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文档简介

人外周血淋巴细胞微核测定,一、目的要求1、掌握人外周血淋巴细胞微核标本制备方法。2、熟悉人外周血淋巴细胞微核的形态特征。3、了解微核的发生机制及微核检测技术的用途。,二、实验原理:人外周血淋巴细胞大都处于细胞周期的G0期，在含有PHA的培养基中进行体外培养后，原来处于G0期的淋巴细胞可转化为淋巴母细胞，恢复分裂能力。在细胞分裂过程中，由于化学物质或辐射作用影响，可以引起淋巴母细胞染色体损伤，致使染色体断裂，无着丝粒的染色体断片不能随染色体移动进入子细胞核，结果在细胞质中形成微核。本试验是一种体外测试有害因子遗传毒性的方法，通过在人类外周血淋巴细胞体外培养过程中加入受试物，检测细胞微核情况来评价受试物的遗传毒性。同时也成为检测致突变、致癌、致畸物质对机体遗传效应的一种重要手段。,三、实验用品（1）器材：离心管、注射器、培养瓶（10ml）、吸管、离心机、载玻片、冰箱、培养箱、恒温水浴箱。（2）试剂：Giemsa染液、pH6.8磷酸缓冲液、RPMI1640培养液、PHA溶液、0.075molLKCl溶液、甲醇:冰醋酸固定液（3）材料：人外周血、环磷酰胺溶液。,四、实验步骤1、按人类外周血染色体培养常规方法采血、接种，按组分别加入受试物（CP终浓度100ug/ml）培养72小时，收获前不用加秋水仙素，收获标本，离心，去上清液。2、低渗：加入0.075molLKCl溶液4m1。混匀后放入37恒温水浴箱中低渗处理10分钟。低渗时间可根据预实验中细胞完整程度进行调整。3、预固定：低渗结束后加入甲醇冰乙酸（3:1）固定液lml，混匀后离心（1000rpm）5分钟。4、固定：弃上清液，加入5ml固定液，混匀后离心（1000rpm）5分钟。弃上清液，留沉淀物。可按本方法再固定一次。5、滴片：加入少量固定液混匀成细胞悬液，滴片。6、染色：用Giemsa染液染色10分钟。自来水细水冲洗后，晾干。,7、观察与计数：先以低倍镜、高倍镜粗检，选择细胞分散均匀，染色良好的区域，转到油镜下观察转化的淋巴细胞，进行微核的观察和计数。转化淋巴细胞与未转化淋巴细胞比较，前者细胞较大，胞核明显偏离中心，染色质较细致疏松或呈网状、核仁多，胞浆丰富，常见空泡和伪足。微核的识别：微核是存在于已转化的胞浆完整的淋巴细胞中的小核，其直径为主核的13以下，形态为圆形或椭圆形，嗜色性和主核一致或略浅，必须与主核完全脱离。一个细胞中，不论出现一个微核或多个微核，均按一个有微核的细胞计数，微核细胞率以千分率表示，即1000个已转化的淋巴细胞中有微核的细胞
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