中国实验诊断学20o6年9月第lO卷第9期.doc

中国实验诊断学20o6年9月第lO卷第9期 原子力显微镜对正常细胞、肿瘤细胞细胞膜表面形态结构的观察1 材料与方法11 主要材料与仪器原子力显微镜：型号为NanoScope II a(Digital Instmments Inc，Santa Barbara，cA)，采用NSCll尖。倒置显微镜：CK2一TRC一3型(Olympus，JAPAN)。照相机(Olympus，JAPAN)12 细胞选择人成纤维细胞(F1)cel1)，人宫颈癌细胞(Helaceu)，人乳腺癌细胞(Mcf7 cel1)，人成纤细胞癌变细胞(MaFb)以上细胞均购于协和医院生物研究室。13 方法131 AFM标本的制备福尔马林固定标本的制备：将细胞接种于置有盖被片的培养瓶中，常规培养，待细胞长满培养瓶底面的80时，取出培养瓶中的细胞爬片，用2福尔马林溶液冲洗3遍，再放主2福尔马林溶液中室温下固定30 min，然后取出细胞爬片，贴于粘有双面胶的载玻片上，置于洁净空间晾干。直接晾干标本的制备：由于细胞在短时间内完全干燥也是一种固定方法，所以我们采取5葡萄糖溶液和枸橼酸盐缓冲液作为清洗液，洗掉细胞表面的培养基，然后将细胞晾干，方如下：用5葡萄糖溶液(或枸橼酸盐缓冲液)冲洗细胞爬片3遍，然后将细胞爬片贴于粘有双面绞的载玻片上，置于较洁净空间晾干。132 AFM操作方法样品晾干后置于NanoSeope a AFM载物台上，利用Nikon倒置显微镜观察细胞的分散情况，选择细胞进行扫描。在操作软件中选择Tapping模式，调整激光到针尖处，并将探测器的激光光斑置于中心圆点。在操作软件中进行自动调频，然后进行样品逼近操作，直至针尖接触到样本，开始扫描。此时计算机显示屏会出现该细胞相应的图像，此图像可以进行保存、测量，也可以利用软件对某些参数进行分析。每个样本扫描6个细胞，每个细胞扫描4个区域；扫描范围为80 pan一05pan；扫描顺序依次为80 pan一30 pan、一个细胞、细胞膜较突起区域(扫描2为：l pan及05脚(各扫描范围是同一扫描中心)；扫描速率为05 Hz一20 Hz。扫描后图像用系统分析软件进一步分析。2 结果21 3种溶液处理标本效果比较2福尔马林溶液固定标本表面较洁净，图像清晰，干扰很少；枸橼酸盐冲液冲洗后景干标本表面很干净，标本表面结构清晰；5葡萄糖溶液冲洗后晾干标本图像模糊成片，完成反应不出细胞膜原有结构。22 4种细胞形态观察结果常规培养的F1)细胞、MaF1)细胞、Hela细胞、Mcf7细胞形态各不相同，F1)细胞呈长梭形、分枝状，细胞核椭圆形；MaF1)细胞大小明显减小，分支也较少甚至消失，细胞核椭圆形或不规则形；Hela细胞呈圆形、多角形、星芒状或短梭形，细胞核圆形；Mcf7细胞多角形、圆形、短梭形等，有分枝，分枝较短，细胞核圆形、椭圆形或半圆形，细胞彼此连接处有广泛的细胞膜相连。23 各标本细胞膜AFM下纳米水平表现F1)细胞恶变前后细胞膜结构比较如表l和图3，扫描范围为500 nBl时可见到Fb细胞膜是由圆形、椭圆形等大小较一致的隆起组成，各隆起结构相互靠近彼此间形成缝隙状凹陷。隆起结构饱满、光滑，排列疏密程度适中，隆起平均大小6219 nin8672 nin，Z轴上高度平均为5716 nin。Ma-Fb细胞膜隆起结构明显增大增高，细胞膜由圆形、三角形、多角形、不规则形等多种形状的隆起构成，各隆起大小相差悬殊，彼此之间形成的缝隙也变得或宽大、或成圆孑L状、或不规则状，隆起表面凸凹不平，排列也疏密不均，隆起平均大小为7465 nin12730 nin，Z轴上高度平均为7848 am。Mcf7细胞膜和Hela细胞膜也同样由隆起与凹陷结构构成，它们的隆起结构形态多种多样，不规则、大小、高低、疏密程度等均无明显规律。表1 AFM下扫描范围为500咖时各种细胞膜结构比较(单位Illln)3 讨论综上所述，2福尔马林溶液适用于培养细胞制备AFM标本，是很好的固定液和冲洗液，枸橼酸盐缓冲液是培养细胞制备AFM标本较好的冲洗液，5葡萄糖溶液不适用于培养细胞AFM标本的制备。细胞种类不同，细胞膜表面结构不同。正常细胞膜与肿瘤细胞膜在形态结构上存在显著差别，特别是正常细胞膜与同种细胞来源的肿瘤细胞膜在形态结构上存在显著差别，特别是正常细胞膜与同种细胞来源的肿瘤细胞膜相比能明确判断出细胞是否恶变，这为临床病理诊断和鉴别诊断提供了可靠的依据。因此，我们可以探索从组织中分离出细胞并可用于AFM扫描的方法，扫描人体所有种类正常细胞的细胞膜，建立人体正常细胞膜结构图库，为鉴别诊断提供诊断依据。作者简介：关维，女，武警总医院病理科医师。主要从事肿瘤病理的研究。参考文献：1David P Allison Peter Hinter Dofer and Wenhai Han，Biomolecularforce rement and the atomic force IIliclDso叩eJiotechnology，2002，volume：13 issue：1472Thomas E Fisher Andres F Oberhanser，The study of protein mechanicswith the atomicforcemi o0cJBiochemical sciences，1999，vouineI24 issue：10 379、【3Binnig G，Quate C F，Gber CAtomic force microscopeJphysical ReviewLettcI，1986，56(9)：930L4PingPing Kuang，Ronald H、Coordinate expression of fibulin一5DANCE and elasfin during lung injury re0airJAm J Physiol Lung CellMol Physiol，2OO3，285：LI1475黄益民，李稼，刘丹晶等原子力显微镜对自由基损伤的红细胞膜表面精细结构的研究J北京生物医学工程，1999，18(1)：l86Eibl RH，Moy VTAtomic force microscopy meastnementa of protein1igand interactions Oil living cellsJMeods Mol Bio12005：305：4397Gaboriaud F，Ballet sSufastructuand mnomechanical properties ofShewanella putrefaciens bacteria at two pH values(4 and 10)determinedby atomic force microscopyJJ Bactefio12005 Jun，187(11)：3864SMOReilly，LMcDonnell，JOMullaneQuantification of red bloodceils using atomic force microscopyJUhmmicroscopy，2001，86：1079马亚敏，纪小龙，尹彤等原子力显微镜对9种常用液体的观察J中国实验诊断学2OO4，8(1)：3810Valle，-F；DeRose，-JA；Dietler，-G；et a1AFM structural s乜J由ofthemolecular chaperone GroEL and its two-dimensional crystals：al1 ideal“livingcalibration sampleJUltramicroscopy，2O02 Oct，3(1)：8311Ortiz V，Nielsen SOUnfolding a linker between helical JjMol Bid20O5 Jun 10；349(3)：638-47Epub 2OO5 Apr 1512Schoenauer R，Bertoncini PMyomesin is a molecular spring with ad印table elasticityJJ Mol Bio120O5 Jun 3；349(2)：367-79Epub 2O05Apr 713Miriam Zaneui，Paola Bn曲etIaEmlLIN-1 Deficiency Induces Elastogenesisand Vascular Cell Dec