EGFR突变检测意义及方法学简介-26Aug.ppt

EGFR突变检测意义及方法学简介鹿亚超（PeterLu）阿斯利康中国创新研究中心（ICC）,2011年08月26日，Xiamen,内容,为何要检测EGFR突变EGFR突变类型及意义标本因素对突变检测的影响突变检测流程与方法概述ARMS试剂盒检测EGFR突变非肿瘤组织标本检测EGFR突变进展,具有EGFR基因敏感突变者TKI疗效显著,1JCO2006;2-5ASCO2006;6ASCO20077MokTSetal,NEJM2009;8MaemondoMetal.NEJM20109MitsudomiTetal.LancetOncology2010,70.4%,EGFR基因突变检测在临床应用的意义(1/2),为何要检测EGFR突变(2/2),IPASS:根据突变状态的疗效分析,0,4,8,12,16,20,24,Timefromrandomisation(months),0.0,0.2,0.4,0.6,0.8,1.0,ProbabilityofPFS,GefitinibEGFRM+(n=132)GefitinibEGFRM-(n=91)Carboplatin/paclitaxelEGFRM+(n=129)Carboplatin/paclitaxelEGFRM-(n=85),GefitinibEGFRM+(n=132)GefitinibEGFRM-(n=91)Carboplatin/paclitaxelEGFRM+(n=129)Carboplatin/paclitaxelEGFRM-(n=85),EGFR基因突变检测概念,EGFR突变检测指肿瘤组织中编码EGFR基因的DNA突变状态检测并不是：EGFR基因DNA拷贝数的检测（FISH法）EGFR蛋白表达量的检测（IHC法）。,X,NatureReview2007,7:169,NSCLC中EGFR酪氨酸激酶区突变种类,EGFR突变类型与吉非替尼治疗敏感性,Moketal.,2008Kimetal.,2008Hirschetal.,2006AZIn-HouseData-Unpublished,标本采集及病理评估,DNA抽提及质控,检测报告,EGFR突变检测,ARMS,测序法,其它方法,EGFR突变检测流程,EGFR突变检测中的相关角色,患者,临床医生,胸外科医师,内镜医师,收集肺癌组织标本,病理科医生,准备样本,实验操作及结果分析,实验室人员,报告结果给临床医生,肿瘤科医生放疗科医生呼吸科医生,标本因素对EGFR突变检测的影响-肿瘤组织特点-,遗传异质性,对检测方法敏感度有较高要求,用于EGFR突变检测的标本,肿瘤组织目前最可靠的标本；其它样本：外周血（血浆、血清）细胞学（胸水、痰液细胞学）支气管刮取物,仍需进一步研究确定这些样本在临床实践及诊断中的应用,标本因素对EGFR突变检测的影响-组织标本种类-,对检测方法有相应要求，组织标本及DNA质控尤其重要,肿瘤组织标本的采集及病理评估,肿瘤组织标本,病理学评估,组织切片,非小细胞性肺癌诊断及类型肿瘤细胞比例肿瘤细胞总数标识肿瘤丰富的区域富集肿瘤细胞,H&E染色片用于病理评估白片用于提取DNA建议最少切片数：-手术标本，5mX4-小活检标本，5mX8,组织标本来源手术标本支气管下活检经皮穿刺活检标本处理及贮存新鲜冻存：液氮或-80CFFPE,DNA提取及质控,推荐用QIAGEN或类同试剂盒提取DNA紫外分光光度计：适合新鲜组织DNA质控测定总量（OD260）及DNA纯度（OD260/280）qPCR：FFPE来源DNA的最可靠质控方法检测可扩增的DNA片断评估是否存在PCR抑制剂,DNA10倍稀释后,ME-PCR/Sequencing,O,=Transferproduct/addreagent/opentube,PCR:Real-timeDetection,PCR,Clean-up,SequencingRxn,CapillarySequencing,PCR,PCR,Clean-up,SequencingRxn,CapillarySequencing,PCR,Hetero-duplex,CapillaryElectro-phoresis,ARMS&PNA-LNAclamp,PCR/Sequencing,NestedPCR/Sequencing,PCR/HRMA/dHPLC,PCR/RFLP,PCR,RFLP,Electro-phoresisSizing,PCR,PCR,Clean-up,SequencingRxn,CapillarySequencing,RFLP,O,O,O,O,O,O,O,O,O,O,O,O,TaqMan,Clean-up,O,Clean-up,O,Clean-up,O,O,O,O,PCR,SURVEYORcleavage,dHPLCSizing,O,Confirmationbysequencing,PCR/SURVEYOR,PCR,Clean-up,Pyro-sequencingRxn,PyroSequencing,O,O,1,2,3,4,5,6,Steps,7,突变检测的各种方法：流程与敏感度,Confirmationbysequencing,O,Confirmationbysequencing,O,O,O,1%,10%,3-10%,10%,3-12%,2030%,2030%,FFPE组织-手术标本小活检标本选择合适的方法-ARMS是目前较敏感快速方法，且容易开展-测序是传统的方法，但敏感度有