PCR-和凝胶电泳.doc

分子生物学技术实验一、实验二基因的PCR扩增、琼脂糖凝胶电泳检测1、实验目的 本实验通过学习用PCR扩增技术来获取特异性的基因DNA，以及扩增DNA的琼脂糖凝胶电泳检测技术，掌握有关的技术原理和实验方法。2、实验原理2.1 特异性基因的PCR扩增：PCR扩增是指直接以待扩增的DNA为模板，加入特异性的一对引物、四种脱氧核糖核苷酸以及Tag DNA聚合酶等，进行DNA的合成反应。2.2 琼脂糖电泳：DNA分子在高于其等电点的溶液中带负电，在电场中向阳极移动。在一定的电场强度下，DNA分子的迁移速度取决于分子本身的大小和构型。DNA分子的迁移速度与其相对分子量成反比。琼脂糖凝胶浓度与线形DNA的最佳分辨范围琼脂糖凝胶浓度线形DNA的最佳分辨范围（bp）0.5%1,00030,0000.7%80012,0001.0%50010,0001.2%4007,0001.5%2003,0003、材料、试剂及器具3.1 材料DNA模板3.2 试剂4XdNTP，Taq 酶 buffer，一对引物，Taq DNA聚合酶，琼脂糖，0.5*TBE。3.3 器具PCR管，移液器，1.5ml Eppendorf管，PCR管架, Eppendorf管架，PCR 仪,电泳仪； 紫外检测仪； 水平电泳槽； 一次性手套。4、操作步骤 4.1特定基因DNA的扩增1) 配模板DNA液H2O 15.3 ldNTP (10 mM ) 0.5 l10Taq Buffer 2 l引物1 (10 M ) 0.5 l引物2 (10 M ) 0.5 lTemplate 1 ulTaq DNA polymerase 0.2 l=Total 20 l2) 加入1 ul的模板DNA。对照组的模板为ddH2O。3) 进行PCR反应。按照下列反应条件进行： 预变性： 95 5 min 变 性： 95 ？s退火反应： （Tm-5） ？s 引物延伸： 72 1 kb/min, 循环数： 30个循环 补平反应： 72 5 min。4.2琼脂糖电泳1.用蒸馏水将制胶模具和梳子冲洗干净，放在制胶平板上，封闭模具边缘，架好梳子；2.根据欲分离DNA片段大小用凝胶缓冲液配制适宜浓度的琼脂糖凝胶：准确称量琼脂糖干粉，加入到配胶用的三角烧瓶内，定量加入电泳缓冲液（一般30ml,60ml,100ml）；3.放入到微波炉内加热熔化。冷却片刻，冷却至60左右，在胶液内加入适量的溴化乙锭终浓度为0.5ug/ml，轻轻摇匀，倒入电泳槽中，待其凝固；4.室温下3045分钟后凝胶完全凝结，小心拔出梳子，将凝胶安放在电泳槽内；5.向电泳槽中倒入电泳缓冲液，其量以没过胶面1mm为宜，如样品孔内有气泡，应设法除去；6.在DNA样品中加入1体积的载样缓冲液（loading buffer），混匀后，用枪将样品混合液缓慢加入被浸没的凝胶加样孔内；7.接通电源，红色为正极，黑色为负极，切记DNA样品由负极往正极泳动 (靠近加样孔的一端为负)。一般120V电压，电泳2040min即可；8.根据指示剂泳动的位置，判断是否终止电泳；9.电泳完毕，关上电源，在凝胶成像仪上观察电泳带及其位置，并与核酸分子量标准Marker比较被扩增产物的大小。5、注意事项1. 特定基因DNA PCR扩增的时候，由于各种成分的含量相对小，因而应先配成母液再分装。2. 试验过程小心谨慎,不允许因为实验操作带来的失败结果。3. 试验仪器的使用,试验过程详细讲解。4. 进入实验室后保持实验室的安静和整洁。5. 写出实验报告（格式：实验题目、实验内容、实验方法、实验结果、讨论与分析）。6. 实验结束后分组按组，搞好实验室卫生。实验三 质粒DNA的分离提取、鉴定一、 实验目的 了解基因工程操作中运载基因的载体，掌握最常用的提取质粒DNA的方法，并且能够进行鉴定。二、 实验原理碱变性抽提质粒DNA是根据质粒DNA与染色体DNA的变性与复性差异而达到分离的目的。利用溶菌酶、强碱（NaOH）及表面活性剂（SDS）使细胞破壁、膜，释放出胞内染色体DNA、质粒DNA及其它物质。通过一系列的纯化过程：高盐除去核DNA，苯酚-氯仿抽提变性蛋白和脂类，然后用乙醇（或异丙醇）沉淀出质粒DNA和RNA等，RNA经RNase消化，得到质粒DNA。这种质粒DNA可用作基因工程的载体，更广泛地用于重组子的鉴定。通过琼脂糖凝胶电泳，可以初步鉴定抽提质粒DNA的含量、质粒DNA的完整性。三、实验材料 大肠杆菌摇菌后的菌液四、实验仪器、器皿及试剂 仪器、器皿（略） 试剂： 1、溶液1：50mmol/l 葡萄糖 10mmol/l EDTA-Na2 25mmol/l Tris-HCl（pH8.0） 4mmol/l 溶菌酶 2、溶液2：200mmol/l NaOH 1% SDS 3、溶液3：5mol/lKAc 60ml 冰乙酸 11.5ml ddH2O 28.5ml 4、苯酚-氯仿 5、异丙醇（或95%乙醇，100%乙醇） 6、70%乙醇 7、TE（pH8.0）：10mmol/l Tris-HCl（pH8.0） 1mM EDTA-Na2 8、RNase 1mg/ml Amp 100g/ml五、实验步骤1挑取一单菌落的E.coli菌种接种到含Amp100g/ml的LB液体培养基中，37震荡培养过夜。2吸1.4ml菌液至Eppendorf管中，在高速台式离心机上4000g离心2min，倒去培养基。3重复1次，尽可能倒出培养基并将Eppendorf管倒置于吸水纸上，以吸干管壁上残留的培养基，收集细菌。4将细菌悬于500l冰冷的溶液1中，于离心机上5000g离心2min。5倒去溶液1，再悬于200l冰冷的溶液1中，重悬菌液。6加入300l新配制的溶液2，冰浴5min。7加入300l冰冷的溶液3，中和，轻轻震荡10sec，置冰浴5min。8于离心机上，8000g离心5min。9取600l上清转移至一新管中。 10加入等体积的饱和酚：氯仿：异戊醇（25：24：1）抽提1次，8000g离心5min取上清液，转移至一新管。11加入1/10体积NaAc溶液（3mol/l），再加入2倍体积的无水乙醇 ，20沉淀20min。1210000g离心10min。13倒去无水乙醇，用1ml 70%乙醇洗涤沉淀，8000g离心5min。14开盖、置室温自然干燥。悬浮至40l去离子水或TE中。15配制浓度为1%的琼脂糖凝胶，电泳。六、注意事项1所用器具必须严格清洗，最后要用重蒸水冲洗3次，凡可以进行灭菌的试剂与器具都要经过高压蒸汽灭菌，防止其他杂质或酶对 DNA的降解，对 Eppendorf管、Tip与非玻璃离心管等只能湿热消毒，这些塑料制品烤干时，温度不能超过80，以免熔化，因此，一般用70烘烤。2细菌培养容器最好用三角烧瓶，其容量至少应为培养液的四倍，从而保证氧气的供应。3在碱裂解提取质粒的方法中，关键步骤之一是加入NaAc的时机，这一步决定了DNA变