高效液相色谱分析基础

2019/11/20,高效液相色谱分析基础,第一节HPLC概述,一、液相色谱理论发展简况briefintroductionofHPLC二、HPLC的特点和优点CharacteristicsandmeritsofHPLC,fundamentalofHighPerformanceLiquidChromatography,HPLC,generalizationofHPLC,三、HPLC与GC的比较ComparebetweenHPLCH2;He2等）称为载气HPLC中使用的流动相为液体（石油醚；甲醇；水等等）称为洗脱液。2.进样方式不同：GC中被测化合物必须汽化HPLC中被测化合物为液体3.被测化合物在系统中的状态不同：在GC中为气体or液体；在HPLC为液体,2019/11/20,概述：GC与HPLC的区别（2）,4.被测化合物不同：GC所分析的化合物多为小分子有机化合物，能汽化，大多为化工原料。HPLC所分析的化合物多为大分子有机化合物，不能汽化，大多为化工产品（医药，农药，生命物质）5.运行费用不同：GC低HPLC较高,2019/11/20,二、HPLC的特点和优点,HPLC与经典液相色谱相比有以下优点：,速度快-通常分析一个样品在1530min，有些样品甚至在5min内即可完成。分辨率高-可选择固定相和流动相以达到最佳分离效果。灵敏度高-紫外检测器可达0.01ng，荧光和电化学检测器可达0.1pg。柱子可反复使用-用一根色谱柱可分离不同的化合物。样品量少，容易回收-样品经过色谱柱后不被破坏，可以收集单一组分或做制备。,2019/11/20,二、HPLC的特点和优点,HPLC与经典液相色谱相比有以下优点：,2019/11/20,液相色谱的检测模式,灵敏度、选择性、及适应能力,2019/11/20,HPLC使用的模式,2019/11/20,HPLC分离的机理,2019/11/20,典型的仪器配置,2019/11/20,典型的仪器配置,2019/11/20,2019/11/20,2019/11/20,色谱理论：色谱洗脱过程,2019/11/20,色谱理论：色谱流出曲线及有关术语,1.基线无试样通过检测器时，检测到的信号即为基线。2.保留值（1）时间表示的保留值保留时间（tR）：组分从进样到柱后出现浓度极大值时所需的时间。死时间（tM）：固定相不保留的气体（如空气）的保留时间。调整保留时间（tR）：tR=tRtM（2）用体积表示的保留值保留体积（VR）：VR=tRF0（F0为流动相的流速,单位:ml/min)死体积（VM）：VM=tMF0调整保留体积（VR）：VR=VRVM,2019/11/20,色谱理论：色谱流出曲线及有关术语,2019/11/20,色谱理论：色谱流出曲线及有关术语,3.相对保留值r21组分2与组分1调整保留值之比：r21=tR2/tR1=VR2/VR1相对保留值只与柱温和固定相性质有关，与其他色谱操作条件无关，它表示了固定相对这两种组分的选择性。4.区域宽度用来衡量色谱峰宽度的参数，有三种表示方法：（1）标准偏差（s）：即0.607倍峰高处色谱峰宽度的一半。（2）半峰宽（Y1/2）：色谱峰高一半处的宽度Y1/2=2.354s（3）峰底宽（Wb）：Wb=4s,2019/11/20,色谱理论：容量因子与分配系数,分配系数是色谱分离的基础，但分配系数K是指组分在两相间的浓度比，由于不能直接计算出组分在两相中的动态浓度，故也不能由此计算获得分配系数值。K=Cs/CmCs为组分在固定相中的浓度，Cm为组分在流动相中的浓度。容量因子是指在一定条件下，组分在两相间达到分配平衡时的质量比。在实际工作中，常应用另一表征色谱分配平衡过程的重要参数容量因子(capacityfactor)，也称分配比(partitionratio)，以k表示。k=Ms/MmMs为组分在固定相中的质量，Mm为组分在流动相中的质量。,2019/11/20,色谱理论：容量因子与分配系数,容量因子k与分配系数K的关系为：K=Cs/Cm式中：Vm为色谱柱中流动相体积。Vs为色谱柱中固定相颗粒间的空隙体积。对于不同类型的色谱分析，Vs有不同表述。Vs与Vm之比称为相比，它表征色谱柱类型和内部结构的参数。,2019/11/20,色谱理论：容量因子与分配系数,RS=uS/uRS也可用质量比表示，则：组分和流动相通过长度为L的色谱柱所需的时间分别为：由以上关系式可得：tR=tM（1+k）由保留时间计算出容量因子，即可由实验测定容量因子k。,2019/11/20,色谱理论：塔板理论-柱分离效能指标,色谱柱与蒸馏塔具有相同的分离功能，将色谱柱比拟成蒸馏塔，色谱柱长相当于塔高。若色谱柱长：L，虚拟的塔板间距离：H，色谱柱的理论塔板数为n，则三者的关系为：n=L/H理论塔板数与色谱参数之间的关系为：,2019/11/20,色谱理论：塔板理论-柱分离效能指标,讨论：（1）单位柱长的塔板数越多，表明柱效越高。（2）用不同物质计算可得到不同的理论塔板数。（3）组分在tM时间内不参与柱内分配。故需要引入有效塔板数和有效塔板高度。有效塔板数和有效塔板高度：,2019/11/20,3-2影响色谱峰扩展及色谱分离的因素,速率理论是荷兰学者范弟姆特于1956年提出的,表述了影响柱效的因素及提高柱效的多种途径，其核心是速率方程（也称范弟姆特方程式）。速率方程H=A+B/u+CuH：理论塔板高度；u：流动相的线速度(cm/s),2019/11/20,色谱理论：速率理论-影响柱效的因素,1.He涡流扩散项He=2dpdp：固定相的平均颗粒直径；：固定相的填充不均匀因子。讨论：固定相颗粒越小dp，填充的越均匀，A，H，柱效n。表现在涡流扩散所引起的色谱峰变宽现象减轻，色谱峰较窄。,2019/11/20,色谱理论：速率理论-影响柱效的因素,2.B/u分子扩散项Cd：常数，Dm：试样组分分子在气相中的扩散系数（cm2s-1）讨论：1.存在着浓度差，产生纵向扩散，扩散导致色谱峰变宽，分离变差。2.分子扩散项与流速有关，流速，滞留时间，扩散。3.液相中纵向扩散项对色谱峰的影响基本可以忽略。4.扩散系数Dm与柱温成正比，T,B值5.扩散系数Dm与柱压成反比，P,B值,2019/11/20,色谱理论：速率理论-影响柱效的因素,3.cu传质阻力项（1）固定相传质阻力项主要发生在液-分配色谱分析中试样分子从流动相进入到固定液内进行质量交换过程取决与固定液的液膜厚度df，以及试样分子在固定液内的扩散系数（2）流动传质阻力项在流动相中的传质和滞留的流动相中的传质,2019/11/20,色谱理论：速率理论-影响柱效的因素,（1）流动相中的传质阻力项；（2）滞留传质阻力项。（3）柱内色谱峰展开引起塔板高度变化,2019/11/20,色谱理论：速率理论-影响柱效的因素,H=A+B/u+Cu,2019/11/20,3-3高效液相色谱的分离原理,分类,1、液-液色谱法,液-液色谱法；液-固色谱法；离子交换色谱法；离子对色谱法；离子色谱法；空间排阻色谱法,正相液-液色谱：流动相的极性小于固定相反相液-液色谱：流动相的极性大于固定想,2019/11/20,2液-固色谱法（吸附平衡）,Xm,Xa分别表示流动相和被吸附的溶质分子Sa代表被吸附在表面上的溶剂分子Sm表示在流动相中的溶剂分子N表示被吸附的溶剂分子数,载体：硅胶,2019/11/20,3离子交换色谱,离子交换色谱是以离子交换树脂作为固定相，树脂上具有固定离子基团及可交换的离子基团，当流动相带着组分电离生成的离子通过固定相时，组分离子与树脂上可交换的离子基团进行可逆交换，根据组分离子对树脂亲和力不同而得到分离。按结合的基团不同，离子交换树脂可分为阳离子交换树脂和阴离子交换树脂。,2019/11/20,种类,阳离子交换树脂,强酸性,弱酸性,阴离子交换树脂,强碱性,弱碱性,2019/11/20,阳离子交互,阴离子交互,平衡常数Kx,2019/11/20,分配系数Dx,能在水溶液或含水极性溶剂中产生游离离子基团的酸、碱及两性成分。可用于氨基酸、肽类、生物碱、有机酸、酚类等水溶性成分的分离。,2019/11/20,4离子对色谱法,2019/11/20,使用离子交换剂使物质分离表样品强酸型(磺酸型)稀NH4OH洗脱通过液酸性、中性化合物解离型、两性化合物稀NaOH洗脱强碱型(季铵型)强碱型稀HCl洗脱通过液通过液酸性化合物中性化合物解离型物质两性化合物(盐、生物碱),2019/11/20,一、离子交换色谱的分离机理,1、,不足之处：忽略了在填料表面上形成复合物时溶质被流动相中小分子饱和并不断进行计量置换反应的重要因素。,2019/11/20,3-4液相色谱法固定相,液-液色谱法和离子对色谱法的固定相液液色谱的固定相由担体（载体）和固定液组成。常用的载体有下列几类：（1）全多孔型担体SiO2、Al2O3、硅藻土多孔球型颗粒影响柱效的主要因素：涡流扩散项和传质阻力项提高柱效的主要方法：减小颗粒粒径和提高填充均匀性,2019/11/20,（2）表层多孔型担体,又称为薄壳型微珠担体。它的基体是实心玻璃球，在玻璃球外面覆盖一层多孔活性材料，如硅胶、氧化硅、离子交换剂、分子筛、聚酰胺等。优点：这类固定相的多孔层厚度小、孔浅，相对死体积小，出峰迅速、柱效亦高；颗粒较大，渗透性好，装柱容易，梯度淋洗时能迅速达到平衡，较适合做常规分析。缺点：由于多孔层厚度薄，最大允许量受到限制。,2019/11/20,（3）化学键合固定相,上述两种固定相将固定液机械地涂渍在担体上组成固定相，尽管选用与固定液不互溶的溶剂作流动相，但在色谱过程中固定液仍会有微量溶解。以及流动相经过色谱柱的机械冲击，固定相会不断流失，即使将流动相预先用固定相液体饱和或在色谱柱前加一个前置柱，使流动相先通过前置柱，再进入色谱柱，但仍难以完全避免固定液的流失。70年代初发展了一种新型的固定相化学键合固定相。这种固定相是通过化学反应把各种不同的有机基团键合到硅胶（载体）表面的游离羟基上，代替机械涂渍的液体固定相。这不仅避免了液体固定相流失的困扰，还大大改善了固定相的功能，提高了分离的选择性，化学键合色谱适用于分离几乎所有类型的化合物。,2019/11/20,化学键合固定相分类,根据硅胶表面上的硅羟基与各种有机分子的化学反应的不同，键合相可分为四种键型：（1）硅酸酯型（=Si-O-C=）键合相将醇与硅胶表面的羟基进行酯化反应，在硅胶表面形成（=Si-O-C=）键合相。反应生成单分子层键合相。一般用极性小的溶剂洗脱，分离极性化合物。（2）硅氮型（=Si-N=）键合相如果用SOCl2将硅胶表面的羟基先转化成卤素（氯化），再与各种有机胺反应，可以得到各种不同极性基因的键合相。可用非极性或强极性的溶剂作为流动相。,2019/11/20,（3）硅碳型（=Si-C=）键合相将硅胶表面氯化后，使Si-Cl键转化为Si-C键。在这类固定相中，有机基团直接键合在硅胶表面上。（4）硅氧烷型（=Si-O-Si-C=）键合相将硅胶与有机氯硅烷或烷氧基硅烷反应制备。这类键合相具有相当的耐热性和化学稳定性，是目前应用最为广泛的键合相。,2019/11/20,化合键合色谱法分类,根据键合相与流动相之间相对极性的强弱，可将键合相色谱分为极性键合相色谱和非极性键合相色谱。在极性键合相色谱中，由于流动相的极性比固定相极性要小，所以极性键合相色谱属于正相色谱。弱极性键合相既可作为正相色谱，也可作为反相色谱。但通常所说的反相色谱系指非极性键合色谱。反相色谱在现代液相色谱中应用最为广泛。,2019/11/20,反相键合相色谱法在反相色谱中，一般采用非极性键合固定相，如硅胶-C18H37（简称ODS或C18）硅胶-苯基等，用强极性的溶剂为流动相，如甲醇/水，乙腈/水，水和无机盐的缓冲液等。在反相键合相色谱中，极性大的组分先流出，极性小的组分后流出。目前，对于反相色谱的保留机制还没有一致的看法，大致有两种观点：一种认为属于分配色谱，另一种认为属于吸附色谱。分配色谱的作用机制假设混合溶剂（水+有机溶剂）中极性弱的有机溶剂吸附于非极性烷基配合基表面，组分分子在流动相中与被非极性烷基配合基所吸附的液相中进行分配。,2019/11/20,吸附色谱的作用机制把非极性的烷基键合相，看作是在硅胶表面上覆盖了一层键合的十八烷基的“分子毛”，这种“分子毛”有强的疏水特性。当用水与有机溶剂所组成的极性溶剂为流动相来分离有机化合物时，一方面，非极性组分分子或组分分子的非极性部分，由于疏溶剂的作用，将会从水中被“挤”出来，与固定相上的疏水烷基之间产生缔合作用。另一方面，被分离物的极性部分受到极性流动相的作用，使它离开固定相，减少保留值，此即解缔过程。显然，这两种作用力之差，决定了分子在色谱中的保留行为。一般地，固定相的烷基配合基或分离分子中非极性部分的表面积越大，或者流动相表面张力及介电常数越大，则缔合作用越强，分配比也越大，保留值越大。,2019/11/20,正相键合色谱法在正相色谱中，一般采用极性键合固定相，硅胶表面键合的是极性的有机基团，键合相的名称由键合上去的基团而定。最常用的有氰基（-CN）、氨基（-NH2）、二醇基（DIOL）键合相。流动相一般用比键合相极性小的非极性或弱极性有机溶剂，如烃类溶剂，或其中加入一定量的极性溶剂（如氯仿、醇、乙腈等），以调节流动相的洗脱强度。通常用于分离极性化合物。一般认为正相色谱的分离机制属于分配色谱。组分的分配比K值随其极性的增加而增大，但随流动相中极性调节剂的极性增大（或浓度增大）而降低。同时，极性键合相的极性越大，组分的保留值越大。该法主要用于分离异构体，极性不同的化合物，特别是用来分离不同类型的化合物。,2019/11/20,离子性键合相色谱法当以薄壳型或全多孔微粒型硅胶为基质化学各种离子交换基团如-SO3H,-CH2NH2,-COOH,-CH2N(CH3)Cl等时，形成了所谓的离子性键合色谱。其分离原理与离子交换色谱一样，只是填料是一种新型的离子交换剂而已。,2019/11/20,化学键合色谱具有下列优点：（1）适用于分离几乎所有类型的化合物。一方面通过控制化学键合反应，可以把不同的有机基团键合到硅胶表面上，从而大大提高了分离的选择性；另一方面可以通过改变流动相的组成合乎种类来有效地分离非极性、极性和离子型化合物。（2）由于键合到载体上的基团不易被剪切而流失，这不仅解决了由于固定液流失所带来的困扰，还特别适合于梯度洗脱，为复杂体系的分离创造了条件。（3）键合固定相对不太强的酸及各种极性的溶剂都有很好的化学稳定性和热稳定性。（4）固定相柱效高，使用寿命长，分析重现性好。,2019/11/20,2.液-固吸附色谱法固定相,液固色谱的固定相是固体吸附剂。吸附剂吸附试样的能力，主要取决于吸附剂的比表面积和理化性质，试样的组成和结构以及洗脱液的性质等。各种吸附剂中，最常用的吸附剂是硅胶，其次是氧化铝。在现代液相色谱中，硅胶不仅作为液固吸附色谱固定相，还可作为液液分配色谱的载体和键合相色谱填料的基体。,2019/11/20,液固色谱法采用的固体吸附剂分类按其性质可分为极性和非极性两种类型。极性吸附剂包括硅胶、氧化铝、氧化镁、硅酸镁、分子筛及聚酰胺等。非极性吸附剂最常见的是活性炭。极性吸附剂可进一步分为酸性吸附剂和碱性吸附剂。酸性吸附剂包括硅胶和硅酸镁等，碱性吸附剂有氧化铝、氧化镁和聚酰胺等。酸性吸附剂适于分离碱，如脂肪胺和芳香胺。碱性吸附剂则适于分离酸性溶质，如酚、羧和吡咯衍生物等。,2019/11/20,3、离子交换色谱法固定相,离子交换色谱以离子交换树脂为固定相，树脂上具有固定离子基团及可交换的离子基团。离子交换色谱法固定相分类按制备方法分类薄膜型离子交换树脂:在惰性的玻璃微珠上涂布离子交换树脂而成。离子交换键合固定相：用化学反应将离子交换基团键合在惰性担体表面而成。,2019/11/20,按结合的基团分类阳离子交换树脂其上具有与阳离子交换的基团。阳离子交换树脂又可分为强酸性和弱酸性树脂。强酸性阳离子交换树脂所带的基团为-SO3-H+，其中-SO3-和有机聚合物牢固结合形成固定部分，H+是可流动的能为其它阳离子所交换的离子。阴离子交换树脂具有与样品中阴离子交换的基团。阴离子交换树脂也可分为强碱性和弱碱性树脂。,2019/11/20,4、空间排阻色谱法固定相,排阻色谱的色谱柱的填料是凝胶，它是一种表面惰性，含有许多不同尺寸的孔穴或立体网状物质。所谓凝胶，指含有大量液体（一般是水）的柔软而富有弹性的物质，它是一种经过交联而具有立体网状结构的多聚体。排阻色谱的固定相一般按机械强度进行那个分类：软质、半硬质和硬质凝胶三类。,2019/11/20,（1）软质凝胶如葡聚糖凝胶、琼脂糖凝胶都具有较小的交联结构，其微孔能吸入大量的溶剂，并能溶涨到它干体的许多倍。它们适用于水溶性作流动相，一般用于常压排阻法分析小分子质量物质，不适宜在高压液相色谱。,Sephadex葡聚糖凝胶,2019/11/20,（2）半硬质凝胶如高交联度的聚苯乙烯。常以非极性有机溶剂作流动相。（3）硬质凝胶如多孔硅胶、多孔玻璃等，它们既可用水溶性溶剂，又可用有机溶剂作流动相，可在较高压强和较高流速下操作。,2019/11/20,3-5液相色谱法流动相,液相色谱流动相选择的重要性：在液相色谱中，流动相的种类、配比能显著影响分离的效果。,2019/11/20,1、流动相的选择原则易于制成高纯度，即色谱纯。化学性质稳定，不损坏柱子。样品易溶，且溶解度尽可能大。粘度低，流动性好。不妨碍检测器检测，紫外波长处无吸收。无毒或低毒，易于操作。易于从其中回收样品。废液易处理，不污染环境。,2019/11/20,2、液-液分配色谱金流动相流动相极性是最重要的参考依据。除一般要求外，还要求流动相对固定相的溶解度尽可能小，因此。固定液和流动相的性质往往处于两个极端。1.反相色谱最常用的流动相及其冲洗强度如下：H2O甲醇乙腈乙醇丙醇异丙醇四氢呋喃最常用的流动相组成是：“甲醇H2O”和“乙腈H2O”，由于乙腈的剧毒性，通常优先考虑“甲醇H2O”流动相。2.正相色谱常用的流动相及其冲洗强度的顺序是：正己烷乙醚乙酸乙酯异丙醇最常用的是正已烷，虽然其价格较贵，但80的顺、反和邻位、对位异构体仍然要用正相色谱来进行分离。,2019/11/20,3、液-固吸附色谱流动相在液-固色谱中，选择流动相的基本原则是极性大的试样用极性较强的流动相，极性小的则用低极性流动相。为了获得合适的溶剂极性，常采用两种、三种或更多种不同极性的溶剂混合起来使用，如果样品组分的分配比k值范围很广则使用梯度洗脱。,2019/11/20,4、离子交换色谱流动相离子交换树脂的流动相最常使用水缓冲溶液，溶液中的离子种类、离子强度和溶液的pH对试样组分的保留值有重要的影响。有时也使用有机溶剂如甲醇或乙醇同水缓冲溶液混合使用，以提高特殊的选择性，并改善样品的溶解度。,2019/11/20,离子交换容量受流动相的pH值影响,2019/11/20,改变流动相pH值，也会影响弱电离的酸性或碱性组分的电离情况，因而改变组分的保留值。流动相pH值的变化也能改变分离的选择性对流动相pH值的控制，通常采用缓冲溶液来实现。,2019/11/20,无论在强的还是弱的阴离子交换柱上，蛋白质均显示不同pH值影响结果，因此决定了它的保留选择性、分离度和回收率等因素。,2019/11/20,5、排阻色谱法流动相在体积排阻色谱法中，主要依据凝胶的孔容和孔径于样品分子量大小及分子量分布的相互匹配来实现样品中组分的分离，而一样品-流动相之间的相互作用无关。因此，在体积排阻色谱法中，不采用通过改变流动相组成的方法来改善分离度。选择流动相主要考虑：（1）对样品的溶解能力流动相能充分溶解样品，以获得良好的分离效果。（2）与凝胶固定相相匹配浸润凝胶，防止凝胶的吸附作用。使用软质凝胶时，能是凝胶溶胀。,2019/11/20,（3）与检测器相匹配示差折光检测器：流动相与样品的折光指数的差异尽可能大。紫外吸收检测器：对检测波长无吸收。（4）粘度高分子的扩散系数小，尽可能选择低粘度溶剂作为流动相,2019/11/20,凝胶渗透色谱的流动相,凝胶渗透色谱常采用甲苯，四氢呋喃和氯仿等有机溶剂作流动相。在用于高聚物分子量测定的凝胶渗透色谱中，四氢呋喃是最常用的流动相，它对样品有良好的溶解性能和低的黏度，并可使小孔径聚苯乙烯凝胶溶胀，因此被优先推荐使用。,2019/11/20,2019/11/20,凝胶过滤色谱的流动相,在凝胶过滤色谱中，使用以水作基体具有不同PH值的多种缓冲溶液作流动相。,2019/11/20,2、,P0：流动相中溶质的浓度,Pb：填料表面上被吸附的溶质浓度,D0：流动相中洗脱剂的浓度,Db：填料表面上洗脱剂的浓度,Z：是蛋白质在吸附过程中从填料表面上被置换的洗脱剂的数目。,2019/11/20,Z可以小到忽略不计，反应常数变为分配系数,在Z值不能忽略时,2019/11/20,在等度洗脱蛋白质的过程中，容量因子K与保留体积成比例，同时洗脱过程中，Kd，Db是常数，用Kz表示。,2019/11/20,3结论,二、离子交换色谱的固定相,1、高分子类型填料,优点,a填料的使用寿命长,b具有较高的色谱容量,c很少有非特异性吸附，对于保持样品生物活性有利。,2019/11/20,结构,以交联共聚的苯乙烯-二乙烯苯为基质，同时也出现了许多其他交联高聚物基质的固定相。,类型,MonoBeads,TSK-gelDEAE-5PW,SP-5PW,CM-5PW,2019/11/20,2、无机基质型,三、离子交换色谱的流动相,1、流动相的PH值,离子交换容量受流动相的PH值影响,2019/11/20,改变流动相PH值，也会影响弱电离的酸性或碱性组分的电离情况，因而改变组分的保留值。,流动相PH值的变化也能改变分离的选择性,对流动相PH值的控制，通常采用缓冲溶液来实现。,2019/11/20,2、流动相的离子强度,四、离子交换色谱的影响因素,1、填料孔径的影响,2、柱长的影响,3、流速的影响,4、PH值的影响,2019/11/20,液-固色谱法,液-固色谱法通常称为吸附色谱,1、载体：硅胶,2、吸附剂吸附试样的能力,2019/11/20,第六节键合相色谱法,一、正相色谱法,1、在正相色谱法中共价结合到载体上的基团都是极性基团。,2、分离机制属于分配色谱,3、主要用于分离极性不同的化合物，特别是用来分离不同类型的化合物。,2019/11/20,二、反相色谱,1、分离机理,2、固定相,3、流动相,2019/11/20,无论在强的还是弱的阴离子交换柱上，蛋白质均显示不同PH值影响结果，因此决定了它的保留选择性、分离度和回收率等因素。,2019/11/20,5、离子强度的影响,第八节体积排阻色谱法,一、分离机理,1、体积排阻色谱法（SEC）或空间排阻色谱法（SEC）或凝胶色谱法,2、凝胶过滤色谱法（GFC）,2019/11/20,Sephadex葡聚糖凝胶,2019/11/20,3、凝胶渗透色谱法（GPC）,4、空间排斥理论,2019/11/20,V0死体积，相当于凝胶的粒间体积,Vs色谱柱中凝胶的孔穴总体积,2019/11/20,二、体积排阻色谱法的特点,2019/11/20,三、体积排阻色谱法的固定相,（一）固定相的分类,1、按固定相基质分类,2、按固定相机械强度分类,2019/11/20,（二）凝胶固定相的特性参数,1、渗透极限,2、分离范围,2019/11/20,3、固流相比,在SEC中常将柱中凝胶孔体积中的溶剂称为固定相，而将柱中凝胶颗粒间空隙体积中称为流动相，而凝胶孔体积与凝胶颗粒间空隙体积的比值称作固流相比。,4、柱效,2019/11/20,（三）凝胶色谱柱的制备及谱图的特点,物理因素影响凝胶色谱柱的性能,扩大分离范围使用两根以上的串联色谱柱。,更换流动相,2019/11/20,谱图的特点：在凝胶渗透色谱中，对不同分子量聚合物色谱峰的谱带展宽不同于其它液相色谱。,在低效排租色谱法，样品分子大小随V的增加而急剧减小，而柱效却随样品分子量的增加而增大因此在色谱图上，不同分子量组分的谱带宽度保持不变。,在高效排租色谱法，峰宽却是个变量。,2019/11/20,四、体积排租色谱法的流动相,在体积排租色谱法中，流动相的性质对保留值和分离选择性无影响。,溶解样品的良溶剂,低黏度溶剂,柱填料不能在溶剂作用下收缩或溶胀,2019/11/20,控制流动相的PH值和离子强度,凝胶渗透色谱示差折光检测器流动相的折射率必须尽可能与样品的折射率有较大的差别。凝胶过滤色谱紫外吸收检测器使用在检测波长无紫外吸收的溶剂作流动相。,2019/11/20,（一）凝胶渗透色谱的流动相,凝胶渗透色谱常采用甲苯，四氢呋喃和氯仿等有机溶剂作流动相。,在用于高聚物分子量测定的凝胶渗透色谱中，四氢呋喃是最常用的流动相，它对样品有良好的溶解性能和低的黏度，并可使小孔径聚苯乙烯凝胶溶胀，因此被优先推荐使用。,2019/11/20,2019/11/20,（二）凝胶过滤色谱的流动相,在凝胶过滤色谱中，使用以水作基体具有不同PH值的多种缓冲溶液作流动相。,五、体积排租色谱的影响因素,1、填料,化学键合的硅胶,亲水树脂凝胶,2019/11/20,2、柱长,体积排租色谱的分离度与柱长的平方根成正比。,3、洗脱液,以硅胶为基质的填料，PH值范围在2.0-8.0。,键合硅胶如TSK系列凝胶柱在分离蛋白质时保留时间主要取决于填料表面上的硅醇基与离子的反应。,2019/11/20,a)洗脱液离子强度低时,b)洗脱液离子强度低增加到0.3-0.5mol/L,c)常用磷酸盐和硫酸盐进行离子强度的调节,d)用氯化钠作离子剂，疏水作用最小,e)PH值不能太低，因为H+会腐蚀不锈钢柱,2019/11/20,4、流速,蛋白质分离时，流速对分离度的影响是一个很重要的因素，一般在低流速下蛋白质分离是比较理想。,5、样品容量,进样体积和样品的浓度将明显地影响蛋白质的分离度。,样品的浓度范围一般在0.01%-0.5%.,2019/11/20,最好是高浓度、小体积、在一般范围内可以得到好的分离效果。蛋白质的样品体积为柱体积的1%-3%比较合适。,6、蛋白质在变性条件下的分离,变性溶剂如6mol/L盐酸胍、8mol/L脲、0.1%十二烷基硫酸钠(SDS)等有助于精确地确定蛋白质的分子量。,在变性溶剂中，柱的分离范围因此而移到低分子量范围内。,2019/11/20,示例：用高效凝胶过滤色谱法(HPGFC)测定重组人肿瘤坏死因子(rh-TNF)衍生物的相对分子量,rh-TNF属基因工程药物，其相对分子量的测定是该药质量控制的主要指标之一。,仪器与色谱条件：岛津LC-10AHPLC色谱柱：BeckmanUltraspherogelSEC3000(30cm7.5cm)流动相0.1mmol/LKH2PO4:0.1mmol/LNa2SO4(1:1)+0.05%NaN3,流速:1mL/min检测波长:280nm,2019/11/20,标准蛋白相对分子量曲线的制备：选用四种蛋白：醛缩酶、血清白蛋白、碳酸酐酶及抑蛋白酶肽制成的混合标样。考虑流速等因素对保留时间T的影响而选用了内标法、既在混合标样中加入右旋糖酐蓝和酪氨酸作为内标，进样后可同时测的完全排阻和完全进入填料孔的两种内标的保留时间T0和Tt，用分配系数Kd对相对分子量对数作图，从而保证结果有良好的重现性。,2019/11/20,2019/11/20,样品测定:根据样品的保留时间T求出其分配系数Kd，由Kd从标准蛋白相对分子质量曲线上查出相应的lgMr，计算相对分子质量。,2019/11/20,第九节亲合色谱法,亲合色谱法是利用或模拟生物分子之间的专一性作用，从复杂生物样品中分离和分析特殊物质的一种色谱方法。,亲合色谱的概念可以理解为配位体以共价键形式与不溶性载体连接作为色谱介质，高选择性地吸附分离具有生物活性的物质，它将传统亲合色谱的专一性与HPLC的快速，稳定，检测方便等优点结合起来。,2019/11/20,一、亲合色谱分离机理,亲合色谱是基于样品中各种物质与固定在载体的配基之间的亲合作用的差别而实现分离的。,亲合色谱的过程是待分离物质与配基间的亲合复合物形成及其解离的过程。,2019/11/20,载体,L,X,配基,待分离物质,2019/11/20,通过选择适当的流动相将结合在配基固定相的组分洗脱下来：,a)如果亲合复合物的亲合力不强,b)当配基与被分离组分的亲合力较强,c)非常紧密地结合在固定相配基上的物质洗脱,2019/11/20,配基与待分离物质的亲合作用的强弱可以用亲合复合物的结合常数来表示。这一常数不宜太低，也不宜太高。太低专一性太差，太高则洗脱困难。,R：结合在亲合色谱固定相上的生物分子的活力,K：复合物的离解常数,L：固定化配基的浓度,2019/11/20,二、亲合色谱的固定相,亲合色谱作为液相色谱的一个重要分支，对于生物大分子的分离具有特殊的意义。原则上讲，如果在固相载体上连接一种具有生物特异性的配基，就可以建立一种亲合色谱方法，用于分离与配基相对应的物质。,2019/11/20,1、有机高分子类：多孔的硬质凝胶交联聚苯乙烯，交联聚甲基丙烯酸酯，亲水性高聚性等树脂。,优点,具有均匀的粒度、较大的孔径、良好的刚性，广泛的PH值的适应性,对于生物大分子样品都有较好的相溶性。,填料容易合成,2019/11/20,2、无机基质,多孔硅胶,可控孔径玻璃,2019/11/20,3、高效亲合色谱兼具亲合色谱和高效液相色谱的特点,可以提高效率，还可以改善回收产物纯度和浓度,检测灵敏度得以大幅度提高,具有更高的选择性,配基结合的牢固性也可以延长填料的寿命并提高产物的质量，这对生物工程的分离、纯化工作是非常有利。,2019/11/20,三、亲合色谱影响因素,1、平衡和平衡缓冲溶液,选择平衡缓冲溶液所具有的PH值，离子强度，温度和化学组成都应使配体与蛋白质之间能发生比较强的相互作用。,2019/11/20,2、蛋白质的浓度和温度效应,对亲合力一般或较高的蛋白质，其互补酶的浓度对亲合容量的影响不明显，柱顶端结合的大分子与最初加入的大分子浓度无关。,温度效应在亲合色谱中非常重要，因为亲合填料吸附作用的强度随温度升高而降低。,2019/11/20,2019/11/20,3、特异性洗脱,通常选用对纯化的活性分子有高的亲合力，但其结构与填料上的配体不同的配体来洗脱，这样就保证了吸附和洗脱双重特异性，使非特异性洗脱减少到最小程度。,4、非特异性洗脱,非特异性洗脱主要受缓冲溶液中的PH值，离子强度，温度和介电常数的控制。,2019/11/20,第十节色谱分离方法的选择,一、相对分子量,分子量2000，凝胶色谱柱,分子量1.5,R增加不大)。改变的方法有：1.改变固定相的性质。2.改变流动相的组成。3.降低柱温、,2019/11/20,色谱理论：分离度（色谱分离基本方程式的讨论）,3）分离度R与容量因子（分配比）k的关系k增加，分离度R增加，但当k10，则R的增加不明显。通常k在210之间。改变k的方法有：1.增加柱温(GC)，2.改变流动相性质和组成(LC)，3.改变固定相含量(GC)。,2019/11/20,色谱理论：分离度与柱长度的关系,令Wb(2)=Wb(1)=Wb（相邻两峰的峰底宽近似相等），并引入相对保留值和塔板数可导出下式：由上式，确定了需要的分离度和相对保留值，即可计算所需要的色谱柱长。,2019/11/20,色谱理论：色谱分离基本方程式与分析时间的关系,分析时间通常指最后一个组分出峰的时间。由以下三式：得到可见，分析时间与R，k、H/u等参数有关。R增加1倍，分析时间则是原来的4倍。实际工作中，即要能获得有效的分离，又要在较短时间内完成分析。,2019/11/20,色谱理论：色谱分离中的问题,由于分析物组成复杂，以恒定的色谱条件可能使部分待测物得到好的分离，但同时使其它待测物的分离不令人满意！实际工作中采用程序升温（GC）和梯度淋洗（LC）来解决比较麻烦的分离问题。,2019/11/20,色谱理论：总结1（可测可计算的公式）,容量因子选择因子分离度塔板数,2019/11/20,色谱理论：总结1（具有理论价值的公式）,速率方程（也称范弟姆特方程式）色谱分离基本方程式,H=A+B/u+Cu,2019/11/20,开发液相色谱方法,问题什么样的分离结果是好的?分辨率?,2019/11/20,什么是色谱的分辨率？,分辨率的公式：,2019/11/20,影响分辨率的因素：K，a，N,分辨率的方程k是容量因子，表达了样品与柱填料的作用强弱。a是选择性系数，描述两化合物分离的好坏程度。是化学因素。N是理论塔板数，描述色谱峰的谱带展宽程度。,2019/11/20,色谱柱的柱效N,理论塔板数计算公式：Ws方法Wtan16切线法Wh5.54半峰高W3s93sW4s164sW5s255s,2019/11/20,Inject,Inject,用“切线”法计算柱效,不好的色谱柱的柱效反而比好色谱柱的要高，因为其拖尾部分测不出来,2019/11/20,GoodColumn,BadColumn,Inject,Inject,用“5”法计算柱效,2019/11/20,提高柱效的方法,色谱柱本身减小填料的颗粒度找到最佳的流速(根据不同内径)合适的温度降低溶剂的粘度增加柱长,2019/11/20,其他影响柱效的因素,柱外效应连接管路进样器、检测器进样体积进样量,2019/11/20,容量因子k,改变k值的方法调节流