福建尤溪金柑RAPD分析及柑桔类种质资源的离体保存研究-硕士论文

分类号：$ 6 6 6 ；Q 8 1 3 密级： 福建农林大学硕士学位论文 单位代码：1 0 3 8 9 学号：1 0 7 0 5 0 7 福建尤溪金柑R A P D 分析及柑桔类种质资源的 离体保存研究 学科门类： 一级学科名称： 二级学科名称： 研究方向： 研究生： 指导教师： 农学 园艺学 果树学 生物技术 董艳 赖钟雄研究员 完成时间：二0 0 年四月 I l 1 ll l If lr i llr l 1 l r I I Y 17 4 8 0 0 3 T h e s i sf o rM a s t e r SD e g r e eo fF u ji a nA g r i c u l t u r ea n dF o r e s t r yU n i v e r s i t y R A P D a n a l y s i so fY o u x ik u m q u a t ( F o r t u n e l l ac r a s s i f o l i a ) a n d m - V l t r oC O n s e r V a n o nO lc l t r U Sg e r m p l a s mi nrn l l a nr r 0 V l n c e |l 1 n1 h D i s c i p l i n e ：A g r o n o m y F i r s tR a n kD i s c i p l i n e ：H o r t i c u l t u r e S e c o n dR a n k D i s c i p l i n e ：P o m o l o g y R e s e a r c hF i e l d ： B i o t e c h n o l o g y P o s t g r a d u a t e ：D o n gY a n S u p e r v i s o r ：P r o f L a iZ h o n g x i o n g S u b m i t t e dT i m e ：A p r i l ，2 0 1 0 I n s t i t u t eo fH o r t i c u l t u r a lB i o t e c h n o l o g y F u j i a nA g r i c u l t u r ea n dF o r e s t r yU n i v e r s i t y F u z h o u3 5 0 0 0 2 P R C h i n a 研究成果， 论文中不 包含其他人发表或撰写过的研究成果。与我一同对本研究做出贡献的同志，都在论文中作了 明确的说明并表示了谢意，如被查有侵犯他人知识产权的行为，由本人承担应有的责任。 学位( 毕业) 论文作者亲笔签名青彬日期细f o 辛佣学位毕业论文作者亲笔签名：商牢陟日期：砌扣锋q o 专纠 论文使用授权的说明 本人完全了解福建农林大学有关保留、使用学位( 毕业) 论文的规定，即学校有权送交 论文的复印件，允许论文被查阅和借阅；学校可以公布论文的全部或部分内容，可以采用影 印、缩印或其他复制手段保存论文。 保密，在年后解密可适用本授权书。 口 不保密，本论文属于不保密。 口 学位c 毕业，论文作者亲笔签名：青彬日期知p 辛q 阳 指导教师亲笔签名： 日期： - - k , QI 。，多，哆 目录 缩略词I 摘要I I I A b s t r a c t V 第一章引言l 1 植物D N A 分子标记研究进展l 1 1 第一代分子标记技术l 1 1 1R F L P ( R e s t r i c t i o nF r a g m e n tL e n g t hP o l y m o r p h i s m ，限制性片段长度多态性) 2 1 1 2V N T R ( V a r i a b l eN u m b e ro f T a n d e mR e p e a t s ，数目可变串联重复多态性) 2 1 2 第二代分子标记技术2 1 2 1 基于P C R 的D N A 分子标记2 1 2 2 基于P C R 与限制性酶切技术结合的D N A 标记4 1 3 第三代分子标记技术5 1 4 几种新型分子标记5 1 4 1R G A s ( R e s i s t a n c eG e n e A n a l o g s ，抗病基因类似物) 5 1 4 2R M A P D ( R a n d o mM i c r o s a t e l l i t eA m p l i f i e dP o l y m o r p h i s mD N A ，随机微卫星扩增多态) 5 1 4 3T R A P ( T a r g e tR e g i o nA m p l i f i e dP o l y m o r p h i s m ，靶位区域扩增多态性) 5 2 植物种质资源离体保存研究进展。5 2 1 组织培养保存法6 2 2 超低温保存法6 3 植物S O D 的生理作用及其基因克隆6 3 1S O D 的结构及生理作用6 3 1 1 结构6 3 1 2 生理作用。7 3 2 植物体内活性氧( R O S ) 及其清除7 3 3 植物S O D 基因克隆。8 3 3 1 基因克隆的主要方法。8 3 2 2S O D 基因的分子克隆9 4 柑桔D N A 分子标记、离体保存及相关基因研究进展9 4 1 柑桔D N A 分子标记的研究进展9 4 1 1 柑桔种质资源遗传多样性的研究及分类9 4 1 2 构建分子遗传图谱1 0 4 1 3 构建指纹图谱和品种鉴别1 0 4 1 4 杂种鉴定及杂种育种研究l l 4 1 5 基因定位l l 4 2 柑桔离体种质保存研究进展1 2 4 2 1 柑桔种质资源离体保存的优点1 2 4 2 2 国内外柑桔种质资源离体保存研究进展。1 2 4 3 基因克隆在柑桔中的应用。1 3 5 本研究的主要内容及意义1 3 5 1 研究内容。1 3 5 2 研究意义。l3 第二章福建尤溪金柑遗传多样性的R A P 分析15 l 材料与方法1 6 1 1 材料1 6 1 2 实验设备、实验试剂1 6 1 2 1 实验设备16 1 2 2 试验试剂1 6 1 2 3 溶液的配制1 6 1 3R A P D 分析方法l7 1 3 1 金柑基因组D N A 的提取1 7 1 3 2 金柑基因组D N A 的检测18 1 3 3D N A 扩增反应1 8 1 3 4R A P D 反应引物筛选1 9 1 3 5 数据分析方法1 9 2 结果与分析1 9 2 1 金柑基因组D N A 的检测1 9 2 1 1 琼脂糖凝胶电泳检测1 9 2 1 2O D 值检测2 0 2 2 凡廿D 引物筛选2 l 2 3 金柑R A P D 多态性分析。2 3 2 3 1 不同引物对1 2 2 份金柑样品的P C R 扩增图谱2 3 2 3 2 多态性分析2 4 2 4 聚类分析2 6 3 讨论：；：1 3 1 尤溪金柑的遗传多样性3 2 3 2 尤溪金柑的遗传变异。3 2 3 3 试验结果稳定性讨论3 3 第三章福建柑桔类种质资源试管苗的离体保存研究3 5 第一节1 6 份柑桔类种质资源的胚培养及其试管苗离体保存研究3 5 l 材料与方法3 5 1 1 材料3 5 1 2 方法。3 5 1 2 1 柑桔种子的消毒及珠心胚剥取。3 5 1 2 2 不同保存时间对柑桔成熟胚试管苗的影响3 5 2 结果与分析。3 6 2 1 不同保存时间对柑桔成熟胚试管苗叶片数和主根长的影响3 6 2 1 1 保存1 个月时M S 培养基对不同材料叶片数和主根长的影响。3 6 2 1 2 保存2 个月时M S 培养基对不同材料叶片数和主根长的影响3 7 2 1 3 保存6 个月时M S 培养基对不同材料叶片数和主根长的影响3 8 2 1 4 保存1 2 个月时M S 培养基对不同材料叶片数和主根长的影响3 9 2 1 5 保存1 8 个月时M S 培养基对不同材料叶片数和主根长的影响4 0 2 2 不同柑桔资源成熟胚试管苗的保存效果。4 2 3 讨论4 ：! 第二节2 8 份柑桔离体保存试管苗保存情况观察4 5 1 材料与方法4 5 2 结果与分析。4 5 3 讨论4 6 第四章柑桔试管苗M n - S O D 基因克隆4 9 l 材料与方法4 9 1 1 材料4 9 1 2 仪器和试剂。4 9 1 2 1 仪器4 9 1 2 2 试剂。5 0 1 3 试验方法。5 0 1 3 1 金柑叶片总R N A 的提取方法和浓度检测5 0 1 3 2 早熟金柑试管苗M n - S O D 基因c D N A 保守区的克隆5 0 1 3 3 早熟金柑试管苗M n S D D 基因c D N A 的3 R A C E 扩增5 2 1 3 4 早熟金柑试管苗M n - S O D 基因c D N A 的57 R A C E 扩增。5 3 1 3 5 早熟金柑试管苗M n - S O D 基因开放阅读框( O R F ) 的克隆5 6 1 3 6 全长序列拼接5 6 1 3 7 全长序列分析5 6 2 结果与分析5 6 2 1 早熟金柑试管苗总R N A 提取纯度与浓度检测5 6 2 2 早熟金柑试管苗M n - S O D 基因c D N A 保守区的克隆结果5 6 2 3 早熟金柑试管苗M n - S O D 基因c D N A 的3 R A C E 克隆结果5 8 2 4 早熟金柑试管苗M n S O D 基因c D N A 的5 R A C E 克隆结果5 9 2 5 早熟金柑试管苗M n S O D 基因全长序列拼接结果6 l 2 6 全长序列分析。6 1 2 6 1 核苷酸序列同源性比较6 1 2 6 2 编码基因开放阅读框氨基酸序列分析6 2 2 6 3 早熟金柑试管苗M , - g O D 蛋白理化性质预测与分析6 3 2 6 4 早熟金柑试管苗M n - S O D - 级结构的预测与分析一6 4 2 6 5 早熟金柑试管苗M n - D D 三维结构的预测与分析一6 5 3 讨论6 6 3 1 早熟金柑试管苗肠, g O D 基因C D N A 全长获得的意义6 6 3 2S O D 研究中存在问题6 6 第五| 章小结6 7 多考：斌7 3 图版和图贩说明8 l 致谢一1 1 6 缩略词 缩写词 英文全称中文名称 A m p 心 b p C D N A d d d H 2 0 D E P C D N A D N a s e 心盯P D T T E B E D 呵A G D G S h k b l ( D 舢n m L r n m o l m R N A N C B l O D O R F P C R p o l y ( A ) P V P P V P P r r a i n R A C E R A P D I 乇N 舔e R n a s e H R N a s i n R O S r R N A I t T - P C R S A m p i c i l i n A d a p t e rP r i m e r B a s ep a i r C o m p l e m e n t a r yD N A D a y D i s t i l l e dd e i o n i z e dw a t e r D i e t h y lp y r o c a r b o n a t e D e o x y r i b o n u c l e i ca c i d D e o x y r i b o n u c l e a s e D e o x yn u c l e i o t i d et r i p h o s p h a t e s D i t h i o t h r e i t o l E h i d i u mb r o m i d e D i d o d i u me t h y l e n e d i a m i n e t e t r a - a e e t a t G e n e t i cD i s t a n c e G e n e t i cS i m i l a r i t y H o u r K i l o b a s e K i l o d a l t o n M i n u t e M i l l i l i t e r M i i l i m o l L M e s s e n g e rR N A N a t i o n a lC e n t r ef o rB i o t e c h n o l o g yI n f o r m a t i o n O p t i c a lD e n s i t y O p e n i n gR e a d i n gF r a m e P o l y m e r a s eC h a i nR e a c t i o n P o l y a d e n y l i ca c i d P o l y v i n y l p y r r o l i d o n e P o l y v i n y l p y r r o l i d o n e R e v o l u t i o n sp e rm i n u t e R a p i dA m p l i f i c a t i o no f e D N AE n d s R a n d o mA m p l i f i e dP o l y m o r p h i cD N A R i b o n u c l e a s eR N A R i b o n u c l e a s eH R i b o n u c l e a s e R e a c t i v eO x y g e nS p e c i e s R i b o n u c l e a s e R e v e r s et r a n s c r i p t i o np o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n S e c o n d 氨苄青霉素 接头引物 碱基对 互补D N A 天 双蒸水 焦碳酸二乙脂 脱氧核糖核酸 脱氧核糖核酸酶 脱氧核苷三磷酸 二硫苏糖 溴化乙锭 乙二胺四乙酸 遗传距离 遗传相似系数 小时 千碱基 千道尔顿 分钟 毫升 每升毫摩尔 信使R N A 美国国家生物技术信息中心 光密度 开放阅读框 聚合酶链反应 聚腺苷酸 聚乙烯吡咯烷酮 聚乙烯聚吡咯烷酮 转数分钟 c D N A 末端快速扩增法 随机扩增多态性D N A R N a s e 酶 核糖核酸酶H 核糖核酸酶 活性氧族 核糖体R N A 反转录聚合酶链式反应 秒 S D S S O D T A E T a q 酶 T E T f i s U A P X - g a l 此 S o d i u ml a u r y lS u l f a t e S u p e rO x i d eD i s m u t a s e T r i sb a s e A e e t i ca c i d E D 朋 T h e r m o sa q u a t i c u sp o l y m e r a s e T r i s E D 明b u f f e r T r i h y d r o x y m e t h y la m i n o m e t h a n e U n i v e r s a lA m p l i f i c a t i o nP r i m e r 5 - b r o m o - 4 - c h l o r o 3 - i n d o l y l 1 3 D g a l a c t o s i d e U i c r o l i t r e 十二烷基硫酸钠 超氧化物歧化酶 啊s 乙酸电泳缓冲液 栖热水生菌D N A 聚合酶 州s 盐酸缓冲液 三羟甲基氨基甲烷 通用扩增引物 5 溴- 4 氯3 吲哚B D 半乳 糖苷 微升 l l 摘要 柑桔属于芸香科( R u t a c e a e ) 柑桔亚科( A e r a n t i o i d e a e ) 柑桔族( C i t r e a e ) 柑桔亚族( C i t r i n a e ) 植物，是具有重要经济价值的热带水果。我国是世界柑桔起源中心之一，且有4 0 0 0 年的栽培 历史。经过数千年的进化发展，形成了种类繁多、形态复杂而又丰富的柑桔种质资源。福建 柑桔种质资源非常丰富，其中国家地理标识产品尤溪金柑，已有3 7 0 多年的栽培历史，长期 以来一直实生繁殖，变异大，资源丰富。鉴于此，本试验首先采用R A P D 分子标记对尤溪金 柑进行遗传多样性分析，进一步对尤溪金柑资源及福建的主要柑桔种质资源进行离体保存研 究，并克隆了早熟金柑试管苗的M n - S O D 基因，为研究柑桔试管苗保存过程中S O D 的作用 机制奠定基础。主要研究结果如下： 1 福建尤溪金柑遗传多样性的R A P D 分析 本试验采集了1 2 2 份尤溪金柑的叶片，这1 2 2 份金柑中包括本实验室与尤溪县良种繁育 场合作研究筛选出的2 0 个优株单株及其周围对照株5 株( 编号为l 一1 2 0 号) ；另外还有两个 母株优株编号分别为1 2 1 和1 2 2 号。对这1 2 2 份金柑资源进行R A P D 遗传多样性分析。结果 显示，供试材料两两间的相似系数较高，平均高达0 9 4 7 。这说明供试的1 2 2 份金柑资源亲缘 关系较近。 所有材料在I ( D l - - 1 3 5 ) 处可以明显的划分为2 组，第一组含有1 0 2 个单株，第二组含 有2 0 个单株。第二组在I I ( D 2 = 1 0 5 ) 处又可分为两个亚组，第一亚组包括1 9 个单株( 在 ( D 3 - - 8 5 ) 处可分为两小组，第- d , 组包括3 个单株，第- d , 组包括1 6 个单株) ；第二亚组 只分出一个母株。第一组在I V ( D 4 = 4 5 ) 处又可以分为四个小组，第- d , 组有9 4 个单株，第 二和三小组各有两个单株，第四小组包含6 个单株。 在D 。= 1 3 5 处划分的第2 组中的2 0 个单株均为早熟株系，可知本试验中所选引物可以清 楚的区分出金柑的早熟和非早熟性状。在D 2 - - 1 0 5 处又可把早熟金柑划分为滑皮和非滑皮两 种。 总体来看，周围的五株与其母株对比均有大小不等的变异。与周围五株基本无差异的母 株编号为9 7 号、9 l 号、1 号、4 9 号。与周围五株有微小差异的母株编号为5 5 号、6 1 号、6 7 号、8 5 号、3 7 号、4 3 号、3 1 号和7 号。与周围五株有差异较大的母株编号为1 0 3 号、1 9 号、 1 3 号、2 5 号、1 0 9 号、1 1 5 号和7 9 号。差异最大的为7 3 号和周围五株。 尤溪金柑的遗传多样性是其种质资源多样性的基础，这点充分说明了尤溪金柑的育种潜 力巨大。 2 柑桔类种质资源试管苗的离体保存研究 温度 体保 目始终最多；胡柚的叶片数目最少，但是由于苏柑在保存l O 个月后，叶片有脱落的现象，使 得苏柑在保存到第1 2 个月时及之后成为叶片数目最少的一种。总体来看，芦柑、桔类、瓯柑 的叶片比较多，金柑类和胡柚的叶片较少。对于主根长，沙糖桔在保存过程中，主根始终最 长，芦柑的主根长仅次于沙糖桔；其余各材料在不同阶段根的生长速度有所波动；早熟金柑 2 号在保存2 个月到1 8 个月的时间里主根长度始终最短。总体看，金柑类的主根长度相比其 他材料的短。 从l8 个月存活率分析，试管苗的叶片数目与主根长度似乎与存活率没有因果关系。保存 最好的为早熟金柑l 号、早熟金柑2 号和胡柚，1 8 个月的存活率分别为5 8 3 、6 1 6 、5 7 6 ， 其中苏柑的存活率最差，在1 5 个月时存活率仅为1 1 9 ，1 8 个月时仅为9 8 ，看来M S 培 养基不适合苏柑的保存。 很多柑桔品种都能在M S 培养基中、不转接不继代的条件下保存很长的时间。如保存至 今的广东阳春桔、福州血橙、福桔、重庆红桔这4 种材料的保存时间长达5 1 个月，其次为四 季桔5 0 个月，福寿桔4 9 个月，而且这些柑桔试管苗仍有继续保存下去的可能。 3 早熟金柑试管苗M n - S O D 基因克隆 以常温离体保存的早熟金柑试管苗幼嫩叶片为材料，获得早熟金柑试管苗M n - S O D 基因 e D N A 全长序列( 全长共1 0 9 7 b p ) ，并且在G e n B a n k 上登录，登录号为：G U 2 3 3 7 4 4 1 。 该M n - S O De D N A 中5 I T R 为6 6 b p ，3 U T R 为3 4 7 b p ，3 端还含有1 3 个p o l y ( A ) 尾。与 不同物种间M n - S O D 基因同源性比较，同源性都比较高。其开放阅读框( O l 疆) 共有6 8 4 个 碱基组成，编码2 2 8 个氨基酸，A T G 为起始密码子、T 从为终止密码子。 蛋白理化性质预测结果显示：早熟金柑试管苗 锄S D D 蛋白的分子量是2 5 1 5 9 7 D a ；理 论等电点p 1 7 8 3 ；原子组成是：C l l 4 0 H l ，6 9 N 3 0 3 0 3 2 8 S 6 ，总原子数为3 5 4 6 ；带负电的氨基酸有 2 0 ( A s G l u ) ，带正点的氨基酸有2 l ( A 1 1 圹L y s ) ：该蛋白质由2 0 种氨基酸组成，其中L e u 、 A l a 、G l y 、L y s 、V a l 、S e r 含量较为丰富，分别为2 4 ( 1 1 4 ) 、2 0 ( 8 8 ) 、2 0 ( 8 8 ) 、1 7 ( 7 5 ) 、1 7 ( 7 5 ) 、1 4 ( 6 1 ) ，C y s 含量最少，只有1 ( O 4 ) 。 二级结构预测表明早熟金柑试管苗M n 舳D 蛋白由5 1 3 2 的a 螺旋、1 4 0 4 的延伸链 和3 0 0 7 的不规则卷曲组成。纵观蛋白的整体结构，a 螺旋和不规则卷曲是早熟金柑试管苗 M n 彻蛋白最大量的结构元件，散布于整个蛋白质中。三级结构预测表明早熟金柑试管苗 胁阳D 蛋白有3 个B 折叠，6 个a 螺旋，并且这3 个B 折叠被6 个Q 螺旋所包围。这些研 究结果为研究柑桔试管苗保存过程中S O D 的作用奠定了重要基础。 关键词：柑桔：尤溪金柑；R A P D ；离体保存；S O D ；基因克隆 I V R A P D a n a l y s i so fY o u x ik u m q u a t ( F o r t u n e l l ac r a s s i f o l i a ) a n d n v i t r oc o n s e r v a t i o no fc i t r u sg e r m p l a s mi nF u ji a nP r o v i n c e A b s t r a c t C i t r u sb e l o n g i n gt oC i t r e a e ，A c r a n t i o i d e a e ，R u t a c e a ep l a n t s ，w a sat r o p i c a lf r u i to fe c o n o m i c a l l yi m p o r t a n tv a l u e C h i n aW a so n eo ft h ew o r l dc e n t e r so fi t so r i g i n ，w i t hac u l t i v a t i o nh i s t o r yo f 4 0 0 0y e a r s A f t e rt h o u s a n d so fy e a t so fe v o l u t i o n a r yd e v e l o p m e n t , aw i d er a n g eo fc o m p l e xa n d r i c hc i t r u sg e r m p l a s mr e s o u r c e sh a df o r m e d F u j i a nW a sr i c hi nc i m J sg e r m p l a s mr e s o u r c e s ，a n d Y o u x ik u m q u a t ( F o r t u n e l l ac r a s s i f o l i a ) w a so n el o c a lf a m o u sc i t r u sf r u i ta n daN a t i o n a l G e o g r a p h i cL o g oP r o d u c tw i t h3 7 0 - y e a rh i s t o r yi nc u l t i v a t i o n Y o u x ik u m q u a tW a sp r o p a g a t e db y e d l i n gp r o p a g a t i o n , w h i c hr e s u l t e di ng r e a tv a r i a n c e t h eg e n e t i cr e s o u r c e sw e r e r i c h F o rt h i s r e a s o n ，g e n e t i cd i v e r s i t yo fY o u x ik u m q u a tw a sf i r s t l ya n a l y z e db yt h eR A P Dm o l e c u l a rm a r k e r , t h e nt h ei nv i t r oc o n s e r v a t i o no fY o u x ik u m q u a tr e s o u r c e sa n dt h em a i nc i t r u sg e r m p l a s mr e s o u r c e s i I lF u j i a nw e r ec o n d u c t e d ，a n df u r t h e rc l o n e dM n - S O Dg e n ef r o mt h el e a fo fk u m q u a tp l a n t l e t s ， w h i c hl a i dt h ef o u n d a t i o nf o rt h es t u d yo fS O Dm e c h a n i s md u r i n gc i t r u sp l a n t l e t sc o n s e r v a t i o n T h em a i nr e s u l t sw e r ea sf o l l o w s ： 1 R A P Da n a l y s i so fg e n e t i cd i v e r s i t yi nY o u x ik u m q u a t T h el e a v e so f12 2a e c e s s i o mo fm a t e r i a l so fY o u x ik u m q u a t , i n c l u d i n g2 0s e l e c t e ds u p e r i o r s t r a i n sa n d5c o n t r o lp l a n t sa r o u n d ( N o 1 1 2 0 ) t h r o u g hc o l l a b o r a t i o nw i t hY o u x iB r e e d i n gF a r m ， t o g e t h e rw i t ht w om o t h e rp l a n t s ( N o 121a n d12 2 ) w e r eu s e da sm a t e r i a l sf o rR A P Da n a l y s i s T h e r e s u l ts h o w e dt h a ts i m i l a r i t yc o e f f i c i e n tb e t w e e nt w ot e s t e dm a t e r i a l sW a sa v e r a g e du pt o0 9 4 7 ， w h i c hi n d i c a t e dt h a tt h et e s t e d12 2k u m q u a tI s o u r c e sh a dc l o s e rg e n e t i cr e l a t i o n s h i p A l lm a t e r i a l so n I ( D l = 1 3 5 ) d i s t r i c tc o u l db ed i s t i n c t i v e l yd i v i d e di n t ot w og r o u p s ，w i t h g r o u plc o n t a i n i n g10 2i n d i v i d u a l sa n dg r o u p2c o n t a i n i n g2 0i n d i v i d u a l s G r o u p2a tI I ( D 2 2 10 5 ) d i s t r i c tc o u l db ed i v i d e di n t ot w os u b g r o u p s ，s u b - g r o u pli n c l u d e s1 9p l a n t sa tr e ( D 3 = 8 5 ) d i s t r i c t t h a tc o u l db ed i v i d e di n t ot w os u b g r o u p s ，w i t hs m a l lg r o u p li n c l u d i n go f3s i n g l ep l a n ta n ds m a l l g r o u p2i n c l u d i n g16s i n g l ep l a n t s ；o n l yo n em o t h e rp l a n tw a ss e p a r a t e df r o ms u b g r o u p2 G r o u pl a tI V ( D 4 _ 4 5 ) d i s t r i c tc o u l db ed i v i d e di n t o4s m a l lg r o u p s ，w i t hs m a l lg r o u p1h a v i n g9 4s i n g l e p l a n t s ，t h es e c o n da n dt h et h i r di n c l u d i n g2r e s p e c t i v e l y , a n dt h ef o u r t hc o n t a i n i n g6 T h e2 0p l a n t so f t h es e c o n dg r o u pa tD l = 1 3 5d i s t r i c tw e r ep r e c o c i o u ss t r a i n s ，w h i c hs h o w e d t h a tt h e s e l e c t e dp r i m e r sc o u l db ec l e a r l yd i s t i n g u i s h e d 豳t h ek u m q u a t sp r e c o c i o u sa n d n o n p r e c o c i o u sc h a r a c t e r i s t i c sA tD 2 ；1O 5d i s t r i c tc o u l ds l i pt h ep r e c o c i o u sk u m q u a ti n t os l i p p e r y p e e la n dn o n - s l i p p e r yp e e l O v e r a l l ，t h em o t h e rp l a n ta n dt h ec o r r e s p o n d i n gf i v ec o n t r a s t i n gp l a n t sa r o u n dh a dv a r i a t i o nt o V s o m ee x t e n tu n e v e n l y , o n l yaf e wm o t h e rp l a n t sa n dt h ec o r r e s p o n d i n gf i v ec o n t r a s t i n gp l a n t s a r o u n dw e r eo fn ov a r i a t i o n ( M o t h e rp l a n tN o 9 7 ，91 ，1 ，4 9 ，a n dt h ec o r r e s p o n d i n gf i v esc o n t r a s t i n g p l a n t sa r o u n d ) T h ec o d eo fm o t h e rp l a n t sw h i c hh a ds l i g h td i f f e r e n c e sw i t ht h es u r r o u n d i n gf i v e p l a n t sw e r eN o 5 5 ，N o 6 1 ，N o 6 7 ，N o 8 5 ，N o 3 7 ，N o 4 3 ，N o 3 1a n dN o 7 T h ec o d eo fm o t h e r p l a n t sw h i c hh a dq u i t ed i f f e r e n c e sw i t ht h es u r r o u n d i n gf i v ep l a n t sw e r eN o 5 5 ，N o 6 1 ，N o 6 7 ， N o 8 5 ，N o 3 7 ，N o 4 3a n dN o 31 T h ec o d eo fm o t h e rp l a n t sw h i c hh a v em a x i m u md i f f e r e n c e sw i t h t h es u r r o u n d i n gf i v ep l a n t sw a sN o 7 3 T h eg e n e t i cd i v e r s i t yw a st h eb a s i so ft