从鸡蛋清中提取溶菌酶.ppt

从鸡蛋清中提取溶菌酶,制作者：,目录,1、溶菌酶的含义2、溶菌酶的理化性质3、溶菌酶的提取及分离4、溶菌酶的用途,什么是溶菌酶？,溶菌酶又称胞壁质酶或N-乙酰胞壁质聚糖水解酶，是一种能水解致病菌中黏多糖的碱性酶。,溶菌酶的物理性质：,白色或微白色冻干粉，溶于水，不溶于乙醚和丙酮，pI为11.0-11.35，最适pH值6.5。稳定性：酸性介质中可稳定存在，碱性介质中易失活。存储条件为2-8摄氏度。,溶菌酶的化学性质：,溶菌酶的结构,一:【实验目的】1.熟练掌握离子层析分离纯化溶菌酶的原理以及离子交换层析的操作方法2.理解SDS-聚丙烯酰胺凝胶（PAGE）测定蛋白质纯度与分子量的原理,二:【实验原理】溶菌酶是一种有效的抗菌剂，全称为1,4-N-溶菌酶，又称作粘肽N-乙酰基胞壁酰水解酶或胞壁质酶。是一种糖苷水解酶，能催化水解粘多糖的N-乙酰氨基葡萄糖与N-乙酰胞壁酸间的-1，4糖苷键，由129氨基酸残基构成，由于其中含有较多碱性氨基酸残基，所以其等电点高达10.8左右，最适温度为50，最适PH为67左右。溶菌酶广泛存在于动植物及微生物体内，鸡蛋(含量约为2%4%)和哺乳动物的乳汁是溶菌酶的主要来源，目前，溶菌酶仍属于紧销的生化物质，鸡蛋的蛋清中含有丰富的上述物质，本实验以鸡蛋蛋清为原料，对溶菌酶进行提取并分离纯化。溶菌酶常温下在中性盐溶液中具有较高天然活性，在中性条件下溶菌酶带正电荷，因此在分离制备时，先采用等电点法粗分离，再用DE-52纤维素离子交换色谱和葡聚糖G50凝胶层析分离纯化。,【材料与仪器】鸡蛋3个DE-52纤维素葡聚糖G500.5*7cm色谱柱、2.5*20cm色谱柱、烧杯(100ml,250mL，1000mL)、锥形瓶(100ml)、玻璃棒、漏斗、定性快速滤纸、纱布、量筒（100mL,250mL，1000mL）、10mL离心管、1.5mLEp管、高速离心机、冰箱、电炉,【试剂配制】冰醋酸、5mol/LNaOH、20%磺基水杨酸溶液、考马斯亮蓝染色液、脱色液：450mL甲醇：水（1：1）、50mL冰醋酸、0.02mol/LPBS(pH8.0),【实验步骤】1.溶菌酶的粗提取（约两个半小时）拿3个鸡蛋破壳取蛋清置于250mL烧杯中，轻轻搅拌5分钟，使其的稠度均匀，然后用两层纱布过滤，去除脐带和蛋壳。记录其体积V1加入1.5倍体积的pH8.0PBS缓冲液，搅拌均匀用冰醋酸调pH4.7左右，充分搅拌,3500rpm，离心20min弃沉淀，转移上清至烧杯中加入1倍体积的pH8.0PBS缓冲液，搅拌均匀，并用5mol/LNaOH调pH8.0,滤纸过滤，取清液，测量并记录体积V2取清液装在10mL离心管中-20冻存备用。（样品S1）,2.溶菌酶的分离纯化（1）DE-52初次纯化溶菌酶DE-52纤维素的处理装柱加样、洗脱,（2）葡聚糖G50再次纯化溶菌酶凝胶的处理装柱加样、洗脱,【注意事项】1.等电点沉淀后利用离心的办法，要尽量除去沉淀；2.调节pH时要避免局部过酸；3.提取过程中尽量避免泡沫的产生4加样蛋白浓度低于20mg/mL，上样体积小于柱体积的1/3。5.在整个实验过程中，流速必须得到一定的控制。控制流速为2mL/min。6冲平过程一定不能省。,溶菌酶的用途：,溶菌酶是生物体内广泛存在的一种能分解黏多糖的水解酶。能是革兰阳性菌细胞壁溶解，从而发挥抗菌作用。有抗菌