月季不同途径再生体系的建立与优化及遗传转化的研究-硕士论文

分类号 密级：秘密 华中农业大学硕士学位论文 IS3 n 68 8 月季不同途径再生体系的建立与优化及遗传转化的研究 D i f f e r e n tw a y st oe s t a b l i s ha n do p t i m i z er e g e n e r a t i o ns y s t e m a n ds t u d i e so ng e n e t i ct r a n s f o r m a t i o ni nR o s ah y b r i 如 研究生 指导教师 ：包颖 ：包满珠教授 园林植物与观赏园艺研究方向：园林植物遗传育种与生物技术 获碍学位名称：农学硕士获得学位时间：2 0 1 0 年6 月 华中农业大学园艺林学学院 二。一O 年六月 华中农业大学学位论文独创性声明及使用授权书 学位论文 是否保密 星 如需保密，解密时间 如睁年莎月t 1 日 独创性声明 本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成 果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发 表或撰写过的研究成果，也不包含为获得华中农业大学或其他教育机构的学位或证书 而使用过的材料，指导教师对此进行了审定。与我一同工作的同志对本研究所做的任 何贡献均已在论文中做了明确的说明，并表示了谢意。 研究生签名：徽时间：工啪年 6 月 1 1 日 学位论文使用授权书 本人完全了解华中农业大学关于保存、使用学位论文的规定，即学生必须按照学 校要求提交学位论文的印刷本和电子版本；学校有权保存提交论文的印刷版和电子版， 并提供目录检索和阅览服务，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位 论文本人同意华中农业大学可以用不同方式在不同媒体上发表、传播学位论文的全 部或部分内容，并授权中国科学技术信息研究所和北京万方数据股份有限公司将本人 学位论文收录到中国学位论文全文数据库，并进行信息服务( 包括但不限于汇编、 复制、发行、信息网络传播等) ，同时本人保留在其他媒体发表论文的权力。 注：保密学位论文( 即涉及技术秘密、商业秘密或申请专利等潜在需要提交保密的论 文) 在解密后适用于本授权书 学位论椭鲐隙钠挠五弗中 签名日期：勾，口年6 月ff 日签名日期：晓7 0 年6 月，f 目 月季不同途径再生体系的建立与优化及遗传转化的研究 目录 摘要1 A b s t r a c t ：； 缩略词表6 第一章文献综述7 1 引言7 2 植株再生的研究概述7 2 1 植物器官发生途径的再生研究8 2 2 植物体细胞胚发生途径的再生研究8 2 2 1 植物体细胞胚发生的方式和特点9 2 2 2 影响植物体细胞胚发生的因素9 2 2 2 1 基因型对体细胞胚发生的影响9 2 2 2 2 外植体对体细胞胚发生的影响1 0 2 2 2 3 培养基对体细胞胚发生的影响1 0 2 2 2 4 培养条件对体细胞胚发生的影响1 1 3 月季植株再生的研究概述1 2 3 1 月季器官发生途径的植株再生1 2 3 2 月季体细胞胚发生途径的植株再生。1 3 4 植物遗传转化的研究概述1 4 5 月季遗传转化的研究。1 6 6 本研究的目的和意义。1 7 第二章月季叶片直接再生体系的优化18 1 材料与方法l8 1 1 实验材料18 1 2 培养条件和基本培养基18 1 3 实验方法19 1 3 1 外植体消毒1 9 1 3 2 暗培养时间对月季品种萨蔓莎植株再生的影响1 9 1 3 3 基因型与T D Z 和N A A 不同浓度组合对月季植株再生的影响1 9 华中农业大学2 0 1 0 届硕士研究生学位论文 1 4 数据统计与分析2 0 2 结果与分析2 0 2 1 暗培养时间对月季品种萨蔓莎植株再生的影响分析2 0 2 2 基因型与T D Z 和N A A 不同浓度组合对月季植株再生的影响分析2 1 3讨论2 3 3 1 暗培养时间对月季植株再生的影响2 3 3 2 基因型对月季植株再生的影响2 4 3 3 植物生长调节剂对月季植株再生的影响2 4 三章月季体细胞胚发生途径再生体系的建立2 5 1 材料与方法2 5 1 1 实验材料2 5 1 2 培养条件和基本培养基2 7 1 3 实验方法2 7 1 3 1 外植体消毒。2 7 1 3 2 基因型与不同浓度2 ，4 D 对月季体细胞胚发生的影响2 7 1 3 3 基因型与2 ，4 D 和B A 不同浓度组合对月季体细胞胚发生的影响2 7 1 3 4 培养条件对月季萨蔓莎体细胞胚生长的影响。2 8 1 3 4 1 光照条件对月季萨蔓莎体细胞胚生长的影响2 8 1 3 4 2 碳源对月季萨蔓莎体细胞胚生长的影响2 8 1 3 4 3 外源激素对月季萨蔓莎体细胞胚生长的影响2 8 1 3 5 体细胞胚的萌发和植株再生2 8 1 3 5 1 月季萨蔓莎体细胞胚的萌发和植株再生2 8 1 3 5 2 月季紫雾及藤本月季体细胞胚的萌发和植株再生2 8 1 4 数据统计与分析3 0 2 结果与分析3 0 2 1 基因型与不同浓度2 ，4 D 对月季体细胞胚发生的影响3 0 2 2 基因型与2 ，4 D 和B A 不同浓度组合对月季体细胞胚发生的影响3 0 2 3 培养条件对月季萨蔓莎体细胞胚生长的影响3 2 2 3 1 光照条件对月季萨蔓莎体细胞胚生长的影响3 2 月季不同途径再生体系的建立与优化及遗传转化的研究 2 3 2 碳源对月季萨蔓莎体细胞胚生长的影响3 2 2 3 3 外源激素对月季萨蔓莎体细胞胚生长的影响3 2 2 4 体细胞胚的萌发和植株再生。3 4 2 4 1 月季萨蔓莎体细胞胚的萌发和植株再生3 4 2 4 2 月季紫雾及藤本月季体细胞胚的萌发和植株再生3 6 3 讨论3 8 3 1 基因型和外植体类型对体细胞胚诱导的影响3 8 3 2 植物生长调节剂对体细胞胚诱导的影响3 9 3 - 3 体细胞胚的增殖4 0 3 4 基因型和外植体类型对体细胞胚萌发和植株再生的影响。4 1 3 5 植物生长调节剂对体细胞胚萌发和植株再生的影响。4 1 第四章月季遗传转化的研究4 3 l 材料与方法4 3 1 1 实验材料。4 3 1 1 1 转化受体材料4 3 1 1 2 供试农杆菌菌株和质粒4 3 1 1 3 根癌农杆菌的培养4 4 1 1 3 1 农杆菌菌株的活化4 4 1 1 3 2 农杆菌菌株的保存4 4 1 1 4 主要生化试剂4 4 1 1 5G 嬲染色液配方4 4 1 2 转化实验所用培养基配方4 4 1 2 1L B 培养基配方4 4 1 2 2A B 液体培养基配方4 4 1 2 3 月季转化实验中植物组织培养基配方4 5 1 3 农杆菌介导的遗传转化方法4 5 1 3 1 农杆菌侵染液的制备4 5 1 3 2 以月季萨蔓莎叶片为受体的遗传转化4 6 1 3 2 1 受体的侵染和共培养。4 6 I 华中农业大学2 0 1 0 届硕士研究生学位论文 1 3 2 2 脱菌及选择培养4 6 1 3 3 以月季紫雾体细胞胚为受体的遗传转化4 6 1 3 3 1 月季紫雾体细胞胚对K m 的敏感性分析4 6 1 3 3 2 月季紫雾体细胞胚对C e f 的敏感性分析4 6 1 3 3 3 侵染时间对转化效率的影响4 6 1 3 3 4 共培养时间对转化效率的影响4 7 1 4G U S 基因瞬间表达的检测4 7 1 5 数据统计与分析4 7 2 结果与分析4 7 2 1 以月季萨蔓莎叶片为受体的遗传转化4 7 2 2 以月季紫雾体细胞胚为受体的遗传转化4 8 2 2 1 月季紫雾体细胞胚对K m 的敏感性分析4 8 2 2 2 月季紫雾体细胞胚对C e f 的敏感性分析4 9 2 2 3 侵染时间对转化效率的影响4 9 2 2 4 共培养时间对转化效率的影响5 0 3 讨论51 3 1 农杆菌介导法进行月季遗传转化的影响因素5 1 3 2 月季不同的转化受体系统比较5 3 参考文献5 4 致谢6 5 I v 月季不同途径再生体系的建立与优化及遗传转化的研究 月季不同途径再生体系的建立与优化及遗传转化的研究 摘要 月季( R o s ah y b r i d a ) 是蔷薇科( R o s a c e a e ) 蔷薇属( R o s a ) 多年生常绿木本植 物。因其花色艳丽，花朵优美，芳香，被誉为中国传统十大名花之，具有很高的 观赏价值和商业价值。但月季的花朵瓶插寿命比较短，植株易患白粉病、黑斑病， 这些都影响了它的观赏价值和经济价值。植物基因工程技术可以克服传统育种方法 的局限性。高效而稳定的植株再生体系是植物遗传转化获得成功的重要前提条件。 本实验对月季叶片直接再生体系进行了优化，并以不同月季品种的叶片和未成熟合 子胚为外植体，建立了月季体细胞胚发生途径再生体系。同时利用叶片直接再生系 统和体细胞胚发生再生系统两种再生体系进行月季遗传转化的研究。其主要的研究 结果如下： 1 月季叶片直接再生体系的优化 以月季萨蔓莎、伊丽莎白、黑夫人的小叶片为外植体，对月季不 定芽的诱导和植株再生进行了优化研究。研究结果表明：3 个月季品种的小叶片在诱 导培养基1 2 M S + 1 0 m g LT D Z + 0 0 5 m g LN A A + 10 0 m g LC H + 10 m g LA g N 0 3 + 3 G l u c o s e + 0 2 5 G E L 黑暗培养l O d 后转入光照条件下培养，在诱导培养基上培养2 0 d 后，将不定芽转入到扩繁培养基M S + 0 5 m g LB A + O 0 0 4 m g LN A A + 0 1 m g LG A 3 + 3 S u c r o s e + 7 5 9 L A g a r 继续培养，其不定芽诱导率和植株再生率都达到了最高。不定芽 诱导率萨蔓莎最高为8 5 0 4 ，伊丽莎白最高为9 5 3 0 ，黑夫人最高为 8 1 7 0 ；其植株再生率萨蔓莎最高为6 0 0 9 ，伊丽莎白最高为6 4 4 9 ，黑 夫人最高为5 5 3 3 。 2 月季体细胞胚发生途径再生体系的建立 以不同月季品种的小叶片和未成熟合子胚为外植体，对影响体细胞胚诱导、增 殖及植株再生等条件进行了研究。研究结果表明：基因型、外植体类型、植物生长 调节剂和培养条件对体细胞胚诱导和植株再生都产生着重要影响。以叶片为外植体 进行体细胞胚诱导时，只有月季萨蔓莎的小叶片有体细胞胚发生；以未成熟合 子胚为外植体进行体细胞胚诱导时，获得体细胞胚的月季品种有紫雾、小黄花 3 不同受体的月季遗传转化的研究 以月季萨蔓莎小叶片作为农杆菌介导遗传转化的受体，利用上述优化了的 叶片直接再生体系，进行了遗传转化的研究。在选择诱导培养基1 2 M S + 1 O m g I L T D Z + O 0 5 m g LN A A + I O O m g LC H + 1 0 m g LA g N 0 3 + 3 0 0 m g LC e f + 2 5 m g LK m + 3 G l u c o s e + 0 2 5 G E L 上虽然获得了少数不定芽，但不定芽在继续培养中死亡，未得 到再生的植株。以月季紫雾体细胞胚作为农杆菌介导遗传转化的受体，通过对 共培养后G U S 基因瞬间表达率的分析，对其遗传转化进行了初步研究，其研究结 果表明：侵染4 0 m i n ，共培养3 d ，7 5 m g LK m 和3 0 0 m e f f LC e f 的条件下遗传转化效 果最好。 关键词：月季；叶片；未成熟合子胚；直接再生；体细胞胚发生；遗传转化 2 月季不同途径再生体系的建立与优化及遗传转化的研究 D i f f e r e n tw a y st oe s t a b l i s ha n do p t i m i z er e g e n e r a t i o ns y s t e m a n ds t u d i e so ng e n e t i ct r a n s f o r m a t i o ni nR o s ah y b r i d a A b s t r a c t R o s e s ( R o s ah y b r i d a ) ，谢t hb r i g h tc o l o r s ，b e a u t i f u lf l o w e r sa n df r a g r a n t ，k n o w na s o n eo fC h i n e s et e nf a m o u sa n dt r a d i t i o n a lf l o w e r s ，i sap e r e n n i a la n de v e r g r e e nw o o d y p l a n ti nt h eR o s a c e a ef a m i l y , S Oi th a sh i g ho r n a m e n t a la n dc o m m e r c i a lv a l u e H o w e v e r ， t h ev a s el i f eo f r o s ef l o w e ri ss h o r t ，a n dt h ep l a n t sa r es u s c e p t i b l et op o w d e r ym i l d e wa n d b l a c ks p o t ，w h i c ha l la f f e c ti t so r n a m e n t a la n de c o n o m i cv a l u e P l a n tg e n e t i ce n g i n e e r i n g t e c h n o l o g yC a no v e r c o m et h el i m i t a t i o n so ft r a d i t i o n a lb r e e d i n gm e t h o d s E f f i c i e n ta n d s t a b l e p l a n tr e g e n e r a t i o ns y s t e m i sa n i m p o r t a n tp r e r e q u i s i t e f o rp l a n tg e n e t i c t r a n s f o r m a t i o n I nt h i ss t u d y , d i r e c to r g a n o g e n e s i ss y s t e mo fR h y b r i d aw a se n h a n c e d B e s i d e s ，u s i n gl e a f l e t sa n di m m a t u r ez y g o t i ce m b r y o so fd i f f e r e n t c u l t i v a r so fR h y b r i d a a s e x p l a n t s ，ar e g e n e r a t i o ns y s t e m v i as o m a t i ce m b r y o g e n e s i sW a se s t a b l i s h e d M e a n w h i l e ，d i r e c to r g a n o g e n e s i ss y s t e ma n dr e g e n e r a t i o ns y s t e mv i as o m a t i c e m b r y o g e n e s i sw e r eu s e df o rt h es t u d yo fg e n e t i ct r a n s f o r m a t i o ni nR h y b r i d a T h e m a j o rr e s u l t so f t h i ss t u d yw e r ea sf o l l o w s ： I E n h a n c e m e n to fd i r e c to r g a n o g e n e s i ss y s t e mi nR h y b r i d a I m p r o v e m e n to fa d v e n t i t i o u sb u di n d u c t i o na n dp l a n tr e g e n e r a t i o nu s i n gt h el e a f l e t s o fR h y b r i d a S a m a n t h a ，E l i z a b e t h ，B l a c kL a d y a se x p l a n t sW a ss t u d i e d T h er e s u l t s s h o w e dt h a t ：w h e ne x c i s e dl e a f l e t sw e r ec u l t u r e do ni n d u c t i o nm e d i u m1 2 M S + I 0 m g L T D Z + 0 0 5 m g LN A A + 10 0 m g LC H + 10 m g LA g N 0 3 + 3 G l u c o s e + 0 2 5 G E Lf o r t e nd a y si nd a r k n e s s ，a n dt u r nt ot h el i g h t ，t o g e t h e rf o r2 0d a y s ，t h e nt r a n s f e r r e dt h e a d v e n t i t i o u sb u d so n m u l t i p l i c a t i o n m e d i u m M S + 0 5 m g L B A + 0 0 0 4 m g L N A A + O 1 m g LG A 3 + 3 S u c r o s e + 7 5 9 LA g a r , t h ef r e q u e n c yo fa d v e n t i t i o u sb u d s i n d u c t i o na n dp l a n tr e g e n e r a t i o na l lr e a c h e dt h eh i g h e s t T h eh i g h e s tr a t eo fa d v e n t i t i o u s b u d si n d u c t i o no f S a m a n t h a ，E l i z a b e t h a n d B l a c kL a d y W a s8 5 0 4 ，9 5 3 0 a n d 3 华中农业大学2 0 1 0 届硕士研究生学位论文 81 7 0 ，r e s p e c t i v e l y , a n dt h e h i g h e s tr a t e o fp l a n tr e g e n e r a t i o no f S a m a n t h a ， E l i z a b e t h a n d B l a c kL a d y w a s6 0 0 9 ，6 4 4 9 a n d5 5 3 3 2 Ar e g e n e r a t i o ns y s t e mv i as o m a t i ce m b r y o g e n e s i sw a se s t a b l i s h e df o rR h y b r i d a U s i n gt h el e a f l e t sa n di m m a t u r ez y g o t i ce m b r y o so f d i f f e r e n tc u l t i v a r so fR h y b r i d a a se x p l a n t s ，t h ef a c t o r sa f f e c t i n gs o m a t i ce m b r y o g e n e s i s ，p r o l i f e r a t i o na n dp l a n t r e g e n e r a t i o nw e r es t u d i e d T h er e s u l t ss h o w e dt h a t ：g e n o t y p e ，e x p l a n tt y p e ，p l a n tg r o w t h r e g u l a t o r sa n dc u l t i v a t i o nc o n d i t i o n sa l lp l a y e di m p o r t a n t r o l e si ns o m a t i ce m b r y o g e n e s i s a n dp l a n tr e g e n e r a t i o n U s i n gt h el e a f l e t sa se x p l a n t s ，s o m a t i ce m b r y o g e n e s i so n l yw a s o b s e r v e di nR h y b r i d a S a m a n t h a ；U s i n gt h ei m m a t u r ez y g o t i ce m b r y o sa se x p l a n t s ， s o m a t i ce m b r y o g e n e s i sW a so b s e r v e di nR h y b r i d a P u r p l eH a z e ，S m a l ly e l l o w f l o w e r s a n dC l i m b i n gr o s e T h ef r e q u e n c yo fs o m a t i ce m b r y o g e n e s i sh a ds i g n i f i c a n t d i f f e r e n c e s W h e nc u l t u r e do nt h em e d i u mM S + 3 0 m g L2 ，4 - D + 3 G l u c o s e + 0 2 5 G E L ，l e a f l e t so f S a m a n t h a s h o w e dt h eh i g h e s ti n d u c t i o nr a t eo f7 5 ，i m m a t u r e z y g o t i ce m b r y o so f P u r p l eH a z e c u l t u r e do nt h em e d i u m1 2 M S + 2 0 m g L2 ，4 - D + 3 G l u c o s e + 0 2 5 G E Ls h o w e dt h eh i g h e s tr a t eo f1 1 1 1 ，t h eh i g h e s tr a t eo f 2 7 4 1 f o r C l i m b i n gr o s ew a so b t a i n e do nt h em e d i u m1 2 M S + 2 0 m g L2 ，4 - D + 1 0 m g LB A + 3 G l u c o s e + 0 2 5 G E L T h eh i g h e s tf r e q u e n c yo fg e r m i n a t i o no fs o m a t i ce m b r y o si nR h y b r i d a S a m a n t h a ，P u r p l eH a z e a n dC l i m b i n gr o s ew a s3 6 3 8 ，8 6 6 7 a n d5 3 1 4 ， r e s p e c t i v e l y T h eh i g h e s tf r e q u e n c yo fp l a n tr e g e n e r a t i o np e rs o m a t i ce m b r y oi nR h y b r i d a S a m a n t h a ，P u r p l eH a z e a n dC l i m b i n gr o s ew a s5 6 2 4 ，9 8 8 8 a n d4 7 6 4 ， r e s p e c t i v e l y D u r i n g t h ep r o c e s s e so fg e r m i n a t i o no fs o m a t i ce m b r y o sa n dp l a n t r e g e n e r a t i o n , g e r m i n a t i o no fs o m a t i ce m b r y o si n S a m a n t h a o n l y s h o w e ds h o o t s ， g e n e r a t e dw e a kr o o t so rn or o o t s ，w h i c hn e e d e dr o o t i n g H o w e v e r , P u r p l eH a z e a n d C l i m b i n gr o s ep r o d u c e dr o o t sa n ds h o o t ss i m u l t a n e o u s l y ，t h e ng e n e r a t e dc o m p l e t e p l a n t l e t s 3 S t u d i e so fg e n e t i ct r a n s f o r m a t i o ni nR h y b r i d a 丽t hd i f f e r e n tw a y s B a s e do nt h ee n h a n c e dd i r e c to r g a n o g e n e s i ss y s t e m , s o m et r a n s g e n i cb u d sw e r e o b s e r v e db yA g r o b a c t e r i u m m e d i a t e dt r a n s f o r m a t i o no fl e a f l e t su s i n gG U S a sas c o r a b l e m a r k e ro nt h e s e l e c t i o na n di n d u c t i o nm e d i u m1 2 M S + I 0 m g LT D Z + 0 0 5 m g L 4 月季不同途径再生体系的建立与优化及遗传转化的研究 N A A + 1 0 0 m g LC H + lO m g LA g N 0 3 + 3 0 0 m g LC e f + 2 5 m g LK i n + 3 G l u c o s e + 0 2 5 G E L ，h o w e v e r ，t h e s eb u d sd i dn o tr e g e n e r a t ei n t op l a n t l e t s U s i n gs o m a t i ce m b r y o so f P u r p l e H a z e 嬲i n o c u l a t i o nm a t e r i a l ，a nA g r o b a c t e r i u m m e d i a t e dt r a n s f o r m a t i o n p r o t o c o lW a Ss t u d i e df o rR h y b r i d ab ya S s e s s i n gt h et r a n s i e n te x p r e s s i o no fG U Sg e n e T h er e s u l t ss h o w e dt h a t ：i n f e c t e df o r4 0m i n , C O - c u l t u r e df o r3 d ，s u p p l e m e n t e d 诵t h 7 5 m g LK m a n d3 0 0 m g LC e fw e r eo p t i m a lf o rt r a n s g e n i cs y s t e m K 呵w o r d s ：R o s e ( R o s ah y b r i d a ) ；L e a f l e te x p l a n t s ；I m m a t u r ez y g o t i ce m b r y o s ；D i r e c t o r g a n o g e n e s i s ；S o m a t i ce m b r y o g e n e s i s ；G e n e t i ct r a n s f o r m a t i o n 5 华中农业大学2 0 1 0 届硕士研究生学位论文 缩略词表 缩略词符号英文全称中文含义 2 ，4 - D 2 ，4 - D i c h l o r o p h e n o x y a c e t i ca c i d 2 ，4 - - 氯苯氧乙酸 A B A A b s c i s i ca c i d脱落酸 A CA c t i v a t e dc h a r c o a l 活性炭 A g N 0 3 s i l v e rn i t r a t e 硝酸银 A S A c e t o s y r i n g o n e 乙酰丁香酮 B 5 G a m b o r ge ta 1 ( 1 9 6 8 ) ( m e d i u m ) B 5 培养基 B A 6 - B e n z y l a m i n o p u r i n e 6 苄基腺嘌呤 C e fC e f o t a x i m e 头孢霉素 C HC a s e i nh y d r o l y s a t e 水解酪蛋白 G G i b b e r e l l i ca c i d 赤霉素 G E L P h y t a g e l 植物凝胶 G F PG r e e nf l u o r e s c e n tp r o t e i n绿色荧光蛋白 G U S f l - g l u c u r o n i d a s e卢葡萄糖苷酸酶 i - i y gH y g r o m y c i nB 潮霉素 I B A l n d o l e 3 b u t y r i ca c i d3 吲哚丁酸 K m K a n a m y c i n 卡那霉素 L B L u r i a - B e r t a n i ( m e d i u m ) L B 培养基 L - p L - p r o l i n e L 脯氨酸 M S M u r a s h i g e & S k o o gm e d i u m M S 培养基 N A A N a p h t h a l e n e a c e t i ca c i d咖萘乙酸 P E G P o l y e t h y l e n eg l y c o l 聚Z , - - 醇 P G RP l a n tg r o w t hr e g u l a t o r 植物生长调节物质 T D ZT h i d i a z u r o n苄基噻二唑基脲 W P M W o o d yP l a n tM e d i u m W P M 培养基 6 月季不同途径再生体系的建立与优化及遗传转化的研究 第一章文献综述 1 引言 月季( R o s ah y b r i d a ) 属于蔷薇科( R o s a c e a e ) 蔷薇属( R o s a ) 多年生常绿木本 植物：月季栽培历史悠久，被世界各国广泛种植，是非常重要的观赏花卉且具有重 要的商业价值，在园林绿化中起着重要的作用。月季的用途非常广泛，例如可以用 藤本月季布置长廊和拱门，用树状月季装饰主干道，将灌木月季做成绿篱，用聚花 月季点缀花坛，茶香月季可以用于展览，微型月季用来作为室内陈设，切花月季可 以应用于各种场所。此外，月季还可以做成香料，其花朵或花瓣可以腌制成食品( 谭 文澄和戴策刚，1 9 9 7 ) 。月季因其姿态优美、花色丰富艳丽，芳香浓郁、花期长、 适应性强、繁殖容易且管理方便被誉为花中皇后，是中国的传统十大名花之一，在 我国以月季作为市花的城市数目居全国之首( 张本，1 9 9 8 ) 。随着人们生活水平的 提高，人们对月季品种观赏性状的要求也越来越高，因此，月季育种是花卉育种中 最活跃的领域之一。 月季的育种目标主要集中在对花色、花形、花香、花期、株型、鲜切花寿命和 抗病性等方面。但由于月季的染色体数目和倍数的差异造成远缘杂交的困难，使得 传统的育种方法存在一定的局限性。9 0 年代兴起的转基因技术为月季品种的改良提 供了新的途径。目前月季组织培养的理论和技术已经取得了重大进展，利用基因工程 技术对月季品种进行定向改良从而培育出大量新品种势在必行。 2 植株再生的研究概述 1 9 0 2 年，德国的著名植物学家H a b e r l a n d t 提出了细胞全能性的观点：每一个具 有细胞核的植物细胞都具有发育成为完整植株的能力。3 0 年代，W h i t e 用番茄的根 通过组织培养成功地建立了首个无性繁殖系，从而证实了细胞全能性的观点。自此， 植物组织培养技术得到了广泛的研究。通过组织培养技术将离体的细胞、组织、器 官或合子胚发育成为完整的植株称为植物的再生。高效的植株再生体系是进行植物 遗传转化的基础，因此对植株再生的研究具有重要意义。植株再生可以通过植物的 器官发生途径和体细胞胚发生途径进行。 7 华中农业大学2 0 1 0 届硕士研究生学位论文 2 1 植物器官发生途径的再生研究 植物的器官发生是指在离体培养条件下，从单个细胞或多个细胞诱导出植物的 茎和根从而发育成完整植株的过程。植物的器官发生包括直接器官发生和间接器官 发生，前者指利用外植体上直接诱导不定芽而后发育成植株的过程，后者指利用外 植体先诱导愈伤，再通过愈伤分化形成不定芽从而发育成植株的过程。 不同的外植体的器官发生对激素配比的要求不同( 徐廷玉等，1 9 8 9 ) 。细胞分 裂素和生长素的比值不同，其诱导的结果也不同，比值高时有利于芽的形成，比值 低时有利于根的形成，当两者含量近似时有利于愈伤组织的诱导和分化。近年来大 多数研究表明，T D Z 对叶片不定芽的诱导起着重要的作用。在以杏的叶片为外植体 进行不定芽诱导时，T D Z 对不定芽的诱导有明显的促进作用，而B A 对不定芽诱导 有抑制作用，在添加B A 的培养基上不定芽诱导率明显下降( O l a y ae ta 1 ，2 0 0 0 ) 。 但也有研究表明B A 对不定芽的诱导有着明显的促进作用。在以酸樱桃和甜樱桃不 同品种的叶片为外植体进行不定芽诱导的研究中，在添加2 m e , LB A 的W P M 培养 基上叶片不定芽诱导率显著高于添加T D Z 的培养基( T a n ge ta 1 ，2 0 0 2 ) 。 外植体类型、基因型对其器官发生的频率影响效果也非常明显。例如，在诱导 黄瓜的直接器官发生时，其子叶节可形成大量丛生芽，而叶片和下胚轴都不能分化 出不定芽，而且品种长春密刺和龙杂黄7 号比叶三旱黄瓜和老来少发生频率要高( 侯 爱菊，2 0 0 3 ) 。因此，要建立一个高效的植株再生体系，对培养基种类和成分、外 植体和培养条件的选择都至关重要( 谭文澄和戴策刚，1 9 9 7 ) 。 2 2 植物体细胞胚发生途径的再生研究 植物体细胞胚发生( s o m a t i ce m b r y o g e n e s i s ) ，主要是指在离体培养条件下，单 倍的或者双倍的体细胞未经过配子融合而是通过与合子胚发生类似的途径发育成 为新个体的形态发生过程( T a c t i c s ，1 9 7 8 ；W i l l i a m sa n dM a h e s w a r a r t , 1 9 8 6 ) 。因为它 来源于体细胞，所以被称为体细胞胚或胚状体。R e i n e r t ( 1 9 5 8 ) 和S t e w a r d ( 1 9 5 8 ) 分别从胡萝卜的愈伤组织和胡萝卜的悬浮细胞系中成功获得了体细胞胚，并通过此 途径再生成为了完整的植株。这一重大的突破使得植物细胞的全能性得到证实，从 而为植物通过离体培养再生植株开辟了新的纪元。随后，许多学者在这一新的领域 进行研究并取得了大量的成果。目前已经2 0 0 多种植物获得了体细胞胚( 贾彩凤等， 8 月季不同途径再生体系的建立与优化及遗传转化的研究 2 0 0 4 ) 。 近年来，有关植物体细胞胚发生的研究成果不断被报道。对影响体细胞胚发生 的因素的研究已经成为当前植物生物技术的一个研究热点。建立高频的体细胞胚发 生体系具有重要的意义。利用胚性细胞系可以进行种质保存，进行突变体的诱导和 筛选，同时也是进行植物遗传转化的重要受体材料。 2 2 1 植物体细胞胚发生的方式和特点 体