每次划线约占面积的1/41/5.划线为连续划线,不能间断.应占满平皿.划线不能交叉重复.每次划完后接种环应灭菌.,稀释分离涂布平板,稀释分离倾注平板,厌氧微生物的分离,厌氧罐,厌氧手套箱,厌氧罐,厌氧手套箱,细菌的分离,1、一般采用NA培养基，加入抗真菌剂(如放线菌酮和制霉素)，掺加浓度一般为50gm1，以抑制真菌的生长。2、琼脂平板在使用前应置于37培养箱中孵育l、2天。3、培养基的生物物理学参数，如pH及盐分也应调节到与试样的生态系统参数值相近。,放线菌分离培养需考虑的生态参数：温度、pH、离子强度、氧化还原电势和底物浓度。一般采用高氏1号培养基，大多数放线菌的分离培养是在贫脊或复杂底物的琼脂平板上进行的。除嗜温性放线菌外，其他放线菌一般在培养4-20天内在分离平板上缓慢形成菌落。选择性地添加抗生素，通常加入抗真菌剂制霉菌素或放线菌酮，以抑制真菌的繁殖。,放线菌的分离,真菌分离,利用低碳氮比的培养基可使真菌生长菌落分散，利于计数，分离和鉴定。这里主要是利用营养成分的减少而使生长减慢，并由此限制真菌的迁涉生长。一般采用PDA培养基改变培养温度将有利于不同嗜温区真菌的分离。有时，真菌子实体形成必须有光线，这在分离培养时应加以考虑。,（2）纯化,将分离得到的单菌落分别接种到单个平板上,颜色反应：分离特定的菌株；,牛奶平板：分离蛋白酶产生菌；,待分离的微生物的生长特征明显不同,液体培养基分离纯培养,稀释法进行液体分离必须在同一个稀释度的许多平行试管中，大多数（一般应超过95%）表现为不生长。,单细胞（孢子）分离,一般采用显微操作仪，在显微镜下进行；操作难度与细胞或个体的大小成反比；,（3）形态观察,菌落（colony）：,单个（或聚集在一起的一团）微生物在适宜的固体培养基表面或内部生长、繁殖到一定程度可以形成肉眼可见的、有一定形态结构的子细胞生长群体,众多菌落连成一片,菌苔（lawn）,不同微生物在特定培养基上生长形成的菌落或菌苔一般都具有稳定的特征（形状、颜色等），可以成为对该微生物进行分类、鉴定的重要依据。,同一细菌在不同的培养平板上形成不同的特征菌落,（4）菌种保藏,最常见的保藏方法：斜面细菌的保藏：甘油保藏真菌的保藏：石蜡油保藏、孢子保藏,菌连续在培养基上（内）移种种生活态传代培养保藏法连续在活宿主上（内）移种保固体斜面藏湿法半固体琼脂柱方休眠态液体介质（蒸馏水、糖液、其它溶液）法干法藏在玻璃管内吸附在合适的载体上,菌种保藏的方法,方法：低温保藏法方法：菌种管置4冰箱保藏，定时传代原理：低温下，微生物代谢强度明显下降。石蜡油低温保藏法：橡皮塞取代棉塞、加石蜡油。干燥保藏法将菌种置于土壤、细纱、滤纸、硅胶等干燥材料上保藏。如砂土管法，适用于放线菌、芽孢菌和某些真菌保藏，保藏时间几至几十年。,真空冷冻干燥法加有保护剂的菌悬液在冻结状态下予以真空干燥。适用于各种微生物，便于大量保藏，菌种存活时间长，是目前最好的保藏方法。液氮超低温保藏法将菌种