指纹图谱技术在注射液质量控制中的应用.doc

指纹图谱技术在清开灵注射液质量控制中的研究进展【摘要】 目的：综述指纹图谱技术在清开灵注射液中的应用现状，总结存在的问题，并提出对策。方法：检索近年有关清开灵注射液指纹图谱研究的文献，并对相关文献进行分类、总结和分析。结果与结论：各种指纹图谱技术在清开灵注射液的质量控制中已经得到广泛应用，但仍然存在一些问题，有待于进一步深入研究，建立更加全面的规范和标准。【关键词】 指纹图谱；清开灵注射液；质量控制；研究进展The research progress in the quality control of Qingkailing Injections with fingerprint technologyAbstract Objective: To analyze the current status of applying fingerprint technology to quality control of the Qingkailing Injections. To conclude the existing problems in the Qingkailing Injections and put forward solutions to solve it. Methods: A literature review was conducted and the methods of classification and summarization were applied. Results and Conclusion: Fingerprint technology is widely used in quality control of Qingkailing Injections. However, more research work is still needed to set up full-scale standards.Keywords fingerprint; Qingkailing Injections; quality control; research progress中国医药源远流长，从神农尝百草开始，至今已有数千年历史。随着医药工业的发展，新的中药剂型不断出现，特别是中药注射液的出现及其在临床上的广泛应用，为中药现代化开辟了新的道路，但目前我国中药注射液的质量控制水平较低，无法适应其未来发展的要求，中药的现代化、国际化“瓶颈”就在质量控制上1。由于历史发展的局限性中医中药学在许多方面还停留在“知其然而不知其所以然”的阶段。近年来，由于对中药内在成分的稳定性、一致性和相对可控性不够明确，从而造成临床疗效的一致性、稳定性也较差的现象。针对这种情况我国全力开发中药指纹图谱技术，而且在2000年8月国家食品药品监督管理局颁布了中药注射剂指纹图谱研究的技术要求（暂行）2，要求对目前已经生产的所有注射液进行指纹图谱研究，指纹图谱技术可用于中药注射剂的多组分、多指标的定性、定量分析。发达国家已认可了这个技术对中药注射液的适用，所以这是实现中药国际化的关键技术。本文将对近年来各种指纹图谱技术在清开灵注射液中的应用进行综述。清开灵注射液是由古方安宫牛黄丸通过拆方改制而成的一种中药注射液3，是临床必备中药注射液之一，具有清热解毒、化痰通络、醒神开窍的功效，用于治疗热病神昏、中风偏瘫、神志不清等症。处方由牛黄、珍珠母、板蓝根、水牛角、黄芩、栀子、金银花共7味药组成。其中牛黄通过直接加入牛胆酸钠和猪去氧胆酸钠来代替；黄芩通过直接加入含量90%以上的黄芩苷代替；另外，栀子、金银花和板蓝根这3味药材通过药材提取液的形式入药；水牛角和珍珠母2味药材水解入药，水解液主要含有无机元素、氨基酸和少量多肽。所以在整个注射液中，存在无机离子、有机小分子以及生物大分子等各种化学物质，因此对于各种化学成分的特征，需要进行多种现代分析仪器的联合测定来完成，运用色谱法、光谱法、质谱法以及其他指纹图谱技术的联用来建立清开灵注射液指纹图谱体系，为清开灵的质量控制提供依据。1中药指纹图谱的概念和建立方法中药指纹图谱是指某种中药材或中成药经过处理后，采用一定的分析手段，得到的能够标志中药材或中成药特征的色谱或光谱图谱4-7。中药指纹图谱是一种整体的质量控制方法，是当前最符合中药特色的评价中药真实性、稳定性和一致性的可行方法。中药指纹图谱按分析手段的不同可分为中药生物指纹图谱和中药化学指纹图谱，狭义的中药指纹图谱就是指中药化学成分指纹图谱。中药化学指纹图谱目前主要包括薄层色谱(TLC)、气相色谱(GC)、高效液相色谱(HPLC)、超临界流体色谱(SFC)、高效毛细管电泳色谱(HPCE)、紫外光谱(UV)、红外光谱(IR)、核磁共振谱(HMR)、质谱(MS)、扫描电镜指纹谱(SEM)、X射线指纹谱(XRD)、DNA指纹谱、以及采用多种现代分析仪器联用方式得到的多维多信息特征谱等8。2 指纹图谱技术在清开灵注射液质量控制中的应用2.1色谱法2.1.1高效液相色谱法李建明，张纲等人9运用高效液相色谱法对清开灵注射液生产中板蓝根提取液的氨基酸种类进行分析，他们通过对HPLC指纹图谱的分析，发现板蓝根提取液中至少含有15种氨基酸，其中精氨酸、脯氨酸、苏氨酸、缬氨酸和丙氨酸的含量最高。该方法为强化清开灵注射液生产的过程控制和提高产品的质量标准提供了研究思路。栀子作为清开灵注射液中主要的成分之一，其质量的控制对清开灵注射液的安全性具有重要的作用。现在在栀子的质量控制中很多运用可变波长下的HPLC指纹图谱技术10-11。可变波长下的HPLC指纹图谱能够有效地检测栀子的质量，克服了单波长检测时信息量有限的缺点，能全面、真实地揭示中药材的内在质量特征。清开灵注射液中氨基酸种类众多，为了使其质量更加可控，白玉静、高晓燕等12人运用HPLC-ELSD法测定清开灵注射液中的氨基酸种类，该方法得到的HPLC指纹图谱中有19个峰，也就是说该方法能够测得清开灵注射液中含有19种氨基酸，通过HPLC指纹图谱以各种氨基酸峰面积对数值Y为纵坐标，氨基酸进样量对数值X为横坐标，得线性回归方程可以对其进行含量测定，而且该方法不需要对氨基酸进行衍生，省去了衍生反应所需要的繁琐步骤，操作简便，结果准确、可靠。2.1.2薄层色谱法中药材是生产注射液的原材料，其质量的好坏直接影响注射液的质量。薄层色谱(TLC)是一种成熟的理化手段，在其基础上发展起来的薄层扫描技术可对中药特定组分进行定性和定量分析13。叶文婷、卢绵等人采用薄层色谱法对十种不同地区板蓝根中核苷类成分进行定性测定14，分别取各供试品溶液、对照品溶液，分别点于同一硅胶薄层板上。以氯仿-乙酸乙酯-异丙醇-水-浓氨水 (8:2:6:0.3:0.2)为展开剂，展开，取出晾干。置紫外光灯254 nm下检视，供试品色谱与对照品色谱在相应的位置上显相同的颜色斑点。结果表明，十种不同产地的板蓝根中均含有尿苷、腺苷、腺嘌呤。该方法的重现性好，分离度好，薄层斑点清晰，而且方法简单灵敏，准确可靠，可完善现行的质量标准，提高板蓝根的质量控制，对于保证其质量和临床疗效具有重要意义。色谱法反映的是中药注射液以及中药材提取物的化学组成及含量状况，其特点是分离能力强、分析速度快、定量准确，能定性定量地反映不同中药间的差异，而且根据各种色谱方法得到的指纹图谱准确、可靠。依据国家对中药注射剂指纹图谱研究的技术要求，采用色谱法对清开灵注射液进行指纹图谱研究，建立清开灵注射液色谱指纹图谱体系，为清开灵注射液的质量控制提供有效方法是目前我国研究的重点之一15-19。2.2光谱法2.2.1紫外光谱法王丽婷、王丽娟等运用紫外光谱法对金银花中的木犀草素进行鉴定20，他们采用试验品木犀草素和样品对照的方法进行紫外图谱鉴定，只要试验品和标准品的色谱峰重合的相对较好，就是纯度较高的木犀草素产品。运用紫外光谱法我们可以快速的得出中药材中的特定成分是否合格，是否符合药品生产所需，对控制清开灵注射液的质量具有重要意义。紫外光谱法具有简便、快速、可多组分测定等优点，非常适合于液体试样的过程分析与质量控制。清开灵注射液成分众多，各成分的紫外特征吸收差异较小，各组分的紫外光谱存在严重的重叠，限制了该方法的直接应用，但结合化学计量学方法对光谱进行数据分析可以对清开灵注射液进行高效的质量控制21-22。2.2.2红外光谱法红外光谱的运用对鉴定药品的真伪、控制药品的质量具有重要的意义。李洪宇、张丽华等23建立用于鉴别牛黄解毒丸的红外指纹特征图谱，他们对所有样品采用统一的提取条件，采用丙酮提取并测试其提取物的红外指纹图谱。经数据分析不同厂家牛黄解毒丸均具有独特而稳定的红外指纹特征图谱，并与伪品区别明显。因此牛黄解毒丸的红外指纹特征图谱可以作为其质量控制和真伪鉴别的根据。中药鉴定在中药注射液质量控制中具有重要的作用，近年来多种现代仪器分析方法被用于中药鉴定和质量控制。作为一种简单、快速、无损的检测手段，近红外光谱(NIRS)技术己成为中药注射液定性判别和定量分析的新兴方法24。朱向荣、李娜等应用近红外光谱分析技术结合化学计量学方法25，建立了清开灵注射液中间体总氮和栀子苷含量测定的新方法。他们对多批清开灵注射液的四混液样本进行透射方式采集光谱，并运用计算机程序对光谱进行处理分析，结果表明这种方法能够快速、无损、可靠地测定四混液中总氮和栀子苷的含量，该方法可推广应用于中药注射液中间体的在线质量控制。2.3多维图谱技术的联用2.3.1色谱-光谱技术的联用建立清开灵注射液HPLC/UV/MS/MS指纹图谱研究，对清开灵注射液的质量控制具有非产重要的意义，严诗楷、罗国安、王义明等人建立了清开灵注射液HPLC/UV/MS/MS指纹图谱26，研究了16个指纹峰，其中10个为共有峰，并通过电喷雾离子阱质谱分析鉴定出其中13个主要色谱峰，部分结果用对照品进行了保留时间和二级质谱峰比对鉴定，成功区分了3种结构相似的绿原酸类异构体。HPLC/UV/MS/MS方法用于清开灵注射液研究，可以同时实现有效组分的良好分离并提供各指纹峰的组成和结构信息。HPLC/UV/MS/MS指纹图谱准确、可靠、有效，在中药复杂体系研究及其质量控制方面具有非常广阔的应用前景。为中药复杂体系的分析及其质量控制提供了一种有效、可靠的模式。2.3.2色谱-色谱技术的联用北京中医药大学的白洁利用多维高效液相色谱法27测定的清开灵注射液十一种指标性成分的总含量为7.74 mg/ml，占总固体量的24.1%。多维高效液相色谱法可以一次进样分析测得十一种指标性成分含量，比以往的研究有了很大的进步。所谓多维，即采用多种分析仪器联用的模式来测定指纹图谱，可对复杂的清开灵注射液有更清晰完整的认识。高晓燕、李娜28-29等运用反相高效液相和紫外光谱联合的方法对清开灵注射液进行在线质量控制，通过对反相高效液相色谱和紫外色谱的分析可以快速测定栀子苷的含量，同时他们只运用高效液相色谱进行对照，结果表明，联用的多维指纹图谱比单一的高效液相色谱法能够更准确、全面、快速的测定清开灵注射液中栀子苷的含量。由于清开灵注射液的成分比较复杂，现行的各种单一测定方法得到的信息少，往往无法建立较完善的指纹图谱，现在很多研究者建议建立多维指纹图谱解决这类问题30-33。3 中药注射液指纹图谱研究中存在的问题及对策近些年来，指纹图谱技术用于中药注射液的质量控制成为中药研究的热点，但是指纹图谱技术并不是完美的，它也存在一些有待解決的问题。3.1 指纹图谱测定条件不够规范目前在清开灵注射液指纹图谱研究中较多的采用各种色谱法、光谱法及色谱光谱联用的方法。但是这些方法在使用过程中受到很多因素的影响34，包括仪器自身稳定性、样品的前处理方法、色谱分析条件以及实验环境等，这些因素的变化都会影响到指纹图谱的测定结果。目前在研究中更多关注的是图谱条件，而没有对其他条件予以严格控制，造成一些指纹图谱在实际应用过程中重现性很差。因此，在清开灵注射液指纹图谱研究中应该对测定条件进行严格规范，除了对具体仪器设备条件进行规范外，还要对样品的前处理方法、实验环境条件等其他影响测定结果的因素进行详细记录，必要时候还要考察样品前处理方法及实验环境的变化对指纹图谱的影响，这样通过一定量的数据积累可以发现各种因素对实验结果的影响。清开灵注射液指纹图谱测定过程的规范和控制，对保证清开灵注射液指纹图谱的重现性和实用性具有重要意义。3.2 指纹图谱技术手段不够全面清开灵注射液是一个复杂体系，其中含有多类化学成分，这些成分中包含有效成分，也可能含有一些非有效成分，但这些成分作为一个起药效作用的整体，就应该全面控制其质量，保证各种成分都处于相对稳定的状态，都处于可控的范围内35。这就要求对清开灵注射液的多种成分进行全面质量控制，而目前在清开灵注射液指纹图谱的研究中多采用单一的指纹图谱模式，难以全面控制注射液的质量。比如采用紫外图谱法制定清开灵注射液的指纹图谱，对于没有紫外吸收的成分就无法进行控制；而采用气相色谱法制定的指纹图谱对于非挥发性成分则没有办法进行监测。因此，对于清开灵注射液这样一个相对而言比较特殊的中药剂型，应该采用多种指纹图谱模式协同质量控制的策略，由于紫外光谱法、红外光谱法等光谱技术能够反映体系的总体特征，而且也具有指纹性，可以用于中药注射剂整体稳定性的宏观控制；而高效液相色谱法、气相色谱法等色谱技术能够对主要成分进行微观控制；此外，通过核磁共振、X-射线衍射等技术也能从不同侧面反映清开灵的整体特征。通过这些指纹图谱技术的协同使用，可以在宏观和微观层次最大限度的保证清开灵注射液的质量稳定和可控36。3.3 指纹图谱信息挖掘不够深入目前各种指纹图谱技术都已经尝试着用于清开灵注射液的指纹图谱研究，在指纹图谱的建立方法上已经没有太大障碍，但在对指纹图谱的数据处理和信息挖掘方面还需要进一步研究。现有研究多把计算指纹图谱相似度作为主要研究目的，事实上在指纹图谱上还有很多信息有待挖掘，到底中药注射剂的功效成分为哪些色谱峰？如何采用更为合理的统计学理论和计算器技术来构建指纹特征更加明显的指纹图谱计算方法？各色谱峰间的比例关系对药效有何影响？这些问题提示我们，清开灵注射液指纹图谱的研究还需要深入下去，需要进入指纹图谱研究的高级阶段。4 前景与展望近年来，随着清开灵注射液临床应用的日益增多，不良反应的报道也逐年增多，甚至引起严重不良反应，导致患者死亡，清开灵注射液的安全性问题引起了人们的关注37-38。但是我们应该看到，清开灵注射液作为中药现代化的重要成果，在中医临床上有着广泛的应用，对保障国人的生命健康起着巨大的作用，其安全性问题通过进一步的研究是可以得到有效解决的。对于清开灵注射液的发展前景39，首先，要注重清开灵注射液指纹图谱的横向拓展研究，采用多种色谱和光谱指纹图谱手段，建立针对不同类型成分的多种指纹图谱模式协同质量控制的方法，全面控制注射液的质量；其次，要探索进行清开灵注射液指纹图谱的纵向深入研究，主要包括注射液的谱效关系研究、活性成分的比例关系研究、注射液指纹图谱的信息挖掘研究等。我们坚信，随着各种指纹图谱技术在清开灵注射液质量控制中的广泛应用，我们可以建立起一整套规范的指纹图谱研究方法，制定出能够反映清开灵注射液质量的指纹图谱质控体系。5结论通过论述我们可以知道指纹图谱技术在清开灵注射液生产过程中的质量控制具有重要的作用，因此，我们要加快色谱、光谱等指纹图谱技术在清开灵注射液物质基础、药效成分等方面的研究，并且要快速应用到注射液的生产中来40。我们要通过对指纹图谱的深入研究，挖掘出指纹图谱的更多信息，建立清开灵注射液指纹图谱信息数据库，使清开灵注射液的质量控制达到国际水平。我们相信在以后清开灵注射液质量控制的技术中指纹图谱的应用将会更加广泛，而且指纹图谱技术也将为清开灵注射液的稳定性、安全性提供有力的保障，指纹图谱技术必将为清开灵注射液走向世界打下坚实基础。参考文献1 秦昆明,徐昭,蔡宝昌.指纹图谱技术在中药注射剂质量控制中的应用现状J.亚洲社会药学,2009,4(1):60-64.2 国家药品监督管理局.中药注射剂指纹图谱研究的技术要求(暂行)J.中成药,2000,22(10):671-675.3 肖兰,赵绪元.清开灵注射液的研究进展J.中国药房,2006,17(6):468-469.4 汤芳玲,蔡光明,袁波,等.中药指纹图谱技术研究现状C.中药制剂新工艺、新技术与产品质量控制研究高级研讨会.2010,157-159.5 李松林,棘宏喜.中药现代化之探索与实践C.第二届中国天然药物研究与发展论坛.2008,31-41.6 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