红叶芥花青素合成途径结构基因的克隆及表达分析-硕士论文

西南大学 硕士学位论文 红叶芥花青素合成途径结构基因的克隆及表达分析 姓名：孙梓健 申请学位级别：硕士 专业：蔬菜学 指导教师：宋明;汤青林 20100501 摘要 红叶芥花青素合成途径结构基因的克隆及 表达分析 蔬菜学专业硕士研究生孙梓健 指导教师宋明教授 汤青林副研究员 摘要 红叶根用芥( B r a s s i c a j u n c e av a t n 印咖t r o i s ) ，以下简称红叶芥，是芸薹属芥菜种中的一 类蔬菜作物，其肉质根主要做腌渍用，国内栽培面积广，具有重要的经济价值。叶色独特的 红叶芥是根用芥菜中较为独特的品种，其叶片从子叶展开一直呈现出由花青素积累而形成的 紫红色。近年来，随着对合成色素安全性的研究，很多对人体具有安全隐患的合成色素已不 再使用，因此，花青素作为一种安全的天然色素备受关注。类黄酮类化合物是植物次生代谢 的重要产物，大多数植物叶色和花色的呈现都是因为这类化合物的生成而产生。花青素是植 物体内主要的类黄酮类水溶性色素，在模式植物中其生物合成途径的研究已经较为详细，在 模式植物中该途径大多数结构基因和一部分调控基因均已分离。但红叶芥中花青素的分子调 控机理研究还没有报道，因此对红叶芥花青素生物合成途径中结构基因的克隆与表达对于阐 明红叶芥叶色形成机理、利用基因工程进行新品种选育和天然色素的开发利用具有重要的意 义。 本研究以红叶芥叶片为材料，根据花青素生物合成途径中结构基因保守序列设计特异引 物和简并引物，克隆得到P A L 、C H S 、C H I , D F R 、F 3 胃和A N S 等六个结构基因片段，利用 实时荧光定量R T - P C R 检测了在环境胁迫下红叶芥叶片花青素合成结构基因的转录表达情况 以及不同叶色根用芥菜中花青素合成结构基因的转录表达情况。主要研究结果如下： 1 、花青素生物合成途径结构基因的克隆 根据已经发布的芥菜花青素合成途径结构基因保守序列设计了特异引物或简并引物，从 红叶芥叶片e D N A 中克隆得到了两个基因的全长c D N A ：C H I 基因( G e n b a n k A c c e s i o n ：G U 2 3 0 1 5 7 ，包含一个7 5 9 b p 的开放阅读框) 和D F R 基因( 开放阅读框长度为1 2 0 6 b p ) ； 利用特异引物克隆得到了P A L ( G e n b a n kA c c e s i o n ：G Q 5 0 5 0 6 5 ) 、C H S ( G e n b a n kA c c e s i o n ： G U 2 3 0 1 5 8 ) 、F 3 H 和A N S ( G e n b a n k A c c e s i o n ：G U 2 3 0 1 6 0 ) 基因的部分c D N A 保守序列。序 列分析表明六个结构基因与其他植物的花青素生物合成途径结构基因具有较高的同源性。系 统进化分析表明6 个结构基因的系统进化符合植物分类学的分类。 2 、环境胁迫下C H I 、D F R 和A N S 基因的表达分析 两南大学硕+ 学何论文 利用荧光定量R T - P C R 方法分析了C H I 、D F R 和A N S 基因在环境胁迫下( 模拟干旱、低 温和光照胁迫) 红叶芥叶片中的表达情况。结果表明：D F R 和A N S 基因在经过环境胁迫处理 后表达量显著增加，而C H I 基因经过处理后表达量保持在一个较低的水平。C H I 基因虽然表 达量极低，但在不同胁迫下都有微量表达。其中低温和光照胁迫下，D F R 和A N S 基因在处理 1 2 小时后表达量开始上升，C H I 基因表达量始终较低并无明显变化；低温胁迫下D F R 和A N S 基因在处理4 8 小时后达到最大值，光照胁迫下在处理后9 6 小时达到最大值；模拟干旱胁迫 下，D F R 和A N S 基因表达量均高于C H I 基因，但三者表达量都较低。 3 、根用芥菜C H S 、F 3H 、D F R 和A N S 基因的表达分析 利用荧光定量R T - P C R 方法分析了C H S 、F 3 似D F R 和A N S 基因在不同叶色根用芥菜 中的转录表达情况。结果显示C H S 、D F R 和A N S 等结构基因的表达在不同叶色根用芥菜中 花青素的积累有密切关系。在红叶芥和绿叶芥中C H S 、D F R 和A N S 基因在第四片真叶表达 量最高，F 3 W 基因在两者间差异不大；花青素含量在红叶芥第七片真叶最高，绿叶芥中花青 素含量很低且叶片间差异不大。C H S 、D F R 和A N S 基因在红叶芥叶片中的表达量均高于绿叶 芥叶片。 关键词：红叶芥花青素结构基因基因克隆表达分析 A b s t r a c t C l o n i n ga n dE X lA n a l 3 o f n t h o c 0 l - - )lonInt：anx o r e s s l o nA n a l y s l s A n t t m c y a n l n B i o s y n t h e s i s G e n e si nR e dL e a fM u s t a r d M S C a n d i d a t e ：S u nZ i J i a n S u p e r v i s o r ：P r o f S o n gM i n g A s s o c i a t eR e s e a r c h e rT a n gQ i n g L i n A B S T R A C T R o o tm u s t a r di sat y p eo fp i c k l e dm u s t a r dp l a n ts t e mo r i g i n a t i n gf r o mS i c h u a n ，C h i n a I nE n g l i s h , i ti sc o m m o n l yk n o w na sS i c h u a nv e g e t a b l eo rC h i n e s ep i c k l e dv e g e t a b l e ，i n c l u d i n gt h es e v e r a l o t h e rt y p e si nt h eS i c h u a np r o v i n c ei t s e l f , t h ep i c k l ei sm a d ef r o mt h ef i s t - s i z er o o to fB r a s s i c a j u n c e a R e d l e a fm u s t a r di sau n i q u ec u l t i v a ro ft h er o o tm u s t a r d ，w h i c hh a sas t u n n i n gp u r p l el e a f c o l o rc a u s e db yt h ea c c u m u l a t i o no fa n t h o c y a n i n si nl e a v e s I nr e c e n ty e a r s ，w i t ht h er e s e a r c ho f s y n t h e t i cp i g m e n t sa n dt h eh e a l t hc o n c e r r l s ，m a n ys y n t h e t i cp i g m e n tw a sn ol o n g e ri nU s e ，a n d h e n c et h ea n t h o c y a n i n st h a tp e o p l eg r a d u a l l ya c c e p t e da sas a f en a t u r a lp i g m e n t sh a sf o r m e dah u g e m a r k e t I np l a n t s ，aw e l l - k n o w np h y s i o l o g i c a lf u n c i o no ft h ef l a v o n o i dp i g m e n t si st h er e c r u i t m e n t o fp o l i n a t o r sa n ds e e dd i s p e r s e r s ，B e s i d e sp r o v i d i n gb e a u t i f u lp i g m e n t a t i o ni nf l o w e r s ，f r u i t s ，s e e d s ， a n dl e a v e s ，f l a v o n o i d sa l s oh a v ek e yr o l e si ns i g n a l i n gb e t w e e np l a n t sa n dm i c r o b e s ，i nm a l e f e r t i l i t yo fs o m es e c i e s ，i nd e f e n s ea sa n t i m i c r o b i a la g e n t sa n df e e d i n gd e t e r r e n t s ，a n di nU V p r o t e c t i o n A so n eo ft h em o s ti m p o r t a n tw a t e r - s o l u b l ef i a v o n o i dp i g m e n t s ，a n t h o c y a n i n sa r et h e m o s tc o n s p i c u o u so n e ，i t sb i o s y n t h e s i sp a t h w a yh a sb e e ns t u d i e de x t e n s i v e l yi nm o d e lo r g a n i s m M o s ts t r u c t u r a lg e n e sa n dr e g u l a t o r yg e n e si nt h ep a t h w a yh a v eb e e ni s o l a t e d H o w e r v e r , t h e r ea r e n or e p o r t so nt h i ss u b j e c ti nr e d - l e a fm u s t a r d T h e r e f o r e ，t h ec l o n i n ga n de x p r e s s i o na n a l y s i so f s t r u c t r a lg e n e si nr e d - l e a fm u s t a r dw i l lp r o m o t ef u r t h e rs t u d i e so nn e wc u l t i v a r sb r e e d i n ga n dt h e u t i l i z a t i o no fn a r u r a lp i g m e n t s I nt h i sr e s e a r c h , c D N Ae n c o d i n gP A L ，C H S , C H I , F 3HD F Ra n dA N Sw e r ei s o l a t e db yu s i n g s p e c i f i c o rd e g e n e r a t ep d m e r sf r o mt h el e a v e so ft h er e d l e a fm u s t a r d , a n dt h e i r e x p r e s s i o n ( e x p r e s s i o nu n d e re n v i r o n m e n ts t r e s s e sa n dt h ee x p r e s s i o ni nr e d c o m m o nl e a fm u s t a r d ) W a si n v e s t i g a t e db yr e a l - t i m eq u a n t i t a t i v eR T - P C R T h em a i nr e s u l t sw e r es h o w e da sf o l l o w s ： A c c o r d i n gt ot h ec o n s e r v e dm o t i f so fc l o n e dg e n e si n v o l v e di na n t h o c y a n i ns y n t h e s i s ，s p e c i f i c p r i m e r so rd e g e n e r a t ep r i m e r sw e r eu s e dt oa m p l i f yt h es i xs t r u c t u r a lg e n e sf r o mr e d - l e a fm u s t a r d c u l t i v a r T h eC H Ig e n ea n dD F Rg e n ew e r ec l o n e db yu s i n gh o m o l o g y - b a s e dc l o n i n gs t r a t e g y , t h e c o m p l e m e n t a r yD N A o fC H Ig e n e ( G e n b a n kA c c e s i o n ：G U 2 3 015 7 ) h a sa no p e nr e a d i n gf la m eo f I I I 两南大学硕十学付论文 7 5 9 b p ，a n dt h eD F Rg e n ei s 115 7 b p ；t h ec D N Af r a g m e n t so fP A L ( G e n b a n kA c c e s i o n ：G Q 5 0 5 0 6 5 ) ， C H S ( G e n b a n kA c c e s i o n ：G U 2 3 015 8 ) ，F 3EA N S ( G e n b a n kA c c e s i o n ：G U 2 3 0 16 0 ) g e n e sw e r e o b m i n e db yu s i n gs p e c i f i c p r i m e r s S e q u e n c ea n a l y s i ss h o w e dt h a tt h e s eg e n e ss h a r e dh i g h s i m i l a r i t yw i t ht h o s ef r o mo t h e rp l a n t s T h er e s u l t so fp h y l o g e n e t i ca n a l y s i sr e v e a l e dt h a tt h e s y s e m a t i ce v o l u t i o no ft h o s es i xg e n e sw e r eu pt ot h e i rd i s t i n c te v o l u t i o n a r yp a t h w a y s T h ei m p a c to fe n v i r o n m e n t a ls t r e s su p o nr e d l e a fm u s t a r da n t h o c y a n i n sp r o d u c t i o na n dt h e e x p r e s s i o no fs t r u c t u r a lg e n e si n v o l v e di nt h e i rb i o s y n t h e s i ss u c h 签c h a l c o n ei s o m e r a s e ( C H l ) ， d i h y d r o f l a v o n o l4 - r e d u c t a s e ( D F R ) a n da n t h o c y a n i n d i ns y n t h a s e ( a N S ) W a Ss t u d i e d T h er e s u l t so f r e a l - t i m eR T - P C Ra n a l y s i ss u g g e s t e dt h a tt h ea m o u n to fa n t h o c y a n i na n dt h ee x p r e s s i o no ft h o s e s t r u c t u r a lg e n e sr e q u i r e dap e r i o do ft i m et or e a c ht h ep e a k T h ee x p r e s s i o no fD F Rg e n ea n dA N S g e n ei n d u c e db yl o w - t e m p e r a t u r ea n dl i g h t - s t r e s sl e dU St ot h ec o n c l u s i o nt h a tt h et w og e n e sa r et h e i m p o r t a n ts u b j e c tf o rc h a r a c t e r i z i n gt h em o l e c u l a rr e s p o n s e st ot e m p e r a t u r ea n dl i g h ti nt h el e a fo f r e d - l e a fm u s t a r d F u r t h e r m o r e ，t h el o w - t e m p e r a t u r ea n d l i g h t - s t r e s sm i g h ti n d u c ed i f f e r e n t r e g u l a t i o nm e c h a n i s m si nt h ea n t h o c y a n i nb i o s y n t h e s i s G e n e se n c o d i n gc h a l c o n es y n t h a s e ( C H S ) ，f l a v o n o i d3 - h y d r o x y l a s e ( F 3 仞，d i h y d r o f l a v o n o l 4 - r e d u c t a s e ( D F R ) a n da n t h o c y a n i n d i ns y n t h a s e ( a N S ) w e r ea s s a y e db yu s i n gq u a n t i t a t i v e r e a l - t i m eR r - P C R i no r d e rt ot e s tt h et r a n s c r i 【p t i o nl e v e l si nt h el e a fo fr e d - l e a fm u s t a r da n d c o m m o nr o o t - m u s t a r d 1 1 1 er e s u l ti n d i c a t e dt h a tt h ee x p r e s s i o no fs t r u c t u r a lg e n e s ( C H S , 乃E D F Ra n dA N Sg e n e s ) i nr e d l e a fm u s t a r dw a sm u c hh i g h e rt h a nt h ee x p r e s s i o ni nc o m m o n r o o t m u s t a r d ，a n dt h ee x p r e s s i o n sr e a c h e dt h eh i g h e s tl e v e li nt h ef o u r t hl e a f T h e s er e s u l t s s u g g e s t e dt h a tt h ea b s e n c eo fp i g r n e n tm a yb ec a u s e db yt h es t r u c t u r a lg e n e sd o w n - r e g u l a t e di nt h e c o m m o nr o o t m U S t a r dc u l t i v a r s K e yw o r d s ：R e d l e a fM u s t a r d ；A n t h o c y a n i n ；S t r u c t u r a lG e n e ；G e n eC l o n i n g ； E x p r e s s i o nA n a l y s i s I V 缩略词表 缩略词表 7 5 独创性声明 本人提交的学位论文是在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。 论文中引用他人已经发表或出版过的研究成果，文中已加了特别标注。对本研 究及学位论文撰写曾做出贡献的老师、朋友、同仁在文中作了明确说明并表示 衷心感谢。 学位论文作者：孙畸钍芝 签字日期：勘p 年r 月挑日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解西南大学有关保留、使用学位论文的规定， 有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被 查阅和借阅。本人授权西南大学研究生院( 筹) 可以将学位论文的全部或 部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手 段保存、汇编学位论文。 ( 保密的学位论文在解密后适用本授权书，本论文：环保密，口保密期限 至年月止) 。 学位论文作者签名：盈键 导师签名：辛心 签字日期：，o 年譬月j 噜日签字日期：如、o 年r 月 第一章文献综述 | 奠奠皇一II 置- 第一章文献综述 叶色是蔬菜的重要品质特性之一，叶片色泽的多样性直接影响到蔬菜的食用价值和经济 价值，特别是近年来随着经济的发展，人们对于高品质蔬菜的需求与日俱增，除了常见叶色 的蔬菜之外，特别是具有新奇叶色或者花色的蔬菜，具有更广阔的开发与利用前景。 植物叶片的颜色不是单一因素造成的，而是由于多种因子共同作用的结果，这种作用主 要是对叶片不同部位组织中不同色素的种类和含量进行调控。相对于对花色改变的大量研究 而言，对于叶片颜色的研究相对较少，因此，对植物叶片颜色的研究可为新品种的选育带来 新的思路，为提高蔬菜的经济价值具有重要的意义。 1 1 类黄酮化合物的生物功能及合成途径 植物的颜色主要是由于类黄酮( F l a v o n o i d s ) 、类胡萝I - 素( C a r o t e n o i d s ) 和甜菜碱素 ( B e t a l a i n s ) 的不同分布决定的，这三类色素通常是植物的次生代谢产物，存在于细胞液泡 或质体中，通过对太阳光的反射，最终呈现出不同的色彩。其中，花青素主要使植株显现出 粉红色、红色、紫红色和蓝色；类胡萝卜主要影响黄色的形成；甜菜碱素引起植物呈现黄色、 橙黄色、红色和紫色等色彩。除了这三类色素的分布引起的不同颜色，植物内部或者表面结 构等理化性状的差异也同样影响了植物颜色的形成1 1 - z 。 类黄酮类化合物作为植物呈现红色、蓝色及紫色的主要因素，近年来人们对植物的次生 代谢产物有了更多的关注和认识。从1 6 6 4 年R o b e nB o y l e 提出的影响植物色彩的酸碱理论到2 0 世纪末人们对类黄酮类物质结构及其调控基因的研究来看，大量关于类黄酮类化合物的结构、 化学活性及其生物合成的机理已被了解和掌握。类黄酮类化合物相对多样种类都具有共同的 基本结构，即从苯丙氨酸和丙二酰辅酶A ( 辅酶A 由脂肪酸合成途径提供) 衍生而来的的芳香 环，即查尔酮。查尔酮在查尔酮异构酶的作用下转化为黄烷酮，然后以黄烷酮为中线，通过 多条途径转化形成了各种类黄酮类化合物。在大多数高等植物中类黄酮类化合物主要分为查 尔酮c h a l c o n e s 、黄酮f l a v o n e s 、黄酮醇f l a v o n o l s 、黄烷酮f l a v a n d i o l s 、花青素a n t h o c y a n i n s 和缩合 单宁c o n d e n s e dt a n n i n s ( 原花色素) 六种类型；除此以外，植物非必需的橙酮a u o n a 3 也广泛 存在于植物体内。某些植物( 大部分豆科植物及少数非豆科植物) 还能合成一些特殊的类黄 酮类物质，比如异黄酮。同样在高粱S o r g h u mb 缸o l o r ，玉米Z e am a y s ，大岩桐$ i n n i n g i ac a r d i n a l i s 等植物还能合成3 脱氧花青素【5 】o 在葡萄、花生和松树中还发现合成了与类黄酮十分相似的 芪类化合物。因此，类黄酮类化合物代谢途径的多样性是由于其代谢分化的多样性或者是在 某些植物的进化过程中缺失形成的。 普遍存在于植物体内的类黄酮类物质大约有3 0 0 0 种。花青素类色素与黄酮醇辅色素的一 个重要生理功能就是吸引传粉者和种子传播者，通常利用昆虫传粉的植物花瓣大多有鲜艳的 花色，而这些色彩主要是由红紫色的花青素、黄色的橙酮和查尔酮组成，鲜艳的色彩可以吸 西南大学硕士学位论文 引昆虫促进传粉的作用：植物中的娄黄酮类化台物可吐吸收紫外线咀防止叶绿体光系统的 损坏1 7 另外。花青素类色素还可以大量吸收波长为5 3 0 h m 的光，防止叶绿体内产生过多的自 由基带来的伤害9 气类黄酮类化合物还对花粉的萌发、减轻病虫微生物的伤害具有重要的作 用”q ；除此以外，黄酮类化台物也是很多药用植物的活性成分，常见的有芦丁、攥皮紊、葛 报素等 1 2 - 1 3 l 。 ”y “：亭 * t m 围卜l 主要粪黄酮娄精质生物代谢选径 F i gl 1s c h e m a t i co ft h em a j o rb r a n c hp a t h w a y = o ff I M i db i o s y n t h e s i $ 在过去的1 5 0 年中，很多娄黄酮类化台物还推动了很多科学研究的发展深 比如孟德尔 对于豌豆种皮遗传规律的研究，M c C l i n l o c k 在玉米类黄酮生物合成基因表达的研究中发现的转 b 冒一 第一章文献综述 ! I II I 鼍曼曼量曼曼曼曼曼曼曼曼曼曼曼曼曼曼曼量曼曼曼皇量曼曼曼曼曼曼皇曼曼曼曼曼曼曼! ! ! 曼曼曼曼曼曼曼寰曼鼍曼曼皇曼曼曼皇曼曼曼曼曼! 曼! ! 曼曼曼曼曼曼 座子等。特别是在矮牵牛花色的研究中，花青素的分布方式促进了共抑制现象的深入研究。 类黄酮类色素除了在植物显色中具有重要的作用之外，在植物间信号传导、雄性育性、对病 原微生物的抵抗以及对紫外线的防护中起到了不可或缺的作用。在对类黄酮类物质的早期研 究中，苔藓中的黄酮和黄酮醇起初被认为起到化学信号分子和紫外线防护的作用。类黄酮类 化合物在动物实验中表现出对健康的潜在益处，特别是豆科食物中的异黄酮类物质还具有一 定的抗癌作用。 近年来，大量的研究工作主要集中在分子遗传水平上以阐明类黄酮生物合成途径，大量 影响类黄酮合成的突变体己通过其花和种皮颜色的变化分离得到【”J4 1 。在对玉米、金鱼草和 矮牵牛的研究中己分离得到了许多类黄酮合成途径的结构基因和调控基因，拟南芥作为模式 植物的应用更是促进了类黄酮类化合物生物合成途径调控与亚细胞结构的研究。在拟南芥类 黄酮生物合成研究中一个重要的观点认为编码类黄酮代谢的关键酶( 黄酮醇和花青素的合成) 的基因是单拷贝基因，而黄酮醇合成酶是由六个拷贝的基因编码，其中两个可能并不表达I l5 1 。 拟南芥中，由于一些基因的突变，造成了种皮中色素含量减少，种皮呈现出透明或半透明， 这种突变体被称为透明种皮突变体( 仃a m p a r e n tt e s t a ) 。在对这些突变体的研究中已经确认了 分散于基因组中大部分类黄酮生物合成途径的调控基因和结构基因。目前，已经明确功能的 刀基因已经由最初的1 2 个上升到2 2 个。通过对仃基因的研究，黄色和棕色种皮的种子得以育 成，而这对于油菜的育种是有重要意义的；除了对种皮色泽的育种以外，刀基因还间接的影 响到降低植物种子休眠。转座子标签技术也被用于分离类黄酮生物合成途径中的关键基因。 在目前对类黄酮类化合物大多数结构基因和少量调控基因的研究都是以拟南芥的特异突变体 作为模式植物。虽然拟南芥中类黄酮合成途径可能有别于其他植物( 比如在抗性和雄性育性 方面) ，但是在拟南芥中研究类黄酮类化合物对紫外线防护和生长素转运调控机理具有重要的 作用【1 “2 2 1 。 1 2 花青素的种类、功能及理化性质 花青素是植物体内主要的类黄酮类水溶性色素，也可溶于甲醇、乙醇和丙酮等极性溶剂 中，不溶或微溶于非极性溶剂中。花青素因可强烈吸收可见光而区别于其他类黄酮类化合物， 在紫外可见光谱区( 2 0 0 , 7 0 0 n t o ) ，花青素的盐酸甲醇溶液在5 0 0 5 5 0 n m 处有其特征吸收峰【2 3 2 4 1 。 主要积累在花瓣或叶片表皮细胞的液泡内，通过积累不同种类的花青素从而控制花色和叶色。 花青素因取代基种类和位置的不同形成了不同颜色，花青素从结构上可以大致分为三类：天 竺葵素p e l a 唱o n i d i n 、矢车菊素c y a n i d i n 和飞燕草素d e l p h i n i d i n 。另外，从矢车菊素和飞燕草素 衍生出芍药花色素p e o n i d i n 、锦葵素p e n m i d i n 和碧冬茄素m a l V i d i n 等花青素矧。由于花青素的吡 喃环上的氧是4 价的，具有碱性，而本身的酚基又呈现出酸性，因此，花青素可以和酸、碱形 成盐。 3 两南大学硕十学位论文 R 4 图卜2 花青素母基团( 2 一苯基苯并阳离子) R 1 和R 2 取代基为H ，0 H 或O C H 3 ：R 3 取代基为糖基或H ：R 4 为0 H 或糖基 F i g 1 2T h ef I a v y Ii u mc a t i o n R 1a n d R 2a r eH O HO rO C H 3 ；R 3iSag l y c o s y Io rH ：a n dR 4isO Ho r ag ly c o s y l 【2 6 】 o C H 3 O c H 3 o H O H O c H 3 O H O C H 3 M a l v 门i n 图1 - 3 常见六种花青素结构幢7 1 F i g 1 3T h ec o m m o nS i Xa n t h o c y a n i n s 在花青素溶液中，花青素会随着溶液p H 值的变化而出现构象变化，在一个固定的p H 之下， 花青素出现四种结构互换平衡，如图1 3 ，非酰基化和酰基化的花青素在p H 较低时呈现红色， 随着p H 的增大，花青素红色变淡，在p H 达到最大时变成蓝紫色。但是具有两个以上酰基的花 4 早少 ，早矿艮 + 、 O r 0 笼1 第一章文献综述 青素在p H 改变过程中都表现出很好的稳定性。 表1 - 1 自然界常见的花青素 T a b 1 1N a t u r aIIyO C C U F rin ga n t h o c y a nin s 表卜2 植物中花青素的功鲥2 羽 T a b 1 - 2T h er o I eo fa n t h o c y a n i n si nD I a n t s 花青素的热稳定性与其结构、溶液酸碱性及所在体系的其他成分有关。花青苷糖苷配基 的羟基化导致花青苷的稳定性降低，但是糖基化等修饰可以使其稳定性得以增强。在图l - 4 中 的四种构象中，加热会使花青素向无色查尔酮移动 2 9 】。 光照一方面有利于花青素的生物合成，另一方面也会导致花青素的降解。在光照条件下， 酰基化的花青素比非酰基化花青素更稳定。花青苷形成缩合单宁( c o n d e n s e dt a n n i n ) 后也会提 高或降低花青苷的稳定性【3 们。 5 两南大学硕士学1 _ 7 ：论文 R R R H K 2 H O o H R 2 + H 非 R 3 2 图1 - 4 花青素结构转化 F i g 1 - 4T h ec o n v e r s i o no fs t r u c t u r ei na n t h o c y a n i n 在花青素的呈色过程中，辅色素( c o p i g m e n t ) 也起到了极其重要的作用，在自然界中， 这些增强花青素着色能力的辅色素通常是由黄酮类化合物、氨基酸和某些特异的核苷酸组成。 此外，花青素本身也可作为其他花青素的辅色素。对于天然的花青苷，辅色素的呈色机理主 要是使花青苷的最大吸收波长向长波方向移动，可见光吸收增强。辅色素在花青素成色过程 中受到很多因素的影响，其中最重要的还是p H 值的影响【3 1 j 。 1 3 花青素在食品工业上的应用 食用色素是用于食品着色或改善食品色泽的添加剂，大致可以分为天然色素和合成色素 两类。天然色素是从自然界动植物组织内提取的色素。近年来，随着对合成色素安全性的研 究，很多对人体健康有潜在威胁的合成色素受到大量的关注，有的合成色素还具有很强的致 癌性，因此，许多合成色素己不能作为食品添加剂使用，这样使得可用的合成色素数量屈指 可数。花青素作为一种安全的天然色素，除了具有类黄酮类化合物促进传粉、增强抗性的共 性以外，还是目前发现的最有效的自由基清除剂，在动物实验中已发现花青素具有抗氧化衰 老、抗突变、抑制癌细胞和减轻动脉硬化的功效。因此，花青素作为食品添加剂应用具有较 高的安全性。在一定理化条件的控制下，花青素着色自然，使用范围较广，同时还有一定的 保健作用。由于花青素的着色能力及其对光温等物理条件的耐受力较差，加之提取成本和价 格较高，因此，花青素作为食品添加剂的推广受到了一定的限制。但是随着合成色素禁止使 用范围的扩大以及人们对食品安全性的考量，天然色素的需求现在逐年增长【3 2 。”J 。总之，花 青素在园艺产品色泽育种、医药和食品添加剂等方面应该具有一定的应用前景和研究的价值。 6 第一章文献综述 1 4 影响花青素合成和积累的主要外在因素 1 4 1 生态因素 传粉者的影响不同生态环境出现不同的花色主要是该地区最活跃的传粉者造成的。同一 种植物在不同的地区会因为不同的传粉者的活动而表现出不同的色彩。同一种植物在迁移到 不同地区之后也可能发生花色或叶色的改变以适应当地环境，某些植物反应极快，比如美国 亚利桑那州花葱科l p o m p s i sa g g r e g a t a 的花色从红色变成粉红色，最后变成白色，是因为适应偏 好白色的白线天蛾H y l e sl i n e a t a 其传粉【3 6 1 。 真菌侵染和机械损伤这两种刺激可以诱导某些植物查尔酮合成酶的表达，最终提高类黄 酮类化合物的含量，以达到抗病的目的【3 7 4 2 1 。 1 4 2 物理因素 光照光强、光质和光周期直接影响到花青素合成和积累。弱光使花青素的合成渐弱，充 足的光照强度促使固有花色的形成，但是过于强烈的光照也会破坏花青素的稳定性。光通过 光合作用为花青素的合成提供物质基础，并调节花青营生物合成途径中关键酶的活性。类黄 酮的合成也只有在光下才能正常进行。各种光都可以促使花青素的合成，但是蓝光和红光最 有效，绿光的效果最差，并且绿光还可能导致叶绿体产生大量自由基损坏光合系统。紫外光 也参与了矮牵牛P A L 和a 器基因的表达1 4 3 4 9 】。 温度低温诱导花青素的合成是植物抵御低温的主动保护机制。花青素的生物合成与抗冻 性具有一致性，在对几种低温敏感的拟南芥突变体的研究发现，在低温条件下，这些突变体 均不能形成花青苷。许多植物在秋季温度降低之后产生大量花青素，随着温度进一步降低， 植物中可溶性糖含量增加，花青素糖基化水平提高，形成更加稳定的花青苷，以抵抗冬季低 温伤害。植物液泡中大量汇集的可溶性有机物质可以降低水势，使冰点降低，防止低温条件 下冰晶的形成，特别是表皮细胞中积累的花青苷可以防止表皮细胞受到损伤，从而保护落叶 植物免收霜冻的伤害【5 0 5 2 1 。 水分渗透胁迫可以诱导花青素的生成，含有花青素的植物组织能够抵抗干旱胁迫。研究 发现紫胡椒比绿胡椒更能耐受渗透胁迫；干旱复苏植物在脱水期间比水分充足时多积累3 - 4 倍 的花青素，最终显现出极强的脱水能力。干旱条件下，花青素大量积累，提高抗旱能力，同 时有助于削弱U V - B 对植物的损伤。干旱能导致植物缺磷，磷元素的缺乏也会造成花青素的积 累，因此在缺磷植株的茎表皮都有紫色的花青素积累。花青素在植物表皮的积累，能改变细 胞水势，从而调节蒸腾作用，最终提到植物的抗旱能力【5 3 铘】。 1 4 3 化学因素 影响花青素合成和积累的化学因素主要有矿质营养和糖类的影响。矿质离子主要通过与 7 西南大学硕十学位论文 特定的花青素发生螯合而改变植物颜色；另外，光质离子也通过影响花青素的代谢而改变花 色。糖类是花青苷的组成成分之一，也是调控花青苷合成的重要信号分子【5 7 柳】，植物液泡中 蔗糖的含量决定了花青苷的总量【6 8 1 。 1 5 花青素生物合成途径及其相关研究 花青素代谢是类黄酮代谢途径的一个重要分支，目前其调控机理已经有了较为全面的研 究。花青素是在细胞质中从苯丙氨酸开始经一系列的酶促反应合成，经不同的羟基化、糖基 化、甲基化和酰基化的修饰后被转运到液泡中，通常分布于花瓣和叶片的表皮细胞内。植物 体内的酶是基因转录翻译的产物。根据是否有转录功能，可把基因分为三类：第一类是编码 蛋白质的基因，这类基因具有转录和翻译功能，包括编码酶和结构蛋白的结构基因，以及编 码阻遏蛋白的调节基因；第二类只有转录功能而没有翻译功能的转运R N A 基因和核蛋白体基 因；第三类是不转录的基因，这类基因对基因表达起调节控制的作用，包括启动基因和操纵 基因【6 9 】。 近年来对于植物花青素合成途径及其生理生化机制已有较为深入的研究，参与花青素生 物合成的关键酶和相关基因都已分离和克隆，一些花青素生物合成下游基因的转录因子也得 到了大量的研究p 0 7 2 1 。 花青素合成的酶促反应中几乎所有基因都有较深入的研究，这些基因大致可以分为两类， 第一类是植物共同具有的结构基因，直接编码花青素生物合成途径中生物合成酶类；第二类 是调控结构基因活性、色素空间时间积累的调节基因。根据基因在合成途径中的位置，又可 将结构基因分为上游基因( P A L 、C H S 、C H I 、乃斫u F 3H ) 下游基因( D F R 、刎晒和U F G T ) 。 1 5 1 结构基因 结构基因是指不同植物共同具有的直接编码花青素代谢途径关键酶的基因。现在利用转 座子标签、消减杂交等方法，在矮牵牛等模式植物上以克隆出了多个与花青素生物合成相关 的结构基因，如图1 5 所示，从合成起点开始主要有P A L 、C H S 、C H I , F 3 H 、F 3 曰、D F R 、A N S 、 啪礴。 苯丙氨酸解氨酶( 以L ) 苯丙氨酸解氨酶是次生代谢途径中研究较多的酶。在类黄酮类化合物合成途径中它催化 苯丙氨酸形成肉桂酸，进而在查尔酮异构酶的催化下与丙二酰C o A 形成查尔酮。在某些植物中 以单拷贝基因存在，在另一些植物中以多拷贝形式存在。P A L 的可通过逆境诱导，比如菜豆中 鲥工l 和g P A L 2 都能被真菌细胞壁诱导。在对g T A Z , 2 的转基因研究表明卿工2 仅在花瓣粉红区域 内表达【7 4 1 。除了花青素的形成需要朋上的催化，木质素的形成也是有P A L 催化的反应开始的。 在对植物次生代谢途径的研究发现，P A L 代谢途径是大多数次生代谢所共有的。 8 第一章文献综述 查尔酮合成酶( 删S ) C H S 是花青素生物合成途径中第一个关键酶，最早是在P e t r o s e l i u mh o r t e n s e 中分离得到 7 5 - 7 6 。其功能主要是催化上游4 香豆酰C o A 与丙二酰C o A 形成查尔酮，形成的查尔酮提供了类 黄酮的基本骨架构成。因此，删S 是类黄酮类化合物的合成关键酶之一，在C j 峪催化下产生的 查尔酮可被查尔酮异构酶( C H l ) 催化形成黄烷酮，在没有c J W 的条件下则会产生外消旋黄烷酮。 不同物种间a w 基因具有较高的同源性，通过构建C J 弼基因系统发育树显示他们可能有着共同 的起源。但是不同植物d W 基因在功能上存在着明显的差异，其在不同品系之间活性也有所不 同。在对C H S 启动子进行功能分析研究发现一些反式作用元件，比如光反应元件H 框和G 框。 由于这些反式作用元件与转录因子之间的相互作用决定了C 聪因对环境因素反应过程中的 复杂表达方式。C 月S 的表达可以被真菌、机械损伤和紫外光诱导【7 7 1 。在a 嚣基因转矮牵牛植株 中，某些转基因植株的外源基因与内源基因一起发生了共抑制现象，导致花色产生杂色或白 色，并没有预想中色彩的增强效果【7 8 】。 查尔酮异构酶( r ) 化查尔酮形成黄烷酮，是类黄酮代谢途径中生成的第一个类黄酮产物。瞅有不 同的底