实验三蛋白质的盐析分离和凝胶层析.ppt

生物化学实验BiochemicalExperiment,实验成绩评分方法,实验预习情况（10%）实验操作情况（30%）实验报告情况（30%）实验考试成绩（20%）实验素质（遵守实验室规则和道德行为）（10%）,本学期实验课安排,有关网址和参考书目,、蛋白质的盐析分离和凝胶层析脱盐,蛋白质的盐析分级分离SephadexG-25脱盐盐离子的跟踪检测检测蛋白质,蛋白质提取、分离、纯化及鉴定技术,材料（取材一定要新鲜，在低温下操作）破细胞（匀浆器，研钵，超声波，反复冻融，化学方法，酶解等）蛋白质提取（根据物质的性质，水、盐溶液、稀酸、稀碱、有机溶剂）蛋白质分级分离（盐析分级分离、有机溶剂分级分离、等电点分离）进一步纯化（透析、柱层析：分子筛、离子交换、亲和层析、HPLC）鉴定（电泳：薄层电泳（纸，NC膜）、凝胶电泳（PAG，琼脂，淀粉）；结构分析；活性分析；呈色反应）含量测定（fonlin酚法、考马斯亮蓝G250法）,蛋白质的分级分离（粗分级）,一、盐析沉淀分离1、盐溶和盐析现象：低盐浓度下蛋白质的溶解度随盐浓度的增加而增加；盐浓度升高到一定程度后，蛋白质的溶解度随盐浓度的增加而减小析出。2、盐的选择：通常采用中性盐，硫酸铵、硫酸镁、氯化钠、磷酸钠等。3、硫酸铵浓度的计算与调整：（1）加硫酸铵饱和液：V=V0（S2S1）/（1S2）；（2）加固体硫酸铵：t=G（S2S1）/（1AS2）V为所加饱和硫酸铵体积；V0为原溶液体积；S2为需达到的硫酸铵饱和度；S1为原溶液硫酸铵饱和度；G和A为常数，0时G为507，A为0.27；20时，G为533，A为0.27。t为每升加入的克数。,二、有机溶剂沉淀分离有机溶剂沉淀出的蛋白质沉淀比盐析沉淀出的蛋白质沉淀易于过滤或离心分离，分辨率好，但容易使蛋白质变性，通常在低温下进行。三、选择性沉淀法（等电点、热变性、酸碱变性等）四、吸附法五、重金属盐沉淀法,蛋白质的进一步纯化（细分级）,一、透析和超过滤二、层析（色谱）分离1、气相色谱（色谱仪）2、液相色谱：纸层析和薄层层析（分配层析）、柱层析（分子排阻、离子交换、亲和层析、吸附层析等）3、高效液相色谱（色谱仪）两位英国科学家Martin和Synge发明了分配色谱（层析），他们获得了1952年的诺贝尔化学奖。,一些常用的蛋白质纯化中的仪器,机械细胞破碎仪,超声波细胞破碎仪,色谱工作站WINDOWS98作为色谱分析的数据采集和处理，后端采用数据库工具MS-SQL在网络上进行分析结果的存档、检索及打印等。,高效液相色谱仪,气相色谱仪,蛋白质的盐析分离原理,用大量中性盐使蛋白质从溶液中析出的过程称为蛋白质的盐析作用。蛋白质是亲水胶体，在高浓度的中性盐影响下脱去水化层，同时，蛋白质分子所带的电荷被中和，结果蛋白质的胶体稳定性遭到破坏而沉淀析出。经透析或用水稀释时又可溶解，故蛋白质的盐析作用是可逆过程。分子量大的蛋白质（如球蛋白）比分子量小的（如白蛋白）易于析出。改变盐浓度，使不同分子量的蛋白质分别析出。,凝胶层析原理,凝胶层析又称排阻层析，凝胶过滤，渗透层析或分子筛层析等。对于某种型号的凝胶，一些大分子不能进入凝胶颗粒内部而完全被排阻在外，只能沿着颗粒间的缝隙流出柱外（所用洗脱液的体积为外水体积）；而一些小分子不被排阻，可自由扩散，渗透进入凝胶内部的筛孔，尔后又被流出的洗脱液带走（所用洗脱液的体积为内水体积）。分子越小，进入凝胶内部越深，所走的路程越多，故小分子最后流出柱外，而大分子先从柱中流出。一些中等大小的分子介于大分子与小分子之间，只能进入一部分凝胶较大的孔隙，亦即部分排阻，因此这些分子从柱中流出的顺序也介于大、小分子之间。这样样品经过凝胶层析后，分子便按照从大到小的顺序依次流出，达到分离的目的。,凝胶层析载体,用作凝胶的载体物质有交联葡聚糖、聚丙烯酰胺和琼脂糖等。使用最多的是交联葡聚糖。交联葡聚糖的商品名为Sephadex,是由链状葡聚糖通过交联剂1氯代2，3环氧丙烷交联而成。交联剂添加越多，孔径越小，吸水量也越小；反之越大。以G-x表示型号，后面的数字可以看出交联度，数字越小，胶联度越大。SephadexG-25粗：吸水量2.5ml/g，干粒子直径100-300m，筛孔40-60。大部分蛋白质分子从外水体积流出，盐等小分子从内水体积流出。,实验步骤（一）卵球蛋白的沉淀,实验步骤（二）卵球蛋白的脱盐,注意事项实验完毕后，将凝胶全部回收处理，以备下次实验使用，严禁将凝胶丢弃或倒入水池中。样品溶液的浓度大一些好，但粘度不宜大，加样体积通常为凝胶柱床体积的1%-10%。洗脱用的液体与凝胶溶涨和凝胶平衡时所用的一样。洗脱速度要恒定。凝胶暂时不用时，要加防腐剂（如0.02%叠氮化钠溶液）再次使用凝胶时可再生后使用,蛋白质洗脱曲线记录方式,盐离子检测方法,用醋酸钡检测溶液中的硫酸根离子。灵敏度高，与溶液中的硫酸根离子可以形成白色的沉淀。同时不能同蛋白质形成沉淀。实验中要设对照，即加入双蒸水和醋酸钡检测溶液。为什么不