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动物细胞基因组DNA的制备2010-05-01 15:22:12 来源：易生物 浏览次数：47 网友评论 0 条 真核生物的一切有核细胞（包括培养细胞）都能用来制备基因组DNA。真核生物的DNA是以染色体的形式存在于细胞核内，因此，制备DNA的原则是既要将DNA与蛋白质、脂类和糖类等分离，又要保持DNA分子的完整。提取DNA的一般过程是将分散好的组织细胞在含SDS（十二烷基硫酸钠）和蛋白酶K的溶液中消化分解蛋白质，再用酚和氯仿/异戊醇抽提分离蛋白质，得到的DNA溶液经乙醇沉淀使DNA从溶液中析出。关键词：动物细胞基因组DNA培养细胞SDS十二烷基硫酸钠蛋白酶K实验原理：真核生物的一切有核细胞（包括培养细胞）都能用来制备基因组 DNA。真核生物的DNA是以染色体的形式存在于细胞核内，因此，制备DNA的原则是既要将DNA与蛋白质、脂类和糖类等分离，又要保持DNA分子的完整。提取DNA的一般过程是将分散好的组织细胞在含SDS（十二烷基硫酸钠）和蛋白酶K的溶液中消化分解蛋白质，再用酚和氯仿/异戊醇抽提分离蛋白质，得到的DNA溶液经乙醇沉淀使DNA从溶液中析出。蛋白酶K的重要特性是能在SDS和EDTA（乙二胺四乙酸二钠）存在下保持很高的活性。在提取DNA的反应体系中，SDS可破坏细胞膜、核膜，并使组织蛋白与DNA分离，EDTA则抑制细胞中DNase的活性；蛋白酶K可将蛋白质降解成小肽或氨基酸，使DNA分子完整地分离出来。从核酸样品中去除蛋白质常用等体积平衡酚和氯仿：异戊醇（24：1）组成的混合物。其中氯仿可使蛋白质变性并有助于水相和有机相的分离，异戊醇有助于减少抽提过程中泡沫的形成。平衡酚的pH应在7.8以上，否则DNA会进入有机相。本方法一般可从5107培养的非整倍体细胞（如HeLa细胞）中获得大约200g DNA。DNA的长度可达到100150kb。20ml正常血的DNA产量约为250g。实验试剂：1.PBS溶液：137mM NaCl，2.7mM KCl，10mM Na2HPO4，2mM KH2PO4。配制：用800ml 水溶解8g NaCl，0.2g KCl，3.22g Na2HPO412H2O，0.24g KH2PO4；用HCl将pH调至7.4；定容至1000 ml。高压灭菌或过滤除菌，室温保存。2.STE溶液：0.15 M NaCl，10 mM Tris-HCl （pH 8.0），1mM EDTA（pH 8.0）。高压灭菌。3.20% SDS：900ml水溶解200g电泳级SDS。加热到68C并用磁力搅拌器搅拌助溶。如果需要，加几滴浓HCl调解pH为7.2。用水定容到1000ml。室温保存，无须灭菌。4.蛋白酶K溶液（20mg/ml）：20mg蛋白酶K溶于1ml灭菌ddH2O中，分装-20保存。该储备液在-20可稳定保存一年。5.TE缓冲液：10mM Tris-HCl，pH8.0，1mM EDTA。高压灭菌。6.平衡酚：用0.5M Tris-HCl，pH8.0平衡。pH必须大约为8。7.“酚/氯仿/异戊醇”溶液：25ml平衡酚, 24ml氯仿、1ml异戊醇混合。混合物上覆盖一层100mM Tris-HCl（pH8.0）缓冲液，在不透光的瓶子中4保存1月。8.冷无水乙醇：-20贮存的分析纯无水乙醇。9.10M 乙酸铵（NH4Ac）：70ml水溶解77g乙酸铵，用水定容到100ml。用0.22m滤器过滤除菌。密闭瓶中室温保存。10.70%乙醇：用水稀释无水乙醇配制。11.ACD抗凝剂（用于新鲜血样抽取或冻存血样）：0.48% （m/V）柠檬酸，1.32% （m/V）柠檬酸钠，1.47%（m/V）葡萄糖。实验步骤：1.收获哺乳动物培养细胞A.用胰酶消化收集单层培养细胞或离心收集悬浮培养细胞。B.用PBS溶液重悬细胞，4 2500rpm离心10 min。吸弃PBS溶液。C.用TE缓冲液将细胞重悬至浓度为5107细胞/ml。2.获取鱼血液细胞A.取一10ml注射器，吸入0.5ml ACD抗凝剂（ACD抗凝剂：血液=1:5）。B.尾静脉抽血，血液经ACD抗凝，置4冰箱。C.血液在4静置4h后，血细胞沉积。沉积的血细胞可立即用于DNA制备，或50l分装，-20短期保存或-80长期保存。3.取50l TE细胞悬液或50l沉积的鱼血细胞，加入450 l STE溶液，10l 20% SDS（终浓度0.5）和10 l 20mg/mL蛋白酶K（终浓度400 g/mL），轻轻颠倒混匀，55水浴消化3h或过夜。4.将溶液冷却到室温，加入等体积平衡酚，缓慢颠倒混合10min，12000rpm 离心15min。5.用大口径吸头（出口直径为0.3cm）将粘稠水相转移到新离心管中。6.水相中加入等体积平衡酚，缓慢来回颠倒试管10min，12000rpm离心10min；用大口径吸头将粘稠水相转移到新离心管中。7.水相中加入等体积“酚/氯仿/异戊醇”溶液，缓慢来回颠倒试管10min，12000rpm离心10min；用大口径吸头将粘稠水相转移到新离心管中。8.重复“酚/氯仿/异戊醇”抽提1次。用大口径吸头将粘稠水相转移到新离心管中。9.水相中加入等体积氯仿溶液，缓慢来回颠倒试管10min，12000rpm离心10min；用大口径吸头将粘稠水相转移到新离心管中。10.转移水相转移到新离心管中，加入0.2体积的10M 乙酸铵和2倍体积室温无水乙醇（若使用冰冷乙醇，会让一些残留的RNA也沉淀出来。），水平旋转或轻缓反转离心管，使溶液充分混匀，DNA会形成丝状析出物。11.12000rpm离心10min，沉淀DNA。吸弃上清。12.DNA沉淀中加入500l 70%乙醇，颠倒试管使溶液充分接触试管所有内壁，以洗去残留的盐。13.12000rpm离心10min，沉淀DNA。吸弃上清。14.敞开管口，室温下使乙醇尽可能挥发干净，