桃过敏原基因定位及其在桃不同组织的表达-硕士论文

G e n o m i cC h a r a c t e r i z a t i o no fP u t a t i v eA l l e r g e nG e n e si n P e a c ha n dT h e i rE x p r e s s i o ni nD i f f e r e n tT i s s u e s 论文作者签名： 盎丛一一一 指导教师签名：趣羔坚 评阅人2 ： 评阅人3 ： 评阅人4 ： 评阅人5 ： 答辩委员会主席： 委员1 ： 委员2 ： 委员3 ： 委员4 ： 委员5 ： 答辩日期：2 Q ! Q 生鱼目坌旦 一 I I G e n o m i cc h a r a c t e r i z a t i o no fp u t a t i v ea l l e r g e ng enesno p u t a t i v ea l l e r 2 e ne u e si n 0 I p e a c ha n dt h e i re X P r e s s l o ni nd i f i e r e n tt i s s u e s l- A u t h o r Ss i g n a t u r e ：C H E NL i n S u p e r v i s o r Ss i g n a t u r e ：! j 丛Q 圣h Q 旦g 墨鱼i 盟! 壁丛建迪墨Q 坠g T h e s i sr e v i e w e r1 ：D o u b l e b l i n d T h e s i sr e v i e w e r2 ： T h e s i sr e v i e w e r3 ： T h e s i sr e v i e w e r4 T h e s i sr e v i e w e r5 ： C h a i r ： 圣至型丛坐堂弛鱼! ! Q L 墨鲢i i 垫g 堕娶i Y 曼堡血 ( C o m m i t t e eo fo r a ld e f e n c e ) C o m m i t t e e m a n1 ： 丛丛QS 鱼i P i 坠Q 鱼Q L 墨h 塑g h 堑丑垒Q 鱼壁g 型n i Y 曼竖i 垃 C o m m i t t e e m a n2 ： Q ! X i n g i i 自丑g ，艘鱼Q L 圣照自i 垒堕g 曼垒垒皇塑YQ g d 曼坠! 塑2 鳗曼坌i 曼娶垒曼 C o m m i t t e e m a n3 ： C o m m i t t e e m a n4 ： Q Q 圣垒业g ! 丛盟：旦翌鱼姓圣鲢垫g 堕坠i 曼堡i 盟 C o m m i t t e e m a n5 ： H l 丛K ! 地墨Q 坠舀! Q 鱼Q L 圣b 曼i i 型毽堕卫i 皇堡i 盟 D a t eo fo r a ld e f e n c e ：J u n e9 m2 010 H 1 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的 研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其 他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得逝姿态鲎或其他教育机 构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献 均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。 学位论文作者签名： 砾彩卜 签字日期：工口f D 年6 月 7 日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解逝姿盘堂有关保留、使用学位论文的规定， 有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和 借阅。本人授权逝姿盘堂可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库 进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。 ( 保密的学位论文在解密后适用本授权书) 学位论文作者签名： 硌l 啉 导师签名： 签字日期：) o f 9 年 6 月罗日 签字日期： 学位论文作者毕业后去向： 工作单位： 通讯地址： 电话： 邮编： 名。 融冲u 7 日 致谢 五年的校园生活转瞬即过，我的求学生涯也要划上一个句号了，在美丽的浙 大华家池校区有太多美好的回忆，有太多想感谢的人和感谢的事，最想感谢的人 是我的导师高中山教授和陈昆松教授。本研究从实验设计到论文写作都是在导师 高中山教授和陈昆松教授的悉心指导下完成的。两位导师渊博的学识、严谨的治 学态度和忘我的敬业精神和活跃的思维都给了我极大的鼓舞和鞭策。五年来，导 师高中山教授和陈昆松教授不但在课题研究上倾注了大量心血，而且在个人成长 过程中给予了极大关心、支持和鼓励，从两位导师中学到的不仅仅包括前沿的学 术思想和实验技能，还学到了做人的道理，他们是我学习的楷模。在此谨向两位 导师致以最崇高的敬意和最衷心的感谢! 感谢实验室的徐昌杰教授，李鲜副教授，张波讲师，孙崇德副教授，朱长青 老师，感谢果树所滕元文，陈力耕，郭延平，刘永立，贾惠娟，柴明良老师的指 导和帮助，感谢这些老师的谆谆教诲和无私帮助! 这项研究得到了国家教育部重点科研项目( 1 0 7 0 6 4 ) 、国家自然科学基金 ( 3 0 7 7 1 4 9 6 ) 、浙江省科技术厅项目( 2 0 0 7 C 2 2 0 6 8 ) 1 的支持。 感谢西班牙I R T A 合作者H o w a d 等提供桃和扁桃的D N A 样品，感谢宁波市 溪口奉化水蜜桃研究所提供湖景蜜露和玉露桃样品 特别要感谢实验室的张水明宋丽娟在桃过敏原基因克隆与图谱定位的帮 助，感谢实验室的傅秀敏、王伟伟在桃过敏原基因r e a l t i m eP C R 上的帮助，感 谢实验室的殷学仁、杨朝崴在博士论文修改及实验上的帮助，感谢实验室的张岚 岚、杨绍兰、单兰兰、张望舒、蔡冲、王霄霄、陈妙金、王平、金微微，牛姗姗、 席万鹏、谢让金、张绍阳、张志新、陈明、梁莉、苏明申、刘小花、李雄伟、周 京一，宋肖琴、陈秋燕、李世钰、周剑、申济源、蒋天梅、魏雯雯、张九凯、冯 超、马英桃、徐倩、阂婷、郑小艳、俞波、蔡丹英、黄春辉、卢彩玉、金蓉、高 月，谭金娟、李紫芳、刘露露、何风杰等同学和来这访学的童红梅、何桥在实验 上和生活上对我的帮助。 感谢我的宿舍室友曾凡荣、姚利华、李静。 特别要感谢我的父母、妹妹对我经济上、生活上的支持。在我求学的过程中， 你们含辛茹苦，十几年如一日默默地支持我、鼓励我。没有你们的支持我很难继 续我的求学之路，也没有坚持下去的勇气。你们用最伟大的爱关心我、支持我， 永远是我最坚强的精神支柱 谨以此文奉献给所有关心和帮助过我的人们! 陈琳 2 0 1 0 年6 月于浙大华家池 U 摘要 桃过敏主要由病程相关蛋白1 0 ( P R - 1 0 ) 、类甜蛋白( T L P ) 、脂质转移蛋白( L T P ) 和抑制蛋白( P E N ) 这四类过敏蛋白引起，它们的分别命名为n 材PJ 丹“PJ 0 2 P r uP3 和n “P4 ，在扁桃中命名为办材d u1 - 4 。本研究旨在阐明桃扁桃过敏原 基因家族成员的基因组序列特征，明确它们在国际参照连锁图谱上的定位，并分 析其与苹果过敏原基因在序列和图谱位置方面的同源性。同时，应用r e a l t i m e P C R 的方法研究桃四类过敏原基因家族1 8 个成员在桃果皮、果肉、花药和叶片 等不同组织中的表达主要结果如下： 1 本研究克隆得到四类1 8 个桃过敏原基因，分别定位于5 个连锁群上8 个尸r “PJ ( 丹“p J D J J 酊和3 个P ，“PJ 0 6 同工型基因，i s o a l l e r g e ng e n e s ) 基 因都定位在第1 连锁群( G 1 ) 的顶部，其中4 个为新发现。5 个丹P2 基因同 工型成员定位在不同的连锁群上，其中P r u P2 0 1 A 和尸厂“P2 0 1 B 基因定位在第 3 连锁群，m P2 0 2 定位在第7 连锁群，胁P2 0 3 定位在第8 连锁群上，n “P 2 舛基因定位在第l 连锁群上。脚材P2 基因在外显子和内含子上都存在差异， 推导的氨基酸组成都不同。3 个抑扰P3 同工型基因都定位在第6 连锁群上。3 个 P r u P3 基因都含有一个内含子和最小长度为1 0n t 的外显子丹材P4 0 1 和丹“P 4 分别定位在第1 连锁群和第7 连锁群。通过对比桃和苹果的过敏原基因组序 列和它们的图谱定位，结合桃和苹果连锁群的比较基因组同一性研究成果，表明 桃第一连锁群G 1 与苹果的L G1 6 和L G8 ( L G 表示苹果属连锁群) 、G 3 和L G 9 、 G 6 和L G1 2 、G 7 和L G 2 具有同源基因位点分布的同一性关系( s y n t e n y ) 2 应用r e a l t i m eP C R 技术，研究基因组克隆获得候选桃过敏原基因在果皮、 果肉、花药和叶片四种不同组织问的表达水平结果表明，这些基因成员表达各 异其中P r u PJ 0 1 、丹“P ，0 6 B 、P r u P3 0 1 、P r u P4 0 1 以及尸，z ，P4 0 2 五个成 员为主要表达过敏原基因成员。多数过敏原基因在果皮的表达比果肉高。另外， 发现部分基因成员存在组织特异性表达，其中，尸，甜P3 0 1 为桃果实中表达最丰 富的成员，且只发现于果皮中，进一步解释了桃果皮的高致敏性。mPJ 0 2 和 P r uP3 0 2 只在叶片中表达，而n 甜P3 0 3 只在花药中表达这些结果可以为进 I I I 一步开展鉴别致敏的关键基因和特异位点提供线索，并为选育低致敏性桃品种提 供理论和实践依据。 关键词：桃；过敏原基因；图谱定位；病程相关蛋白；类甜蛋白；脂质转移蛋白； 抑制蛋白；实时定量P C R ；基因表达； I V A b s t r a c t T h ei d e n t i f i e d p e a c ha l l e r g e n sb e l o n g t o m a i n l y f o u r p r o t e i n f a m i l i e s ： p a t h o g e n e s i sr e l a t e d10p r o t e i n s ，t h a u m a t i n - l i k ep r o t e i n s ，l i p i dt r a n s f e rp r o t e i n sa n d p r o f i l i n s I np e a c h ( P r u n u sp e r s i c a ) ，t h e s ea l l e r g e ng e n ef a m i l i e sa r ed e s i g n a t e da s P r uPl 诵4a n df o ra l m o n d ( P r u n u sd u l c i s ) P r l ld t llt o4 T h i ss t u d yW a st o c h a r a c t e r i z ep u t a t i v ep e a c ha l l e r g e ng e n e sf o rt h e i rg e n o m i cs e q u e n c e sa n dl i n k a g e m a pp o s i t i o n s ，a n dt oc o m p a r et h e m 、i t l lp r e v i o u s l yc h a r a c t e r i z e dh o m o l o g o u sg e n e s i na p p l e ( M a l u sd o m e s t i c a ) I nt h ep r e s e n ts t u d y , s p a t i a lt r a n s c r i p te x p r e s s i o no ft h e f o u rp u t a t i v ea l l e r g e n c o d i n g g e n ef a m i l i e s i n p e a c hf r u i t , a n t h e ra n dl e a fW a s m o n i t o r e db yr e a l - t i m eP e Rt og a i ni n s i g h ti n t ot h e i re x p r e s s i o np r o f i l ea n dk e y m e m b e r si n v o l v e di np e a c ha l l e r g y T h em a i nr e s u l t sw e r es u m m a r i z e da sf o l l o w i n g ： 1 At o t a lo f18p u t a t i v ep e a c h a l m o n da l l e r g e ng e n e sh a v e b e e nm a p p e do nf i v e l i n k a g eg r o u p s T h e i rp o s i t i o n s c o n f m nt h e h i g hm a c r o - s y n t e n yb e t w e e n p e a c h a l m o n da n da p p l e E i g h tP 州p d ulg e n e sw e r ei d e n t i f i e d ，f o u ro fw h i c hw e r e n e w A l lt h eP r u p d ulg e n e sw e r em a p p e d i nas i n g l eb i no nt h et o po fG1 F i v eP r u p d u2g e n e sw e r em a p p e d o nf o u rd i f f e r e n tl i n k a g eg r o u p s ，t w ov e r ys i m i l a rP r u p d u 2 0 1g e n e s 徂a n dB ) w e r eo nG 3 ，P r u p d u2 0 2o nG 7 ，P r u p d u2 0 3o nG 8a n dP r t l p d u2 0 4o nG 1 T h e r ew e r ed i f f e r e n c e si nt h ei n t r o na n de x o ns t r u c t u r ei nt h e s eP m p i d u2g e n e sa n di nt h e i ra m i n oa c i dc o m p o s i t i o n T h r e eP r u p d u3g e n e s ( 3 o l _ 3 0 3 ) c o n t a i n i n ga ni n t r o na n dam i n ie x o no f10n tw e r em a p p e di nac l u s t e ro nG 6 P r l l p d u4 0 1a n d4 0 2w e r el o c a t e do nG 1a n dG 7 ，r e s p e c t i v e l y T h eP r up d ulc l u s t e r o nG 1a l i g n e dt ot h eM a ldlc l u s t e r so nL G l 6 ；P r u p d u2 0 1 Aa n dBo nG 3t oM a ld 2 0 1 Aa n dBo nL G 9 ；t h eP r u p d u3c l u s t e ro nG 6 t oM a ld3 0 1o nL G l 2 ；P r u p d u 4 0 1o nG 1t oM a ld 4 0 3o nL G8 ；a n dP r u p d u4 0 2o nG 7t oM a ld 4 0 2o nL G 2 2 T r a n s c r i p ta b u n d a n c ea n de x p r e s s i o np a t t e r n so ft h ee i g h t e e ni s o a l l e r g e n sw e r e h e t e r o g e n e o u s ，d e p e n d i n go nt h es p e c i f i ci s o a l l e r g e na n dt i s s u e se x a m i n e d ，e s p e c i a l l y b e t w e e ne p i c a r pa n dm e s o c a r p P r up1 o l ，P r t lpl 。0 6 B ，P r t lp3 o l ，P r up4 0 1a n d P r uP4 0 2w e r ep r e d o m i n a n t 。T r a n s c r i p tl e v e l si nm e s o c a r pW a ss i g n i f i c a n tl o w e r t h a ni ne p i c a r p F e wi s o a l l e r g e n se x h i b i t e dt i s s u es p e c i f i c i t y ：P r uP3 0 2W a so n l y d e t e c t e di nl e a fw h e r e a sP r MP3 0 3o n l yi na n t h e r P r t lP1 0 2W a sa b u n d a n ti nl e a f b u ta b s e n ti nf r u i tt i s s u e s At h o r o u g ha n a l y s i so nt h et r a n s c r i p te x p r e s s i o no fa l lp e a c h V p u t a t i v ei s o a l l e r g e n s d e r i v e df r o mg e n o m i cr e s e a r c hs h o w e dd i f f e r e n t i a l s p a t i a l t r a n s c r i p tp r o f i l ei np e a c hf r u i t ，a n t h e ra n dl e a f S p e c i f i ci s o a l l e r g e n sw a sp r e d o m i n a n t i nt h e s et i s s u e s T h e s er e s u l t sc a np r o v i d ep r e l i m i n a r yi m p l i c a t i o n st o w a r d sk e yg e n e s i n v o l v e di na l l e r g e n i c i t yd i f f e r e n c ea n dt h e i rd i v e r s eb i o l o g i c a lr o l e s K e yw o r d s ：p e a c h ；a l l e r g e ng e n e s ；m a pp o s i t i o n ；P R 1 0 ；T L P ：0 r P ：p r o f i l i n ；r e a l - t i m e P C R ；g e n ee x p r e s s i o n 缩略词英文全称 A b b r E n g l i s hn a m e 缩略语表 A b b r e v i a t i o n s 中文名称 c h i n e s el l a m e e D N A c o m p l e m e n t a r yD N A互补脱氧核糖核酸 C T A B C e t yT r i m e t h lA m m o n i u mB r o m i d e 十六烷基三甲基溴化铵 D E P C D i e t h y lP y r o c a r b o n a t e二乙基焦碳酸盐 E S T L T P E x p r e s s e dS e q u e n c eT a g表达序列标签 l i p i dt r a n s f e rp r o t e i n脂质转移蛋白 N C B I 溢怒i 2 细B i m c b n 0 1 0 9 y 美国国家生物技术信息中心 O R F O p e nr e a d i n gf r a m e开放阅读框 P A G E P o l y a c r y l a m i d eG e lE l e c t r o p h o r e s i s 聚丙烯酰胺凝胶电泳 P F NP r o f i l i n 抑制蛋白 P R 1 0 p a t h o g e n e s i s r e l a t e dp r o t e i n 病程相关蛋白1 0 Q P C R R e a l t i m eq u a n t i t a t i v eP C R 实时定量P C R R F L P S N P S S R T L P R e s t r i c t i o n F r a g m e n t L e n g t h 限制性片段长度多态性 P o l y m o r p h i s m S i n g l eN u c l e o t i d eP o l y m o r p h i s m S i m p l eS e q u e n c eR e p e a t t h a u m a t i nl i k ep r o t e i n V I I 单核苷酸多态性 简单重复序列 类甜蛋白 目次 致谢I 摘要I I I 缩略语表。V I I 目次V I I I 第一章文献综述1 1 1 食物过敏与水果过敏概况1 1 2 国内外水果过敏研究情况2 1 3 桃过敏研究3 1 4 桃分子标记图谱构建和应用研究进展4 1 5 基因位点上单核苷酸扩增多态( S N P ) 标记技术发展和利用。5 1 6R e a l t i m eP C R 技术在水果过敏原基因表达上的应用5 1 7 研究内容与目标6 第二章桃四类过敏原基因家族成员的克隆与图谱定位。7 2 1 材料7 2 2 试验方法8 2 2 1 基因克隆和定位总体试验流程图8 2 2 2 桃四类过敏原基因的克隆8 2 2 3 序列分析1 0 2 2 4 基因组步移1 0 2 2 5 实验试剂和仪器l1 2 2 6 分子标记和选择性图谱定位方法1 1 2 - 3 过敏原基因的命名1 3 2 4 结果一。1 3 2 4 1P r u p d u I 基因的图谱定位2 3 2 4 2P r u p d u2 基因的图谱定位2 3 2 4 3P r up d u3 基因的图谱定位2 4 2 4 4P r u p d u4 基因的图谱定位2 5 V I I I 2 5 _ i 寸论2 5 2 5 1 桃过敏原基因与苹果过敏原基因定位图谱比较2 5 2 5 2 桃过敏原基因与拟南芥过敏原基因定位图谱比较2 8 2 5 3 选择性图谱定位的可行性与有效性2 8 2 6 结论2 8 第三章桃四类过敏原基因在湖景蜜露和玉露不同组织中的表达3 0 3 1 材料3 0 3 2 方法31 3 2 1 桃R N A 的提取3 1 3 2 2D N a s e I 处理总R N A 3l 3 2 3 逆转录3 1 3 2 4R e a l - t i m eP C R 反应体系及程序3 2 3 2 5R e a l t i m eP C R 引物的设计3 2 3 3 实验结果3 3 3 3 1 桃过敏原基因P r u pJ 在湖景蜜露和玉露不同组织的表达。3 3 3 3 2 桃过敏原基因尸厂“p 2 在湖景蜜露和玉露不同组织的表达3 4 3 3 3 桃过敏原基因厅甜p 3 在湖景蜜露和玉露不同组织的表达3 5 3 3 4 桃过敏原基因P r u p 4 在湖景蜜露和玉露不同组织的表达3 5 3 4 讨论3 6 3 5 结j 沦3 7 第四章J 、结与展望3 8 4 1 小结3 8 4 2 展望3 8 参考文献4 0 作者简历及在学期间所取得的科研成果4 8 I X 浙江大学博士学位论文( 2 0 1 0 ) 第一章文献综述 1 1 食物过敏与水果过敏概况 食物过敏是以免疫球蛋白E ( I g E ) 为介导的对一些一般来讲无毒性的过敏 原( 绝大多数为蛋白质) 的超敏反应( 白清云，2 0 0 5 ；B o h l e ，2 0 0 4 ) 人类对食 物过敏的认识在近2 0 年有了全面的了解临床流行病学研究显示，目前约3 3 的过敏反应是由食物诱发的，严重时会危及生命。随着我国经济的发展和现代生 活方式的流行，城市居民的食品过敏问题已经呈现上升趋势。估计我国的食物过 敏人数约有4 0 0 0 5 0 0 0 万，占总人口的4 ( 白清云，2 0 0 5 ) 对3 4 9 1 名中国医 科大学学生( 1 5 2 5 岁) 的调查显示，约有6 的人曾有食物过敏史，果实是十 类主要致敏食物之一( 吕相征等，2 0 0 5 ) 。进入二十一世纪，食物过敏对公众健 康的影响已经成为全球关注的公共卫生问题之一我国食物过敏发生人口比例也 很高，但长期以来没有引起足够的重视，近2 3 年正受到研究者的关注，2 0 0 5 年以来国家自然科学基金就资助了多项食品( 虾、牛奶、荞麦) 过敏原的医学基 础研究。 食物过敏症状通常是局部的口腔症状，称为口腔过敏综合症( O A S ) ，也有 其它症状例如皮肤( 局部或全身风疹，遗传性过敏湿疹) ，胃肠道( 腹部绞痛， 腹泻，呕吐) ，鼻和肺( 鼻炎和哮喘) ，心血管系统( 过敏性休克) ( F e m a n d a z R i v a s 和M i l e s ，2 0 0 4 ) ，例如芒果( M a n g i f e r ai n d i c aL ) 过敏症状为接触性皮炎( 颜秀 美等，2 0 0 2 ) ，荔枝( L i t c h ic h i n e n s i s ) 可引起过敏性哮喘，荨麻疹、过敏性紫 癜、过敏性皮炎、搔痒症和呼吸困难等( 徐红波等，2 0 0 5 ) 。另外，菠萝( 程文 伟等，1 9 9 5 ) 、猕猴桃( 司秀红，2 0 0 1 ) 、香蕉( 施少婷，2 0 0 6 ) 等均有皮肤、 消化道及过敏性休克症状出现。 在过去的2 0 年，西方发达国家的食物过敏发生比例呈现增加态势，一些专 家推测这是由于人们干净的工作和居住环境、生活方式改变、和全球化食物生产 供应链变化所引起。我国水果过敏最常见的是芒果、桃、樱桃、菠萝、西瓜、荔 枝、龙眼、山竹、伊丽莎白瓜、火龙果、木瓜、草莓等，并开始引起人们的重视。 食物过敏已经从纯医学诊断治疗研究转向一个多学科协同预防途径来解决。在植 物遗传育种方面，目前已经有利用先进的植物基因工程抑制水稻和大豆中的过敏 浙江大学博J ：学位论文( 2 0 1 0 ) 蛋白表达( H e r m a n 等，2 0 0 3 ；T a d a 等，1 9 9 6 ) ，但借助分子技术采用传统杂交 选育方法更容易被消费者接受。 1 2 国内外水果过敏研究情况 食物过敏的发生是一个多因子互作结果，主要取决于人本身的遗传、环境影 响的免疫系统和食物中特定蛋白质的性质和数量。由于地理和人类种群的差异， 发生过敏的食物种类和程度不同。最早的水果过敏研究是1 9 4 8 年对苹果过敏的 临床观测( J u h l i n D a n n f e l t ，1 9 4 8 ) ，最新调查有2 的北欧人吃苹果过敏产生口 腔过敏综合症，中国也有报道( 邵洁等，2 0 0 5 ) ，这是由苹果中的M a ld l 过敏原 引起；欧洲南部国家人群对桃中的脂质转移蛋白L 1 限过敏( P a s t o r e l l o 等，1 9 9 9 ) 比较植物中已知过敏蛋白的分子结构，发现他们属于几个大的家族，有相似 的结构域( B a l l m e r - W e b e r ，2 0 0 3 ；B r e i t e n e d e r 和E b n e r ，2 0 0 0 ；B r e i t e n e d e r 和 M i l l s ，2 0 0 5 ) 。在水果中主要有四类过敏原：与病程相关蛋白P R 1 0 ( p a t h o g e n e s i s r e l a t e dp r o t e i n ，P R o l O ) 、类甜蛋白( t h a u m a t i nl i k ep r o t e i n ，T L P ) 、 脂质转移蛋白( 1 i p i d t r a n s f e r p r o t e i n ，L 1 限) 和抑制蛋白( P r o f i l i n ) ( B r e i t e n e d e r ， 2 0 0 4 ；F e m a n d e z R i v a s 等，1 9 9 9 ；P a s t o r e l l o ，1 9 9 9 ) 。第一类为主要过敏原，在 蛋白质分类中属于植物病程相关蛋白( P a t h o g e n e s i sr e l a t e d ，P R ) 第1 0 家族，它 与桦树花粉中的过敏蛋白B e t v l 致敏产生的l g E 发生交叉反应。多数对桦树花粉 过敏的患者吃水果后发生1 3 腔过敏综合症( O A S ) ，一般症状表现为口腔、嘴唇、 舌头、喉咙发痒和发肿，不同水果品种引发的过敏反应程度不同，这些过敏原包 括苹果( M a ld1 ) 、梨( P ”c1 ) 、杏( P m a r1 ) 、甜樱桃( P ma v1 ) 等，分子量 约为1 8k D a 。第二类是类甜蛋白( T L P ) ，属于植物病程相关蛋白第5 家族( P R 5 ) ， 是成熟水果主要蛋白质组分，其引发过敏的地理区域不太清楚，这些过敏原包括 苹果( M a ld2 ) 、甜樱桃( P ma v2 ) 等。第三类是脂质转移蛋白( n sL T P ) ，隶 属于植物病程相关蛋白第1 4 家族。许多蔷薇科水果中的n s L T P 会引发胃肠道过 敏反应。这些过敏原有桃( P mP3 ) 、苹果( M a ld3 ) ，杏( P 1 1 la r3 ) 和李( P r ud 3 ) 等，第四类是抑制蛋白( p r o f i l i n ) ，许多研究者认为它与桦树类似的B e t ，2 发生交叉反应，临床观察证据和影响人群尚不清楚，这些过敏原有梨P ) r rc4 、 樱桃P ma v4 、桃P r uP4 等。 苹果四类2 8 种过敏原基因已经被定位在国际参照的苹果分子标记连锁图谱 浙江大学博士学位论文( 2 0 1 0 ) 上( G a o 等，2 0 0 5 a ，b ，c ) 。用R N A 干扰法已经成功地沉默了苹果过敏原M a ld J 基因表达( G i l i s s e n 等，2 0 0 5 ) 。在此基础上，2 0 0 6 2 0 0 8 欧盟第六框架的综合 研究项目I S A F R U I T 包含了利用分子育种手段培育无( 低) 过敏苹果新品种的研 究内容。张红云等( 2 0 0 6 ) 研究了荔枝果实中泛变应原p r o f i l i n 基因的克隆及序 列分析，从荔枝果实中成功地克隆出了一个泛变应原基因，为进一步的蛋白表达 奠定了基础。张红云等( 2 0 0 7 ) 研究了芒果果实中泛变应原p r o f i l i n 的克隆、表 达及免疫学活性鉴定，成功地克隆和表达了芒果p r o f i l i n ，并证明与芒果过敏者 血清有特异I g Z 应答。每个过敏原家族有多个基因成员，同一种果实中含有多种 过敏原种类和同工型，在水果方面，樱桃的重组蛋白做的较早且全面，其次是苹 果。 1 3 桃过敏研究 桃( P r u n u s p e r s i c a ) 是世界性大宗水果，我国桃果实的年产量7 0 0 8 0 0 万吨， 居世界首位。由于消费量和消费人群的扩大，桃已经近年来我国最常见的过敏水 果之一根据临床观测和网上搜索，吃桃引发的过敏反应有两种，一种是口腔过 敏综合症，另一种是全身系统性皮肤和肠胃反应及个别休克现象( 海莲和阎璞， 1 9 9 7 ；文昭明和叶世泰，2 0 0 2 ) 表皮有毛的桃品种更易引起过敏反应，接触桃 毛或盛花期花粉也易引起过敏反应。 欧洲桃过敏现象从1 9 9 5 年开始被大量报道，主要发生在靠近地中海的西班 牙和意大利( v a nR e eR 等，1 9 9 5 ；F e r n a n d e z R i v a s 等，1 9 9 7 ；P a s t o r c l l o 等，1 9 9 9 ) ， 报道的桃过敏反应症状类型与我国相似。目前已经对桃果实中过敏原的鉴定和分 子克隆进行了系列研究( F e r n a n d e z R i v a s 等，1 9 9 9 ；P a s t o r e l l o 和D i a z P e r a l e s ， 2 0 0 2 ) ，桃果实中的L 1 P 蛋白的晶体结构也已确定( N i c o l a 等，2 0 0 6 ) 目前G e n e B a n k 已登录桃果实四类过敏原编码基因序列，包括4 个病程相关蛋白- 1O ( P R 1 0 ) 基 因、4 个类甜蛋白( T L P ) 基因、3 个脂质转移蛋白( L T P ) 基因和2 个抑制蛋白 ( P r o f i l i n ) 基因。开展桃过敏原基因的图谱定位和表达研究，可为阐明桃过敏机 理和选育低过敏品种提供实验依据。 研究桃过敏原基因的基因组是可行的：第一、以医学和分子生物学为基础， 研究一系列候选基因是可行的。第二、在基因组数据上找到许多桃E S T s ( 主要 来源于智利，意大利和美国) ，其中包括四类桃过敏原基因家族的不同成员第 浙江大学博七学位论文( 2 0 1 0 ) 三、高度饱和的李属遗传参考图谱T x E ( T 代表扁桃T e x a s ，E 代表桃E a r l y g o l d ) 和选择性图谱法提供了一种有效可靠的过敏原基因定位的方法。桃和苹果均属于 蔷薇科，比较李属( T x E ) 和苹果( P x F ) 分子标记图谱( M a l i e p a a r d 等，1 9 9 8 ) 中共享的多个R F L P 标记，发现两属问有较高的同线性，桃的G 1 连锁群和苹果 的L 1 3 、L 1 6 连锁群；G 3 和L 9 、L 1 7 ；( 3 4 和L 5 、L 1 0 有同源关系( D i r l e w a n g e r 等，2 0 0 4 ) 。根据苹果中三类过敏原基因图谱可以推测桃中类似基因的位置( G a o ， 2 0 0 5 d ) 。拟借鉴苹果四类过敏原基因克隆图谱定位经验，桃四类过敏原基因克隆 和图谱定位是可行的。 1 4 桃分子标记图谱构建和应用研究进展 桃属于蔷薇科李属，它的基因组只有2 2 0M b p ，为拟南芥的2 倍，长期以来 作为多年生木本果树的模式植物开展遗传研究。目前已经初步建立了桃基因组数 据库( h t t p ：w w w b i o i n f o W S H e d u g d r ) 。桃栽培品种多为二倍体( 2 x = 1 6 ) 。J o o b e u r 等( 1 9 9 8 ) 发表了一个重要李属( P r u n u s ) 参考框架分子标记图谱( T x E ，T 、 E 分别代表扁桃和桃亲本) 。R e n a t e 等( 2 0 0 5 ) 通过一些核心标记把关键的细菌 人工染色体( B A C ) 克隆定位到标记图谱中，而且把1 1 2 的侯选基因E S T 定位 到B A C s 。根据V i s i o n 等( 2 0 0 0 ) 在G e n e t i c s 发表的选择作图( s e l e c t i v em a p p i n g ) 理念，H o w a r d 等( 2 0 0 5 ) 选出6 个交换后代个体，代表桃基因组6 7 个连锁区段 ( b i n ) ，平均长度为6 7c M ，再加上F l 杂种及其1 个亲本组成8 个选择性区段 定位样本，极大地简化了新基因标记定位 欧盟的桃分子标记图谱构建和应用处于世界领先地位，西班牙建立了重要参 考框架分子标记图谱( T x E ) ，它是包含5 0 0 多个标记的高密度图谱，并整合了 部分B A C 克隆和E S T 序列。目前国际上一般用这个群体进行功能基因定位另 外，通过比较李属( T x E ) 和苹果属( P x F ) 分子标记图谱( M a l i e p a a r d 等，1 9 9 8 ) 中共享的多个R F L P 标记，发现两属间有较高的同线性( s y n t e n y ) ，桃的G 1 连 锁群和苹果的L 1 3 、L 1 6 连锁群；G 3 和L 9 、L 1 7 ；G 4 和L 5 、L 1 0 有同源关系 ( D i r l e w a n g e r 等，2 0 0 4 ) 。根据苹果中三类过敏原基因图谱可以推测桃中类似基 因的位置( G a o ，2 0 0 5 d ) 。利用适宜的分子标记技术可为研究桃过敏原基因定位 提供便利。 4 浙江大学博二七学位论文( 2 0 1 0 ) 1 5 基因位点上单核苷酸扩增多态( S N P ) 标记技术发展和利用 在D N A 水平上，频率最高的等位基因变化是单核苷酸多态( S N P ) ，拟南芥 的变异为平均每3k b 中有1 个S N P 。用简单的P C R 和琼脂糖凝胶技术来检测S N P 最近已应用于追溯特异位点和克隆。G a o 等( 2 0 0 5 ) 采用一种改良的普通P C R 鉴定S N P 方法：在只有1 个S N P 时，设计引物在37 端的第2 或第3 位置人为 导入一个错配碱基方法可以使目标位点的P C R 产物显著高于非目标位点的产 物，可以用普通的琼脂糖凝胶电泳检测，这种标记被称为单核苷酸扩增多态 ( S N P ) 。G a o 等( 2 0 0 5 a ，b ，c ) 在克隆和定位4 个苹果过敏原基因家族中成功 地应用了S N P 标记。S N P 本身为显性标记，需要分别测试。为克服这一不便， 需要探索实验共显性的标记。过敏原基因的定位应用了新的S N P 标记技术，基 因克隆序列分析开发基于目标基因的单核苷酸的分子标记，创造性地设计基于单 核苷酸( S N P s ) 多态性的引物，用普通的P C R 凝胶电泳分辨一个基因上的多个 等位位点而且应用于高度相似的基因家族的各成员的遗传定位和遗传分析。研 究思路可以应用到许多功能基因的定位中。 1 6R e a l t i m eP C R 技术在水果过敏原基因表达上