蕃茄黄化曲叶病毒和黄瓜绿斑驳花叶病毒单克隆抗体的制备及其检测应用 -硕士论文

浙江大学硕士学位论文 加夕Z 旁 硕士学位论文 番茄黄化曲叶病毒和黄瓜绿斑驳花叶病毒单克隆抗 体的制备及其检测应用 P r o d u c t i o no fM o n c l o n a lA n t i b o d i e sa g a i n s tT o m a t o Y e l l o wL e a fC u r lV i r u sa n dC u c u m b e rG r e e nM o t t l eM o s a i c V i r u sa n dT h e i r A p p l i c a t i o n 提交日期2 Q ! ! 生曼旦 中国杭州 ，l翟1疆，冀矗l薯逼叠_、 l o哆7卜v 0荫“q钆-，：i?fIi ； t 1 h _ IIITT il l I TII IITlll 8 5 19 0 4 单位代码：! Q335 学号：2 Q 墨1 鱼1 3 5 番茄黄化曲叶病毒和黄瓜绿斑驳花叶病毒单克隆抗 体的制备及其检测应用 P r o d u c t i o no fM o n c l o n a lA n t i b o d i e sa g a i n s tT o m a t o Y e l l o wL e a fC u r lV i r u sa n dC u c u m b e rG r e e nM o t t l eM o s a i c V i r u sa n dT h e i r A p p l i c a t i o n 论文评阅人：蔡新忠教授 王晓伟研究员 施曼玲教授 答辩委员会主席：陶小荣教授 答辩委员会成员：洪健研究员 安千里副教授 吴建祥副教授 谢艳副教授 论文答辩日期： 20 11 年3 月7 日 浙江大学硕士学位论文 P r o d u c t i o no fM o n c l o n a lA n t i b o d i e sa g a i n s t T o m a t oY e l l o wL e a fC u r lV i r u sa n dC u c u m b e rG r e e n M o t t l eM o s a i cV i r u sa n dT h e i r A p p l i c a t i o n B y H a i l iS h a n g AD i s s e r t a t i o n S u b m i t t e da sP a r t i a lF u l f i l l m e n to ft h eR e q u i r e m e n t s f o rt h eD e g r e eo fM a s t e rw i t hM a jo ri nP l a n t P a t h o l o g y I n Z h e ji a n gU n i v e r s i t y S u p e r v i s o r ：P r o f e s s o rX u e p i n gZ h o u A s s o c i a t eP r o f e s s o r J i a n g x i a n gW u I n s t i t u t eo fB i o t e c h n o l o g y C o l l e g eo fA g r i c u l t u r ea n dB i o t e c h n o l o g y Z h e ji a n gU n i v e r s i t y H a n g z h o u3 10 0 29C h i n a J a n u a r y2 0 1 1 浙江大学硕士学位论文 浙江大学研究生学位论文独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的 研究成果。除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发 表或撰写过的研究成果，也不包含为获得逝婆盘堂或其他教育机构的学位或 证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文 中作了明确的说明并表示谢意。 学位论文作者签名：嘞趣翮签字日期：2 0 1 1 年3 月7 日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解逝望盘堂有权保留并向国家有关部门或机 构送交本论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。本人授权逝婆盘堂 可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索和传播，可以采用影 印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。 ( 保密的学位论文在解密后适用本授权书) 学位论文作者签名： 妫迸翮 导师签名： 签字日期：2 0 1 1 年3 月7 日签字日期：2 0 1 1 年3 月7 日 浙江大学硕士学位论文 致谢 光阴荏苒，两年半的的研究生求学生活即将结束，站在毕业的门槛上，回首 往昔，奋斗和辛劳成为丝丝的记忆，甜美与欢笑也都尘埃落定。在这即将离别的 时刻，我满怀感激，感谢每一位在这段历程中推动和扶助我前行的师长和亲朋。 首先，我要感谢周雪平导师和吴建祥老师。本论文是在周老师和吴老师的悉 心指导下完成的，从论文的选题、试验设计到论文的撰写，无不凝聚着周老师和 吴老师的心血与智慧。两年多来，导师渊博的专业知识，严谨的治学态度，精益 求精的工作作风，诲人不倦的高尚师德，朴实无华、平易近人的人格魅力对我影 响深远。感谢吴老师在试验方法和科研思路上的教授与鞭策，这些是我的毕业论 文得以顺利完成的重要因素。 其次，我要感谢钱亚娟老师、谢艳老师和黄昌军老师在实验室管理、实验技 术指导以及在生活中给予的诸多帮助和建议。感谢沈庆汤、刘舟、杨秀玲、黄凌 哲、张馨月等师兄师姐们在科研过程中提供的宝贵建议及生活中提供的帮助。同 时感谢张彤、张洁、孔令芳、徐毅、李芳芳、顾周杭、董静云、刘欢、倪越群等 实验室兄弟姐妹们在生活和学习上给予的帮助。病毒实验室这个大家庭团结友 爱，志向高远，我能成为其中一员感到非常的荣幸，在这里度过的两年半美好时 光将是我人生最宝贵的财富。希望未来的日子里大家都能幸福安康! 最后，感谢我的父亲、母亲和哥哥，他们无私的关心和帮助使我顺利完成学 业，他们的支持永远是我前进的动力。 在这新芽吐绿，春暖花开的季节挥手告别朝夕相处了两年半的师长和同学， 我将迈出更加坚定自信的脚步去创造美好的未来。 I I 尚海丽 2 0 1 1 年于浙大华家池畔 浙江大学硕士学位论文 摘要 以抗体为核心建立的血清学方法用于植物病毒的检测具有操作方便、快捷， 灵敏以及高通量等优点，但国内制备的植物病毒抗体并不多，大多数重要植物病 毒的检测得依赖进口的抗体或者试剂盒。因此，制备重要植物病毒的特异性抗体、 建立相应的血清学检测方法对植物病毒的检测及口岸检验检疫和防治具有重要 意义。番茄黄化曲叶病毒( T o m a t oy e l l o wl e a fc u r lv i r u s ，T Y L C V ) 是严重危害 番茄生产的双生病毒之一，而黄瓜绿斑驳花叶病毒( C u c u m b e rg r e e nm o t t l em o s a i c v i r u s ，C G M M V ) 是我国近年来葫芦科作物上发生的又一重要的检疫性病毒。本 论文分别制备了抗T Y L c V 和C G M M V 的特异性单克隆抗体( M o n o c l o n a l a n t i b o d i e s ，M A b s ) ，并建立了相应的的血清学检测方法。 ( 1 ) 抗T Y L C V 单克隆抗体制备及其检测应用：用P C R 方法从感染T Y L C V 上海分离物( T Y L C V - S H 2 ) 的番茄基因组中克隆了该病毒的外壳蛋白( C o a t p r o t e i n ，C P ) 基因，将其插入到原核表达载体p E T - 3 2 a 中构建成重组原核表达载 体。重组表达载体p E T - 3 2 a - C P 转化大肠杆菌B L 2 1 ( D E 3 ) ，经I P T G 诱导，N i + N T A 亲和柱纯化获得分子量约为4 8k D a 的融合蛋白。以纯化的重组蛋白为抗原免疫 B A L B c 小鼠，获得3 株能稳定传代并分泌抗T Y L c V 的单克隆抗体杂交瘤细胞。 单克隆抗体的特异性检测表明3 株单抗中3 E 1 0 能与4 种侵染番茄的双生病毒反 应，而另外2 株( 2 8 2 和2 E 3 ) 能特异性识别T Y L C V o S H 2 。利用单抗3 E 1 0 建 立了三抗夹心E L I S A 检测T Y L C V 的方法，该方法检测病叶的灵敏度可达1 ：25 6 0 ( w v ，g m L ) ，对田间样品的检测表明，T Y L C V 在田间番茄植物上发病普遍。 ( 2 ) 抗C G M M V 单抗制备及其检测应用：用提纯的C G M M V 病毒粒子免 疫的B A L B c 鼠脾细胞与S P 2 0 鼠骨髓瘤细胞融合，经细胞筛选与克隆，获得6 株 能稳定传代并分泌抗C G M M V 单克隆抗体的杂交瘤细胞，并分别制备其单抗腹 水。其中单抗5 D l l 可以与C G M M V 、烟草花叶病毒( T M V ) 和番茄花叶病毒 ( T o M V ) 3 种烟草花叶病毒属的病毒反应，单抗8 E 3 和l l B l 2 除与C G M M V 有强阳性反应外，与T M V 和T o M V 存在较弱的反应，而单抗4 H 1 、5 8 1 0 和1 1 A 4 仅与C G M M V 有特异性反应。利用最灵敏的4 H 1 单抗为核心建立了检测C G M M V 的抗原包被间接E L I S A 方法( A n t i g e n c o a t e dp l a t ee n z y m e 1 i n k e di m m u n o s o r b e n t a s s a y ，A C P E L I S A ) 、免疫斑点法( D o t b l o tE L I S A ) 、组织印迹法( T i s s u e b l o t I I I 浙江大学硕士学位论文 E L I S A ) 和免疫捕获R T - P C R ( I m m u n o c a p t u r er e v e r s et r a n s c r i p t a s ep o l y m e r a s ec h a i n r e a c t i o n ，I C R T - P C R ) 。建立的A C P E L I S A 和D o t b l o tE L I S A 方法检测感染 C G M M V 的黄瓜植株组织的灵敏度分别高达1 ：4 09 6 0 和l ：2 04 8 0 ( w v ，g m L ) 。 T i s s u e b l o tE L I S A 操作简便，尤其适合大规模的田问样品检测和诊断。I C R T - P C R 具有最高的检测灵敏度和特异性，对提纯的病毒检出量达到了O 1P g ，对感病植 物组织的检测灵敏度为1 ：1 0 24 0 0 ( w V ，g m L ) 。 关键词：番茄黄化曲叶病毒；黄瓜绿斑驳花叶病毒；原核表达；抗体；单克隆抗 体；T A S E L I S A ；A C P E L I S A ；D o t b l o tE L I S A ；T i s s u e b l o tE L I S A ；I C R T - P C R ； I V 浙江大学硕士学位论文 A b s t r a c t T h e a n t i b o d y - b a s e ds e r o l o g i c a lm e t h o dh a dm u c hs u c c e s si np l a n tv i r u s d e t e c t i o n ，b e c a u s ei ti s s e n s i t i v e ，s p e c i f i c ，r a p i d a n ds i m p l et o c o n d u c t ，C a nb e c o n d u c t e do nal a r g e - s c a l e A n t i b o d i e so faf e wp l a n tv i r u s e sh a db e e np r o d u c e di n C h i n a , b u td e t e c t i o no fm o s tp l a n tv i r u s e sw a sr e l i e do ni m p o r t e dc o m m e r c i a l a n t i b o d i e so rE L I S A k i t s T h u s ，i ti sn e c e s s a r yt op r o d u c ea n t i b o d i e sa g a i n s ti m p o r t a n t p l a n tv i r u s e s ，a n dd e v e l o pe f f e c t i v es e r o l o g i c a lm e t h o d sf o rv i r u sd e t e c t i o n ， q u a r a n t i n ea n dp r e v e n t i o n T o m a t oy e l l o wl e a fc u r lv i r u s ( T Y L C V ) i sas p e c i e so ft h e f a m i l yG e m i n i v i r i d a e ，c a u s i n gs e r i o u sy i e l dl o s s e si nt o m a t op r o d u c t i o n ，a n d c u c u m b e rg r e e nm o t t l em o s a i cv i r u s ( C G M M V ) i sas e r i o u sa l i e ni n v a s i v ep a t h o g e n o fc u c u r b i tc r o p s I nt h i ss t u d y , m o n o e l o n a la n t i b o d i e s ( M A b s ) a g a i n s tT Y L C Va n d C G M M Vw e r ep r o d u c t e d ，a n ds e v e r a ls e r o l o g i c a lm e t h o d sw e r es e tu pf o r r a p i d ， r e l i a b l ea n ds e n s i t i v ed e t e c t i o n ( 1 ) M A b sa g a i n s tT Y L C Va n dt h e i ra p p l i c a t i o n ：T h ec o a tp r o t e i n ( C P ) g e n eo f T Y L C Vi s o l a t eS H 2 ( T Y L C V - S H 2 ) W a sa m p l i f i e d b yP C Ra n di n s e r t e d i n t oa p r o k a r y o t i ce x p r e s s i o nv e c t o rp E T - 3 2 at op r o d u c ep E T - 3 2 a - C P , w h i c hw a su s e dt o t r a n s f o r mE s c h e r i c h i ac o l iB L 2 1 ( D E 3 ) A f t e ri n d u c e db yI P T G , a na b o u t4 8k D a f u s i o np r o t e i nW a so b t a i n e da n dp u r i f i e dt h r o u g hN i + - N T Aa f f i n i t yc o l u m n T h e p u r i f i e dr e c o m b i n a n tC PW a su s e dt oi m m u n i z eB A L B cm i c ef o rp r o d u c i n gM A b s T h r e eh y b r i d o m ac e l ll i n e ss e c r e t i n gM A b sa g a n i n tT Y L C Vw e r eo b t a i n e d T h e r e s u l t so fT A S E L I S Ad e t e c t i o ns h o w e dt h a tt h eM A b3 El0c o u l dr e a c tw i t hf o u r b e g o m o v i r u s e si n f e c t i n gt o m a t o ，w h i l et h eo t h e r sM A b s ( 2 8 2a n d2 E 3 ) m a i n l y r e a c t e dw i t hT Y L C V AT A S - E L I S Am e t h o db a s e do nM A b 3 El0W a ss e tu pf o r T Y L C Vd e t e c t i o n ，a n dt h i sm e t h o dc o u l ds u c c e s s f u l l yd e t e c tv i r u si np l a n ts a pa t1 ：2 5 6 0 妯| 、，g m L ) T h er e s u l t e so fT A S - E L I S Ad e t e c t i o no ff i e l ds a m p l e ss h o w e d b e g o m o v i r u s e sw e r ec o m m o n i nt o m a t op l a n t s ( 2 ) M A b sa g a i n s tC G M M Va n dt h e i ra p p l i c a t i o n ：A f t e rs e l e c t e da n dc l o n e d ，s i x h y b r i d o m ac e l l l i n e ss e c r e t i n gM A b sa g a i n s tC G M M Vw e r ep r o d u c e db yf u s i n g V 浙江大学硕士学位论文 m o u s em y e l o m ac e l l s ( S P 2 0 ) 谢n 1s p l e e nc e l l sf r o mB A L B ci m m u n i z e db yp u r i f i e d C G M M V p a r t i c l e s M A b5 DI Ic o u l dr e a c ts t r o n g l yw i t hC G M M V , T M Va n dO R S V , n o t 、) l ，i t hT O M VM A b s8 E 3a n dllB 12c o u l dr e a c ts t r o n g l y 诵t l lC G M M Va n d w e a k l yw i t hT M V a n dT O M Vw h i l eM A b s4 H1 ，5 B10a n dllA 4c o u l dr e a c ts t r o n g l y o n l yw i t hC G M M V , b u t n o tw i t ht h eo t h e rt h r e et o b a m o v i r u s e s B a s e do nt h em o s t s e n s i t i v eM A b4 H1 ，t h ei n d i r e c ta n t i g e n c o a t e dp l a t e ( A C P ) 一E L I S A ，D o t b l o tE L I S A ， T i s s u e b l o tE L I S Aa n di m m u n o c a p t u r er e v e r s et r a n s c r i p t a s e p o l y m e r a s e c h a i n r e a c t i o n ( i c - R T - P C R ) f o rC G M M Vd e t e c t i o nw e r es e tu p B o t hA C P E L I S Aa n d D o t b l o tE L I S Ac o u l ds p e c i f i c a l l yd e t e c tC G M M Vi ni n f e c t e dc u c u m b e rl e a ft i s s u e e x t r a c t sd i l u t e d1 ：4 09 6 0a n dl ：2 04 8 0 ( w v , g m E ) ，s e p a r a t e l y T i s s u e - b l o tE L I S Ai s m o r ep r a c t i c a lf o rr o u t i n ed e t e c t i o no fl a r g e - s c a l es a m p l e si nt h ef i e l ds u r v e y T h e I C R T - P C Rw a st h em o s ts e n s i t i v em e t h o d ，w h i c hc o u l dd e t e c ta sl i t t l ea sO 1p go f p u r i f i e dv i r u sa n dc o u l ds u c c e s s f u l l yd e t e c t v i r u si np l a n ts a pa t1 ：10 24 0 0 ( w v , i g m L ) ： K e y w o r d s ：T o m a t oy e l l o wl e a fc u r lv i r u s ；C u c u m b e rg r e e nm o t t l em o s a i cv i r u s ； a n t i b o d y ；m o n o c l o n a la n t i b o d y ；T A S E L I S A ；A C P - E L I S A ；D o t - b l o tE L I S A ； T i s s u e - b l o tE L I S A ；I C K r - P C R ； V I 浙江大学硕士学位论文 目录 致谢I I 摘要I I I A b s t r a c t V 目录。V I I 第一章文献综述1 l 番茄黄化曲叶病毒研究进展l 1 1 寄主范围、症状和分布1 1 2 分子生物学特性3 1 2 1 病毒的基因组结构、功能和表达策略3 1 2 2 病毒株系分化：4 1 3T Y L C V 检测技术5 1 3 1 生物学检测法6 1 3 2 血清学方法6 1 3 3 分子生物学方法6 1 3 4 不同检测方法的比较7 1 4 防治策略8 2 黄瓜绿斑驳花叶病毒研究进展9 2 1 生物学特性9 2 1 1 病毒分布9 2 1 2 危害症状1 0 2 1 3 寄主与传播方式1 1 2 1 4 病毒粒子与理化特性1 1 2 2 基因组结构及功能1 2 2 3 病毒株系组成与血清学关系1 3 2 4C G M M V 检测技术的发展13 2 4 1 生物学鉴定1 3 2 4 2 电镜观测1 4 2 4 3 血清学检测1 4 3 单克隆抗体技术及其在植物病毒学中的应用1 5 V I I 浙江大学硕士学位论文 3 1 抗体的基本结构及其特性1 6 3 2 单克隆抗体技术l7 3 2 1 杂交瘤技术基本原理1 7 3 2 2 杂交瘤技术基本流程1 9 3 3 单克隆抗体在植物病毒学中的应用1 9 3 3 1 病毒病害的诊断与检测2 0 3 3 2 病毒株系鉴定及分离物分型2 0 3 3 3 病毒蛋白抗原表位分析一2 1 3 3 4 作为探针分析病毒基因产物的功能2 1 3 3 5 其他方面应用2 2 第二章番茄黄化曲叶病毒外壳蛋白的原核表达及其单克隆抗体制备和应用2 3 1 材料与方法。2 4 1 1 病毒j 2 4 1 2 菌株和质粒。2 4 1 3 式剂2 4 1 4T Y L c V C P 基因克隆及其原核表达载体的构建2 4 1 5T Y L C VC P 基因在大肠杆菌中的表达及蛋白纯化3 0 1 5 1 诱导表达3 0 1 5 2 表达产物在变性条件下的纯化3 0 1 5 3 重组蛋白的S D S P A G E 及W e s t e r nb l o t 鉴定3 0 1 6 多克隆抗体和单克隆抗体的制备3 3 1 6 1 多抗血清的制备3 3 1 6 2 单克隆抗体制备3 4 1 7 用制备的抗体建立测定T Y L C V 的酶联免疫吸附测定法( E L I S A ) 3 6 2 结果与分析一3 8 2 1T Y L C V - S H 2 外壳蛋白基因的克隆和原核表达载体的构建3 8 2 2T Y L C V - S H 2 外壳蛋白的原核表达与纯化3 9 2 3 重组蛋白单克隆抗体的制备和鉴定4 0 2 4 抗T Y L C V - S H 2C P 单克隆抗体的特性4 1 2 5T A S E L I S A 和W e s t e r nb l o t 检测抗体特异性4 2 2 6T A S E L I S A 检测方法的建立4 3 2 7T A S E L I S A 田间检测应用4 3 V I I I 浙江大学硕士学位论文 3 讨论4 4 第三章黄瓜绿斑驳花叶病毒单克隆抗体的制备4 6 l 材料和方法_ 4 6 1 1 病毒、培养基和抗体4 6 1 2 黄瓜绿斑驳花叶病毒的提纯4 7 1 - 3 单克隆抗体的制备4 7 1 4 腹水制备、抗体纯化、抗体类型及亚类鉴定和腹水效价测定4 8 1 5W e s t e r nb l o t 检测4 8 1 6C G M M V 的A C P E L I S A 检测方法4 8 1 7D o t - b l o tE L I S A 和T i s s u e b l o tE L I S A 的建立及检测应用4 8 1 8I C R T - P C R 的建立及应用4 9 2 结果与分析5 0 2 1 黄瓜绿斑驳花叶病毒的提纯及抗原制备5 0 2 2 杂交瘤细胞的融合、筛选和克隆5 0 2 3 腹水抗体制备、效价测定及抗体亚类鉴定5 0 2 4W e s t e mb l o t 分析51 2 5 单抗的特异性和灵敏度5 2 2 6 A C P E L I S A 检测方法建立和应用5 3 2 7D o t b l o tE L I S A 和T i s s u e b l o tE L I S A 的建立及检测应用5 4 2 8I C R T - P C R 的建立及应用5 5 3 讨论5 6 参考文献5 8 附录A 常用生化及分子生物学试剂与仪器6 7 附录B 常用缓冲液及培养基配方6 8 在学期间所取得的科研成果7 1 I X 浙江大学硕士学位论文 第一章文献综述 1 番茄黄化曲叶病毒研究进展 番茄( S o l a n u ml y c o p e r s i c u mL ) 是全球重要的蔬菜作物，它品种多，适应 性广，营养丰富，是全世界总产量最高的3 0 种农作物之一( 余诞年等，1 9 9 9 ) 。 双生病毒对番茄的危害一直都是番茄生产的重要制约因素之一，尤其是近几十年 来双生病毒病在全球范围的扩展蔓延导致其在番茄上的危害日趋严重( C z o s n e k a n dL a t e r r o t ，1 9 9 7 ) 。在所有侵染番茄的双生病毒中，番茄黄化曲叶病毒( T o m a t o y e l l o w l e a fc u r lv i r u s ，T Y L C V ) 危害最为严重。该病毒隶属于双生病毒科 ( G e m i n i v i r i d a e ) 菜豆金色花叶病毒属( B e g o m o v i r u s ) ，是一类粉虱传播的具有 孪生颗粒形态的单链环状D N A 植物病毒( P i c oe t a l ，1 9 9 6 ；M o r i l l a e t a l ，2 0 0 5 ) 。 自1 9 6 4 年番茄黄化曲叶病毒( T Y L C V ) 被正式命名以来( C o h e ne ta 1 ，1 9 6 0 ) ， 该病毒病已经在中东、东南亚、东亚及非洲等众多国家及地区和我国的浙江、重 庆、广东等地相继发生，造成番茄生产上的严重损失。随着全球气候的变化、农 业耕作制度的改变、国际间贸易活动的迅速加强和烟粉虱介体在世界各地空前扩 展，番茄黄化曲叶病毒病有进一步蔓延的趋势，已经成为影响全世界番茄生产的 主要限制因素之一。 1 1 寄主范围、症状和分布 番茄黄化曲叶病毒主要通过B 型烟粉虱传播，烟粉虱获毒后可终生传毒， 但不经卵传，研究表明嫁接也可导致病毒的传播，但不能经机械摩擦或种子传毒 ( B r u n te ta 1 ，1 9 9 6 ) 。目前据报道该病毒可以侵染茄科、豆科以及杂草等2 0 多 种植物，其中易感病的寄主植物有：戟叶鹅绒藤( C y n a n c h u ma c u t u m ) 、曼陀罗 ( D a t u r as t r a m o n i u m ) 、兵豆( L e n sc u l i n a r i s ) 、醋栗番茄( L y c o p e r s i c o n p i m p i n e l l i f o l i u m ) 、本氏烟( N i c o t i a n ab e n t h a m i a n a ) 、心叶烟( N i c o t i a n ag l u t i n o s a ) 、 烟草( N i c o t i a n at a b a c u m ) 、菜豆( P h a s e o l u sv u l g a r i s ) 、苦苣菜( S o n c h u so l e r a c e u s ) 等( B r u n t e t a l ，1 9 9 6 ) 。 感染T Y L C V 的植株发病症状与病毒分离物、寄主的遗传背景、生长阶段以 浙江大学硕上学位论文 及环境条件有关，症状的表现会有所差异。发病植株的典型症状为顶部叶片变小， 皱缩卷曲黄化，节间缩短，植株明显矮化，开花延迟，花朵减少，坐果少而小， 成熟期果实不能正常转色，且成熟不均匀( 图1 1 ) 。该病在番茄生长各阶段均可 发生。若在开花前感病，果实产量和商品价值均大幅度下降，严重时造成的损失 可达1 0 0 ( 杨金明等，2 0 0 9 ) 。 A C 1 t n q , I R 圈1 1T c V 基因组结构和番茄黄化曲叶病毒病症状( 引自H a n l e y - B o w d o i ne ta 1 ，2 0 0 0 ) A ：1 Y L C V 基因组结构；B ：感染T Y L C V 番茄症状；C ：感染T Y L C V 的番茄幼苗 F i g1 1G e n o m i co r g a n i z a t i o no fT Y L C Va n ds y m p t o m so fT Y L C V - i n f e c t e dt o m a t o ( D e r i v e d f r o mH a n l e y - B o w d o i ne ta 1 ，2 0 0 0 ) A ：g e n o m i co r g a n i z a t i o no ft h eT Y L C V ；B ：s y m p t o m so fT Y L C V 二i I l f t e dt o m a t o ；C ：s y m p t o m s o fy o u n gt o m a t op l a n ti n f e c t i o nb yT Y L C V T Y L C V 最早于1 9 6 4 年在以色列被发现，之后的3 0 年间该病害迅速扩散到 中东、地中海沿岸、东南亚地区、美国、日本、澳大利亚、印度、墨西哥等众多 国家和地区( P o l s t o ne ta 1 ，1 9 9 9 ；A c c o t t oe ta 1 ，2 0 0 0 ；M o n c ie ta 1 ，2 0 0 0 ；M o r i o n e s a n dN a v a s C a s t i l l o ，2 0 0 0 ；P o l s t o ne ta 1 ，2 0 0 2 ；U e d ae ta 1 ，2 0 0 5 ) 。2 0 世纪9 0 年 代中期，随着双生病毒的传毒介体一B 型烟粉虱入侵我国，导致烟粉虱传番茄 双生病毒在我国由东向西、由南向北急速蔓延，严重威胁我国产值近千亿元的番 茄产业。2 0 0 5 年秋，T Y L c V 首次在广西番茄主产区百色市田阳镇大面积爆发， 2 浙江大学硕士学位论文 2 0 0 6 年在上海、江苏和浙江等地相继被发现，之后迅速扩展至安徽、山东、河 南、河北、广东、重庆、云南、福建、辽宁和北京等地( 蔡健和等，2 0 0 6 ；王冬 生等，2 0 0 7 ；赵统敏等，2 0 0 7 ) 目前全国已有1 5 个省( 自治区、直辖市) 发 现该病毒的危害现象，已造成严重损失的地区有浙江、江苏、安徽、山东、河南 和河北等省。 1 2 分子生物学特性 1 2 1 病毒的基因组结构、功能和表达策略 T Y L C V 具有典型的双生病毒孪生颗粒形态，病毒粒子的大小约为2 0 x 3 0n n l 。双 生病毒根据基因组结构可分为双组份( b i p a r t i t e ，含D N A A 和D N A B ) 病毒和 单组份( m o n o p a r t i t e ，只含有D N A A ) 。菜豆金色花叶病毒属的大多数成员为双 组份病毒，包含两条长度、大小相似的单链闭环状s s D N A 分子，约2 5 2 8k b 。 T Y L C V 基因组结构组成因不同分离物而有所差异。如来自以色列、撒丁岛、西 西里岛、埃及和西班牙等地的T Y L C V 分离物都只含有2 7 2 8k b 的单组份 D N A A ( N a v o te ta 1 ，1 9 9 1 ；N a k h l ae ta 1 ，1 9 9 2 ；N o f i se ta 1 ，1 9 9 4 ；C r e s p ie ta 1 ， 1 9 9 5 ) ，而来自泰国的分离物则含有约2 8k b 的双组份D N A 分子( R o c h e s t e re ta 1 ， 1 9 9 0 ，1 9 9 4 ) 。 病毒基因组以单链的形式包裹在孪生粒体内，在植物体内时病毒s s D N A 具 有侵染性，因而s s D N A 亦称病毒链或正义链( + ) ，s s D N A 进入植物后形成复制 中间体时合成的第二条链称为互补链或反义链( ) 。单组份或是双组份的T Y L C V 都能在正义链和反义链上编码开放式阅读框( O p e nr e a d i n gf r a m e ，O R F ) ，这些 O R F 被大约2 0 0b p 的基因间隔区( I n t e r g e n i er e g i o n ，I R ) 所分开。I R 区中含有 病毒复制和转录所必须的结构域及茎环结构顶端保守的9 核苷酸序列 ( T A A T A T T A C ) ( H a n l e y B o w d o i ne ta 1 ，2 0 0 0 ) 。单组份的T Y L C VD N A A 含有 6 个O R F s ：在病毒链上编码A V l 和A V 2 ；在互补链上编码A C l 、A C 2 、A C 3 和 A C 4 ( 图1 1 A ) 。A V l 编码病毒的外壳蛋白( c o a tp r o t e i n ，C P ) ，与病毒粒子的 包装、介体传毒、系统侵染及与寄主的互作相关( H a r r i s o ne ta 1 ，2 0 0 2 ) 。A V 2 编 码C P 前体蛋白，与病毒的运动相关( P a d i d a me t a l ，1 9 9 6 ) 。互补链A C l 编码复 制相关蛋白( R e p l i c a t i o n a s s o c i a t e d p r o t e i n ，R e p ) ，参与病毒链D N A 的复制起始 浙江大学硕士学位论文 ( L a u f se ta 1 ，1 9 9 5 ) 。A C 2 编码的转录激活蛋白( T r a n s c r i p t i o n a la c t i v a t o rp r o t e i n ， T r A P ) 调节病毒链上各个基因的转录( S u n t e ra n dB i s a r o ，1 9 9 1 ，1 9 9 2 ) 。A C 3 编码 复制增强蛋白( R e p l i c a t i o ne n h a n c ep r o t e i