刘希伟201100140041分子生物学实验报告.doc

质粒DNA的提取、纯化及检测姓名：XXX 学号：2011001400XX 年级：20XX级生物基地班 实验日期：2013年9月16日30日 组别：6组 同组者：XX一、【实验目的】 1、掌握碱变性提取法提取大肠杆菌中质粒DNA的原理和方法。2、学习并掌握凝胶电泳进行DNA的分离纯化的实验原理。3、学习并掌握凝胶的制备及电泳方法。4、学习并掌握凝胶中DNA的分离纯化方法。二、【实验原理】1、质粒DNA的制备方法 质粒(Plasmid)是独立存在于染色体外、能自主复制并能稳定遗传的一种环状双链DNA分子，分布于细菌、放线菌、真菌以及一些动植物细胞中，但在细菌细胞中含量最多。细菌质粒大小介于1200Kb之间，是应用最多的质粒类群，在细菌细胞内它们利用宿主细胞的复制机构合成质粒自身的DNA。 质粒DNA的制备包括3个步骤：培养细菌，使质粒DNA大量扩增；收集和裂解细菌；分离和纯化质粒DNA。主要方法包括：碱裂解法：0.2molNaOH+1%SDS；煮沸裂解法：沸水煮沸40秒；SDS裂解法：10%SDS，一般用于质粒大量提取。在实际操作中可以根据宿主菌株类型、质粒分子大小、碱基组成和结构等特点以及质粒DNA的用途进行选择。本实验选择碱裂解法提取质粒DNA。2、质粒DNA的提取碱变性提取法 在细菌细胞中，染色体DNA和质粒DNA均被释放出来，但是两者变性与复性所依赖的溶pH值不同。在pH值高达12.0的碱性溶液中，染色体DNA的氢键断裂，双螺旋结构解开而变性；共价闭合环状质粒DNA的大部分氢键断裂，但两条互补链不完全分离。因为它们在拓扑学上是相互缠绕的。当用pH值4.6的KAc（NaAc）高盐溶液调节碱性溶液至中性时，变性的质粒DNA可恢复原来的共价闭合环状超螺旋结构而溶解于溶液中；但染色体DNA不能复性，而是与不稳定的大分子RNA、蛋白质-SDS复合物等一起形成缠连的、可见的白色絮状沉淀。这种沉淀通过离心，与复性的溶于溶液的质粒DNA分离。溶于上清液的质粒DNA，可用无水乙醇和盐溶液，使之凝聚而形成沉淀。由于DNA和RNA性质类似，乙醇沉淀DNA的同时，也伴随着RNA沉淀，可利用RNaseA将RNA降解。质粒DNA溶液中的RNaseA以及一些可溶性蛋白，可通过酚/氯仿抽提除去，最后获得纯度较高的质粒DNA。3、凝胶电泳进行DNA分离纯化 电泳(electrophoresis)是带电物质在电场中向着与其电荷相反的电极方向移动的现象。各种生物大分子在一定pH条件下，可以解离成带电荷的离子，在电场中会向相反的电极移动。凝胶是支持电泳介质，它具有分子筛效应。含有电解液的凝胶在电场中，其中的电离子会发生移动，移动的速度可因电离子的大小形态及电荷量的不同而有差异。利用移动速度差异，就可以区别各种大小不同的分子。因而，凝胶电泳可用于分离、鉴定和纯化DNA片段，是分子生物学的核心技术之一。 凝胶电泳技术操作简单而迅速，分辨率高，分辨范围广。此外，凝胶中DNA的位置可以用低浓度荧光插入染料如溴化乙锭(ethidium bromide，EB)或SYBR Gold染色直接观察到，甚至含量少至20pg的双链DNA在紫外激发下也能直接检测到。需要的话，这些分离的DNA条带可以从凝胶中回收，用于各种各样目的的实验。 分子生物学中，常用的两种凝胶为琼脂糖(agarose)和聚丙烯酰胺凝胶。这两种凝胶能灌制成各种形状、大小和孔径，也能以许多不同的构型和方位进行电泳。聚丙烯酰胺凝胶分辨率高，使用于较小分子核酸(5500bp)的分离和蛋白质电泳。它的分辨率非常高，长度上相差1bp或质量上相差0.1%的DNA都可以彼此分离，这也是采用聚丙烯酰胺凝胶电泳进行DNA序列分析的分子基础。虽然它能很快地进行电泳，并能容纳较大的DNA上样量，但是与琼脂糖凝胶相比，在制备和操作上繁琐。琼脂糖是从海藻中提取的长链状多聚物，由-D-吡喃半乳糖与3,6-脱水-L-吡喃半乳糖组成，相对分子质量为104-105。琼脂糖加热至90左右，即可溶化形成清亮、透明的液体，浇在模版上冷却后形成凝胶，其凝固点为40-45。琼脂糖凝胶相对于聚丙烯酰胺凝胶分辨率低，但它的分离范围更大(50至百万bp)，小片段DNA(50-20000bp)最适合在恒定轻度和方向的电场中水平方向的琼脂糖凝胶内电泳分离。琼脂糖凝胶电泳易于操作，适用于核酸电泳，测定DNA的相对分子质量，分离经限制酶水解的DNA片段，进一步纯化DNA等。 琼脂糖凝胶电泳是一种常用的方法。在溶液中，由于核酸有磷酸基而带有负电荷，在电场中向正极移动。DNA在琼脂糖凝胶中的电泳迁移率主要取决于6个因素：样品DNA分子的大小、DNA分子的构象、琼脂糖浓度、电泳所用电场、缓冲液和温度。三、【实验材料】1、实验仪器培养皿、接种环、三角瓶、酒精灯、恒温振荡培养箱、50ml离心管、1.5ml塑料离心管（Eppendorf管）、高速离心机、漩涡振荡器、微量移液器、不同型号枪头、天平、制胶槽、梳子、电泳仪、吸管、量筒、微波炉、灭菌锅、恒温水浴锅、试剂瓶、卫生纸和记号笔、手套等。2、实验试剂LB培养基，抗生素Ap（氨苄青霉素），溶液，溶液，溶液，RNaseA母液，TE缓冲液，饱和酚，氯仿/异戊醇混合液，酚/氯仿/异戊醇（PCI）混合液，预冷无水乙醇，TAE电泳缓冲液（10），上样缓冲液（6），琼脂糖，溴化乙锭(EB),DNA相对分子质量标准物DNA Marker /Hind ，5mol/L pH 5.2的醋酸钠。四、【实验步骤】1、准备实验配制LB液体培养基，分装到100ml的三角瓶中20ml，300ml的三角瓶中50ml，另配LB固体培养基；准备1000ul、200ul、10ul移液枪尖各一盒，1.5ml离心管若干于500ml三角瓶中，50ml离心管2个 ，将上述物品包好连同配好的培养基一同灭菌。2、菌体培养在含有Ap的LB平板上挑取一环携带有质粒pUC19的E.coli DH5单菌落，接种于20mlLB液体培养基中进行37振荡过夜培养，培养基中加Ap100ul（100ug/ml），质粒pUC19具有Ap抗性基因，使得带有pUC19的质粒得以生长。 过夜培养后菌体量大，杂质较多，然后用移液枪吸取过夜培养物2ml转接于50mlLB液体培养基中，培养基中加入Ap250ul，37振荡培养4-6h至对数生长期后期，生长速率快，代谢旺盛，酶系活跃，杂质少，适合提取质粒。3、质粒提取（1）称量空的50ml离心管的重量为14.331g，然后将三角瓶中的菌液倒至管中，不能倒满，液面距管口约1cm，7000rpm离心5分钟后弃去上清液，收集菌体细胞。（2）向离心管中悬滴加入5ml冰预冷的溶液打散菌体洗涤，用漩涡振荡器使之充分悬浮后用枪尖吹吸混匀，同步骤（1）离心，弃去上清，将离心管倒置于吸水纸上，使上清液全部流尽干燥，然后称重得14.437g，则菌体质量为106mg。（3）洗涤后每100mg菌体应加入冰预冷的溶液1ml，106mg菌体按100mg菌体处理，加入溶液1ml，打散菌泥、吹吸混匀，冰浴5min。溶液中的葡萄糖使溶液密度增加，悬浮后的大肠杆菌不会快速沉积到管子的底部；维持渗透压，防止细胞提前破裂，防止DNA受机械剪切力作用而降解。EDTA是Ca2+和Mg2+等二价金属离子的螯合剂，可抑制DNase的活性，抑制微生物的生长。Tris-Cl溶液提供适当的pH。（4） 按比例加入新配制的溶液2ml（与溶液对应），轻加轻摇，冰浴5min。溶液变清亮透明粘稠如蛋清状。溶液中的NaOH使细胞膜发生了从bilayer（双层膜）结构向micelle（微囊）结构的相变化导致细胞溶解。同时，强碱性使染色体DNA、质粒DNA和蛋白质变性；SDS为下一步沉淀做铺垫。（5）按比例加入冰预冷的溶液1.5ml（与溶液、对应），轻加轻摇，冰浴10min.溶液出现白色絮状沉淀。沉淀为蛋白质SDS复合物、细胞碎片和其他大分子成分。溶液中的HAc中和NaOH，因为长时间的碱性条件会打断基因组DNA，只要是50100 kb大小的片断，就不能再被PDS共沉淀。同时变性的质粒DNA复性。反应形成的高盐环境进一步加速了沉淀。（6）12000rpm离心15min，白色沉淀聚集在离心管一侧，用移液枪将上清液转移到另一洁净的离心管中。然后向上清液中加入1/10体积的3MNaAc混匀，加入2倍体积的冰无水乙醇，混匀，-20下沉降30分钟。乙醇可以任意比和水相混溶，乙醇与核酸不会起任何化学反应，对DNA很安全，因此是理想的沉淀剂。 DNA溶液是DNA以水合状态稳定存在，当加入乙醇时，乙醇会夺去DNA周围的水分子，使DNA失水而易于聚合。在pH为8左右的溶液中，DNA分子是带负电荷的，加一定浓度的NaAc或NaCl，易于互相聚合而形成DNA钠盐沉淀。（7） 以12000rpm离心15min，小心倒去上清液，得到DNA沉淀。加入3ml70%冰乙醇，轻轻地覆盖沉淀，不打散沉淀，洗涤一次。（8）以12000rpm离心5min，离心管底部DNA沉淀所在面应与收集沉淀面一致。去掉上清液，将离心管上沉淀部位做好标记，将离心管倒置于吸水纸上，干燥5min。粗提取的质粒呈浅黄色，随着水分的减少质粒变为无色。所以为了完全溶解质粒，要在离心管上标记质粒所在位置。（9）将DNA沉淀溶于1mlTE缓冲液中，移液枪吹吸助溶，然后将溶解液转移到一个Eppendorf管中。TE是pH缓冲液，为DNA提供稳定的生理状态，呈弱碱性，有利于保护碱基对。同时含有EDTA是二价阳离子的螯合剂，抑制DNA酶作用。4、质粒纯化（1）Eppendorf管中加入RNase A（纯浓度50ug/ml），37保温0.5-1h（2）将上述的溶液平均分配到2个1.5ml的微量离心管中，每管0.5ml，分别加入与溶液等体积的（500ul）Tris饱和苯酚溶液，振荡混匀，7000rpm,离心5min，上清液转移到一洁净的Eppendorf管中。苯酚是经Tris饱和后的，显黄色。苯酚加入后，溶液分层，苯酚向下，下层呈浅黄色，上层溶液无色，在中间产生大量白色沉淀，此为变性后的蛋白质。（3）加入等体积的（500ul）苯酚/氯仿溶液（1:1），振荡混匀， 7000rpm,离心5min，上清液转移到到另一洁净的Eppendorf管中。苯酚是强的蛋白变性剂，但是苯酚留在质粒溶液中会影响DNA的酶切，它本身易被氧化，会损伤质粒。氯仿也是蛋白变性剂，但是比酚弱，且能溶解质粒中的脂类，溶解苯酚，去除溶液中的苯酚。异戊醇则可起消除抽提过程中出现的泡沫，有利于分层更明显。此时溶液中已看不到明显的白色沉淀，但仍有蛋白质的存在。 (4)加入等体积的氯仿溶液，振荡混匀， 7000rpm,离心5min，上清液转移到一洁净的Eppendorf管中,得上清液400ul。（5）向上清液中加入1/10体积的NaAc混匀，再加入2倍体积的冰无水乙醇，混匀，-20下沉降30分钟。（6）以12000rpm,离心15min，弃去上清液，得到DNA沉淀，为白色。（7）向DNA沉淀中加入70%冰乙醇200ul，不打散沉淀，洗涤。然后以12000rpm离心5min，离心管底部DNA沉淀所在面应与收集沉淀面一致。（8）去掉上清液，将离心管倒置于吸水纸上，室温干燥。用50ulTE溶解于1管中。5、质粒检测（1）称取0.4g的琼脂糖，置于一锥形瓶中，在三角瓶上标好液面位置，加入40ml的1TAE电泳缓冲液，再加入5-10ml重蒸水，以补充在溶胶过程中损失的水分。然后置微波炉加热至完全溶化，溶液透明。冷却至50左右，倒入制板槽制板。（2）待胶凝固后，小心拔起梳子，使加样孔端置阴极段放进电泳槽内。在槽内加入1TAE 电泳缓冲液，至液面覆盖过胶面2-3cm。取1l加电泳载样液和3l质粒样品于小纸片上，用移液枪混匀。（3）电泳1h,观察溴酚兰的带（蓝色）的移动。 (4) 把胶槽取出，小心滑出胶块,放进EB溶液中进行染色，完全浸泡约5min。 (5)凝胶成像仪观察。五、【注意事项】（1）滴加溶液II时，要逐滴加入，且要轻加轻摇溶液使之混匀，整体动作要快，因为强碱在溶液中停留时间不能过长，否则会破坏质粒DNA。（2）加入溶液III后，生成了大量的絮状沉淀，溶液III中和强碱使质粒复性，不可剧烈震荡， 防止染色体DNA断裂，应该上下颠倒离心管，使其混匀。（3）加入溶液III沉淀离心后，转移上清液时，白色沉淀聚集在离心管一侧，上清液澄清。取离心管时，不改变其倾斜度，斜着插进枪尖，切勿触碰下部沉淀，吸取时，尽可能多的吸取上清液。（4）干燥沉淀时，将上清液倒去后，保持管口朝下，防止水分倒流。（5）用70%乙醇洗涤时，不打散沉淀洗涤盐分。枪尖深入离心管中，把液体打到沉淀的上面，然后转动离心管，使沉淀被液体覆盖。离心时，小心放置离心管位置，不改变质粒沉降位置，沉淀面朝外。粗提取的质粒呈浅黄色，随着水分的减少质粒变为无色，为了完全溶解质粒，要在离心管上标记质粒所在位置。 （6）吹洗法混匀少量液体时需注意避免产生气泡，防止因气泡无法回收而损失样品。用微量移液器吸进液体时应该小心，避免产生气泡；吹出液体时，不要将液体从针尖口完全吹出，要留一滴在针尖口处，可预防气泡的产生。同时，溶解沉淀时，针尖应该在沉淀的最高处吹吸，可使沉淀慢慢溶解，不至于损失。（7）苯酚是经Tris饱和后的。苯酚加入后，溶液分层，苯酚在下，中间产生大量白色沉淀，此为变性后的蛋白质。离心后，取离心管时不改变离心管的倾斜角度，用黄色枪尖吸取上层清液。尽可能多的吸取上清液，但不要吸入蛋白质。（8）加入电泳缓冲液液前，先用水在三角瓶上标好40ml液面位置，加入TAE后，再加入5-10ml重蒸水，以补充在溶胶过程中损失的水分。加热时，放置在微波炉轮盘边缘，用中火加热3min，加热后，若液面低于标线，用枪尖沿着三角瓶边缘慢慢加入重蒸水补足，并轻轻混匀，防止产生气泡。（9）加样时枪尖应恰好置于凝胶点样孔正上方1mm左右处，枪尖要直立，枪头要没入液面以下，不可触到点样孔底部，防止刺穿凝胶，也要防止样品溢出孔外。DNA分子在缓冲液中带负电荷，在电场中向正极移动，点样孔应靠近负极。（10）实验中使用的EB为强致癌物质，所有操作必须按照要求戴一次性手套在EB污染区操作，防止污染其他区域（11）酚具有腐蚀性，能损伤皮肤和衣物，使用时应小心，配戴一次性手套。如不小心将酚碰到皮肤上，立即用碱性溶液及清水大量清洗。六、【实验结果及分析】1、琼脂糖凝胶电泳图谱 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18图1 DNA纯度检测凝胶成像结果（1号泳道：pUC19 DNA；2号泳道：Hind酶解的 DNA Marker；3号泳道：超螺旋质粒DNA Marker；4-16号泳道：1至12组样品DNA；16泳道：Hind酶解的DNA Marker；17、18号泳道：未加RNA酶的质粒DNA样品）2、结果分析(1)如图所示，我们组样品在第9泳道，照片显示本组样品的亮度较高，说明得到的超螺旋状态的pUC19质粒DNA的浓度较高。与3号泳道的Marker比较，我们提取的pUC19DNA大小在2.7kbp左右。与1号泳道的pUC19 DNA比较，可估计我们组的超螺旋pUC19NDA的量应为1号泳道的4倍左右，因标准的pUC19质粒样品为200ng，所以我们组的pUC19 DNA的含量约为200ng/ml左右。 (2)由电泳原理可知，亮度最亮的一条带是分子量最小的超螺旋DNA,然后依次是部分断键质粒DNA和线性质粒DNA,其间散布着断裂的染色体DNA.最后位于点样孔及其附近的亮带是没有除尽的包含有DNA的蛋白质.质粒下面的一些亮斑，可能是未完全消化的RNA或者是小分子的DNA。（3）由电泳图可知，本组结果中线型DNA和开链DNA含量较多。分析原因：震荡剧烈，使超螺旋DNA断裂，成线型和开链DNA。提取过程中混入了DNA酶或类似物质，使超螺旋DNA断裂。未把握好复性的时机，过早对其离心，从可使超螺旋DNA复性不完全。都会使线形和开链DNA增多。另外震荡过程中染色体DNA的断裂也可造成这一现象。(5) 本组点样孔附近的亮线较明显，表明有含DNA的蛋白质存在。这主要是由于在用苯酚、氯仿抽提的过程中操作不好所致，在一系列的转移中不小心掺入蛋白。我觉得最可能的原因是在转移上清液的时候，由于在转移过程中没有很好的保持角度，所以导致蛋白质层混到液层中，使得转移的上清液中蛋白质未除尽。(6) 在电泳图下方出现RNA条带，说明有少量RNA残余，可能的原因是RNA酶反应时间不够或者反应混合不充分。(7) 综合分析可知，在实验过程中的规范操作显得尤为重要。在实验过程的稍微偏差或不当，都会影响实验结果的准确性，因此，在分子实验中，要保证每一步实验都要规范小心，一定要注意操作中不要掺入杂质，确保实验结果准确。七、【实验分析】 实验中所用试剂作用： 葡萄糖：增加溶液的粘度，维持渗透压，防止DNA受机械力的作用而降解。 EDTA：Mg2+ 、Ca2+ 的螯合剂，可抑制DNA酶的活性，防止DNA被酶降解。 NaOH-SDS：NaOH强碱，提供pH12的碱性条件，使DNA双链变性。SDS-溶解细胞膜蛋白和细胞内蛋白，并结合成“蛋白-SDS”复合物，使蛋白质变性沉淀。 NaAC-HAC缓冲液：冰醋酸把醋酸钠溶液的pH调到4.8。用来中和NaOH变性液，使DNA复性。 乙醇：用于沉淀DNA，DNA分子以水合状态“溶于”水里，乙醇能夺去DNA分子的水环境。 RNase：降解RNA渣滓，以免提取后的DNA中含有小分子的RNA。 TE缓冲液：DNA的保存液，由Tris-HCl和EDTA配制。Tris-HCl不含金属离子，有利于以后操作；EDTA抑制DNA酶，防止DNA被酶降解。 苯酚：强的蛋白阻断剂，可使蛋白变性；氯仿也是蛋白阻断剂，但强度弱于苯酚，其主要作用是将同水以极小比例互溶的苯酚萃取出来。如果不加氯仿，残留的苯酚会阻碍酶切反应等，且水饱和酚的密度略轻于水，苯酚相位于上层，不利于获得含质粒的水相，加入氯仿后可以增加比重，使得酚/氯仿始终在下层，方便水相的回收；异戊醇则可起消除抽提过程中出现的泡沫，有利于分层更明显。 loadingbuffer：增大样品密度，确保DNA均匀进入样品孔内；以溴酚蓝及二甲苯氰作为双色电泳指示剂，使样品呈现颜色，了解样品泳动情况，使操作更为便利。 八、【实验总结】 通过这次实验，我基本掌握了质粒DNA提取、纯化及检测的原理和方法。更重要的是，我明白了在分子生物学实验中规范操作的重要性。在实验过程中，我们需要时刻牢记自己所提取之物在哪，操作中时刻注意不要引入杂质，时刻明白自己的操作将会对实验结果造成的影响。只有规范的操作，才能保证提取物的纯度和实验结果的准确。总之，分子生物学实验中养成的规范和谨慎的态度必将让我受益匪浅。九、【附录】培养基及实验试剂配方：1. LB（Luria Broth）培养基 LB液体培养基：1%蛋白胨（typtone），0.5%酵母粉（yeast extract），1%NaCl。用NaOH调pH至7.2, 121灭菌20min备用。 LB固