REACH法规-第五卷译稿-3.doc

C.2. 水蚤急性中毒1. 方法1.1. 引言本测试方法用于导致淡水水蚤 静止的化学物质的中级有效浓度（EC50）的测定。因此有必要尽可能掌握这些物质的水溶性、蒸汽压、化学稳定性、溶解常数和生物降解率等数据。在设计测定方法和分析结果时还应考虑到其它信息（例如结构式，纯度，主要杂质的种类和百分比，添加物的存在和数量和正辛醇/水分配系数）。1.2. 定义和单位水蚤的LC50的浓度的直接测定是通过如实验方法所述的EC50的测定来实现的。本实验中的（导致水蚤）急性中毒的毒性是指导致（水蚤）静止的中级有效浓度（EC50），这个浓度按照原始数据值，表示在给定时间内接触该浓度的物质导致50数量的测定水蚤静止。静止：动物在轻轻敲打实验容器后15秒内仍不能游动被认为已经处于静止状态。所有测定物质的浓度用重量体积比表示（mg/L）。也可以用重量比（mg/kg）表示。1.3. 参考物质可以作为测定的参考物质指的是在实验室测定条件下，测定物的响应信号没有显著变化的物质。用四种不同物质作EEC环形实验的结果总结在附录2中。1.4. 测定方法原理极限测试需用100毫克每升进行测定从而保证EC50值大于此测定浓度。将水蚤48小时置于一系列含有不同浓度的被测物质的水中，如做时间较短的实验，在实验报告中要指明修改部分。除非在其他特定的实验条件下，以及足够的一系列不同的被测物质浓度，被测物质的不同浓度会对水蚤的游动能力造成不同平均程度的影响。在实验最后，不同的浓度会造成不同百分比的水蚤不再游动。导致0%或者100%水蚤静止的浓度直接来自实验的观察结果，而48小时的EC50值来自可能的计算。这个实验使用一种统计系统，所以实验方法在水蚤与被测物质的接触过程中不能更新。1.5. 定量标准定量标准适用于极限测试和整个测定方法和过程。实验最后，对照实验的静止程度不能超过10%。对照实验下的水蚤，不能被困在水面表层。在整个实验过程中，实验容器中的溶解氧浓度必须始终保持在3mg/L以上，而且无论如何不能让溶解氧浓度低于3mg/L。在整个实验持续过程中，被测物质的浓度必须保持在原浓度的80%以内。对于那些易溶于测试介质的物质，溶解后形成稳定的溶液而且不发生显著的挥发、降解、水解或吸收的，可认为起始溶液浓度为标定浓度值。要有证据能表明测定过程中浓度保持稳定并符合定量标准。对于以下物质：(i) 在测定介质中溶解性差，或(ii) 能形成稳定的乳状液或悬浊液的，或(iii) 在水溶液中不稳定的，起始浓度应在测定开始时在溶液中进行测定（或者，若技术条件不允许，应在水柱中测量）。浓度测定应溶解平衡一段时间后进行，但应在加入被测有机体之前。在这些情况下，在测试中应采取进一步措施确定接触物质的实际浓度，满足定量标准。pH值变化不应超过一个单位。1.6. 测定方法概述1.6.1 试剂1.6.1.1 被测物质溶液一定离子强度的储备液用去离子水或符合1.6.1.2标准水溶解测定物配制。测定所需浓度的溶液用储备液稀释配制，如果测定的是高浓度的，可直接将物质溶于水。通常测定的物质浓度取决其溶解度。对一些物质（其水溶解度低或有高Pow值或形成的溶液实际为稳定的分散液的），可以不受其溶解度所限进行测定，从而保证获得其最大的可溶/稳定浓度数据。需要注意的是，该浓度下测定系统不被破坏。超声波分散，有机溶剂，乳化剂或分散剂可辅助用于一些水溶性差的物质储备液的配制，或有助于物质在介质中的分散。当使用这些辅助物质时，测定浓度应包括相同数量的辅助物质，同时对照组中测定水蚤也应使用相同数量的辅助物质。辅助物质的浓度应尽可能低，任何情况下不得大于100毫克每毫升。测定过程中pH 值不应改变。如果有显著证据表明pH值发生了变化，建议调整pH值重新进行测定并报道结果。在这种情况下，除非有特殊原因储备液的pH值应调整至稀释水的pH值。最好用HCL和NaOH调节pH值。pH值调节过程中，储备液中被测物的浓度不应发生显著变化。如果调节过程中，测定化合物发生化学反应或物理沉淀现象应予以记录。1.6.1.2.实验用水本实验使用再造水（ 参照附录1和参考（2）：ISO 6341 ）。为避免在实验前有适应的需要，推荐使用与实验用水有相同质量（pH，硬度）的培养水。1.6.2.仪器应使用标准的实验仪器及用具。与实验溶液接触的仪器最好完全是玻璃制的。测氧计（有微电极或其他用于测量小体积样品中溶解氧的合适仪器），足够的温度控制仪器，pH计，测量水硬度的仪器。1.6.3. 测定用有机体magna水蚤是很好的测试种类，尽管puLex水蚤也可用于测试。被测动物在实验开始时必须有少于24小时的寿命，是实验室培养的，没有明显疾病，以及有明确历史记录（如培养，以及任何预先处理等）。1.6.4. 测定步骤测距技术用于确定整个测定过程中测定浓度的范围。进行没有待测物质的对照组实验，如果有必要，还应进行含有辅助物质的对照组实验。水蚤与化学物质接触如下：持续时间：24小时；动物数量：至少20个每一测试浓度，最好分为4批每批5个或2批每批10个；载量：每个动物至少提供2mL测试溶液；测定浓度：测试溶液必须在加入水蚤前即时配制，最好不用除了水以外的其他溶剂，浓度在不超过浓度比2.2的情况下构成一几何系列。有足够的不同浓度在48小时后得到0和100%的静止以及一系列中间程度的静止状态，以便和对照实验一起计算48小时EC50值；水：见1.6.1.2；光：任意的亮-暗循环；温度：实验温度必须在18至22之间，但在任何测定中温度变化不超过1；通风：测试溶液不能用气泡通风；喂食：不需要。对照测试与所有的测试浓度的pH值以及含氧量都要在实验最后测定。测试溶液的pH值不能改变。易挥发物质必须在完全密封的容器中进行实验，容器要足够大以防止缺氧。至少24小时后观察一次水蚤，48小时后再观察一次。极限测试本测定方法描述的步骤中，极限测试用100毫克每升进行测定从而保证EC50值大于此测定浓度。如果测定物质的性质决定了100毫克每升的测定浓度无法达到，那么极限测试应用与测定物质的在介质中溶解度一致的浓度值进行（或者是形成稳定分散液的最大浓度值）（还可见1.6.1.1）。极限测试必须使用20个水蚤，分成两批或四批，与对照实验一样。如果静止状态出现，则进行完整的分析。2. 结果和评估每一观察记录的时间段（24和48小时），在对数概率纸以静止率百分数对浓度作图。如有可能，对每一观察时间段，EC50值和置信界限（p0.05）应用标准步骤估算；这些数值应四舍五入为一位或最多两位有效数字（以两位有效数字为例：173.5四舍五入为170；0.127四舍五入为0.13；1.21四舍五入为1.2）。对于那些浓度/百分比曲线斜率过大不利于计算EC50值的情况，对图表EC50值的估算十分有效。如果两个相差2.2个单位的浓度值分别对应0和100的静止率，那么EC50值必然落在这两个浓度值区间内。如果观察到测定物质无法保持稳定或均匀性，那么要报道结果并注意对结果进行处理转化。3. 结果报告如有可能，结果报告应包含以下内容： 测试有机体信息（学名，品系，供应商或种类，任何预处理，培养方法-包括来源，种类，喂食数量以及喂食频率）； 稀释水的来源，主要化学物性质（如pH 值，硬度，温度）； 如果测定物水溶性差，配制储备液和测定液的方法过程； 任何辅助物质的浓度； 测定浓度列表，以及该浓度下测定液中测定物的稳定性等方面信息； 使用任何化学分析手段的方法步骤和结果报告； 如果进行了极限测定，报告结果； 测定仪器的描述； 光照制度； 测试液的溶解氧浓度，pH 值和温度； 有证据表明测定方法符合定量标准； 用表格表示每一浓度下累积的静止率值以及建议观察的每一时间段（24和48小时）对照组实验结果（如需要使用辅助物质也要报告）； 测定结束后的浓度/百分数相应曲线的图表； 如有可能，对建议观察的每一时间段，报告EC50值（置信度为95%）； 测定EC50值的统计步骤描述； 如使用参考物质，报告其结果； 在测定过程中未引起静止的最大测定浓度； 在测定过程中引起100静止率的最小测定浓度；4. 参考文献1) OECD, Paris, 1981, Test Guidelines 202, Decision of the Council C(81) 30 final andupdates.2) International Standard ISO, Water QuaLity -Determination of inhibition ofmobilityof Daphnia magna Straus, ISO 6341-19893) AFNOR Inhibition of mobility of Daphnia magna Straus (Cladocera -crustacea) NFT 90301 (January 1983).4) Verfahrensvorschlag des Umweltbundesamtes zum akuten DapHnien-Test. Rudolph,P. und Boje, R. kotoxikoLogie, GrundLagen fur die kotoxikoLogische Bewertung von Umweltchemikalien nach dem Chemikaliengesetz, ecomed 1986.5) DIN Testverfahren mit Wasserorganismen 38412 (L1) und (LLL).6) Finney, D.J. Statistical Methods in Biological Assay. Griffin, Weycombe, U.K.,1978.7) Litchfield, J .T .and Wilcoxon, F. A simplified method of evaluating dose-effect experiments. J. Pharmacol. and Exper. Ther., 1949, vol. 96, 99-113.8) Sprague, J.B. Measurement of pollutant toxicity to fish. I Bioassay methods for acutetoxicity. Water Res., 1969, vol. 3,793-821.9) Sprague, J.B. Measurement of pollutant toxicity to fish. II Utilising and applying bioassay results. Water Res. 1970, vol. 4, 3-32.10) StepHan, C.E. Methods for calculating an LC50. In Aquatic Toxicology and Hazard EvaLuation (edited by F.I. Mayer and J.L. Hamelink). American Society for Testing and Materials. ASTM, 1977, STP 634, 65-84.11) StepHan, C.E., Busch, K.A., Smith, R., Burke, J. and Andrews, R.W. A computer program for calculating an LC50. US EPA.附录 1: 再造水合适的稀释水（根据ISO 6341）所有化学物质都是分析纯。分析用水都是优质的蒸馏水或者是电导率小于5Scm-1的水。蒸馏仪器不得含有任何铜制造的部件。储存液CaC12.2 H2O (二水氯化钙):溶于水中，配至1升11.76 gMgSO4.7H2O (七水硫酸镁):溶于水中，配至1升4.93 gNaHCO3 (碳酸氢钠):溶于水中，配至1升2.59 gKCI (氯化钾):溶于水中，配至1升0.23 g再造稀释水混合四种储备液各25毫升，配至1升。往溶液中通气，使氧浓度与空气中的饱和浓度相同。pH必须是7.80.2。如果需要，用NaOH（氢氧化钠）或者HCL（盐酸）调节pH值。准备好的稀释水放置12小时，不需要另外通气。溶液中Ca和Mg离子浓度和是2.5毫摩尔每升，C